Активация T-клеток приводит к экспрессии многих ингибиторных рецепторов, таких как белок программированной клеточной смерти 1 (PD-1), или цитотоксический T-лимфоцит-ассоциированный антиген 4 (CTLA-4). За счет этих сигнальных путей осуществляется контроль иммунного ответа, а в опухоли может разыгрываться сценарий иммуносупрессии. Несмотря на широкое внедрение ингибиторов иммунных контрольных точек (ИИКТ) в клиническую практику, точные молекулярные механизмы действия ингибиторов PD-1 и оказываемые за счет них эффекты на иммунные клетки до конца не изучены. Хорошо известно, что анти-PD-1-антитела действуют в микроокружении опухоли. Показано, что анти-PD-1-антитела способствуют экспансии и дифференцировке стволовых TCF-1+ PD-1+ CD8⁺ T-клеток, которые обеспечивают противоопухолевые эффекты иммунного ответа [1]. Ожидается, что эти клетки могут оказывать влияние на опухоль, уничтожая ее или контролируя рост и метастазирование [2]. Исследования при моделировании рака желудка у животных показали, что комбинированное воздействие анти-PD-1-антитела и мультикиназного ингибитора приводит к увеличению уровня CD8⁺ T-клеток в опухолевых тканях [3]. Также было показано, что анти-PD-1-антитела способствуют появлению новых клонотипов опухолеспецифических CD8⁺ T-клеток в доклинических моделях [4]. Интересно, что последние данные свидетельствуют, что анти-PD-1-терапия может действовать не только в сайте первичной опухоли, но и проявлять дополнительную активность в периферических иммунных органах [5]. Недавняя работа M. Ruggiu и соавт. [6] показала, что анти-PD-1-антитела были направлены в первую очередь не на CD8⁺ T-клетки, а стимулировали выработку IL-4 Tfh-лимфоцитами основной популяции, с которой связывались анти-PD-1-антитела в периферическом лимфатическом узле. Влияние иммунотерапии на микроокружение рака желудка у человека в настоящий момент не изучено. Безусловно, именно анализ образцов опухоли до и после лечения может быть более ценным, поэтому, учитывая важную роль иммунного микроокружения в прогнозировании эффекта терапии ИИКТ, в настоящем исследовании мы впервые оценили влияние комбинированной терапии с использованием ингибитора PD-1 на состав иммунного микроокружения не в модельной системе, а у пациентов с карциномой желудка.

Цель исследования — оценить влияние комбинированной анти-PD-1-иммунотерапии на клеточный состав опухолевого микроокружения у пациентов с карциномой желудка.

Материал и методы

В исследование были включены 9 пациентов (5 мужчин и 4 женщины, средний возраст 61,0±8,44 года) с морфологически верифицированным диагнозом рака желудка стадии T2-4N0-1M0. Диагноз аденокарциномы устанавливали на основании исследования гастробиоптатов согласно критериям классификации ВОЗ (WHO Classification of Tumours of the Digestive System, 5th ed., IARC Press, 2019). Из 9 пациентов 6 имели аденокарциномы высокой степени дифференцировки (grade 1), а 3 пациента — низкодифференцированные аденокарциномы (high grade, grade 3). Клиническое стадирование проводили в соответствии с 8-м изданием классификации AJCC/TNM. Всем пациентам выполнено комплексное обследование, включающее первичную диагностику, определение стадирования и PD-L1-статуса. Оценку экспрессии PD-L1 проводили иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител (Dako, clone 22C3 pharmDx). В исследование включали пациентов с комбинированным положительным счетом (CPS) более 1. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом. От всех пациентов было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Схема лечения

Предоперационное лечение включало 8 курсов полихимиотерапии по схеме FLOT, состоящей из доцетаксела (50 мг/м²) внутривенно, оксалиплатина (85 мг/м²) внутривенно в виде 2-часовой инфузии, лейковорина (200 мг/м²) внутривенно в виде 2-часовой инфузии и 5-фторурацила (2600 мг/м²) в течение 48-часовой инфузии. Интервал между курсами составлял 14 дней. Дополнительно проводили иммунотерапию пембролизумабом в дозе 400 мг каждые 6 нед. Оценку эффективности терапии осуществляли через 4 нед после начала лечения и непосредственно перед операцией. Серьезных побочных эффектов, требующих отмены терапии, не наблюдалось.

Хирургическое лечение и патоморфологическое исследование

Оперативное вмешательство выполняли через 4 нед после завершения предоперационной терапии. Гастрэктомия была произведена у 6 пациентов (66,7% случаев). В послеоперационном периоде пациентов выписывали на 7—10-е сутки. Зарегистрирован один летальный исход в раннем послеоперационном периоде вследствие перфорации язвы толстой кишки с развитием перитонита.

Операционный материал подвергали комплексному морфологическому исследованию. Образцы фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине с последующей стандартной гистологической обработкой и заливкой в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. При микроскопическом исследовании оценивали степень дифференцировки опухоли, наличие периневральной и лимфоваскулярной инвазии, а также проводили сопоставление данных предоперационных биопсий с характеристиками резецированного материала. Морфологическую оценку проводили согласно критериям классификации ВОЗ (WHO Classification of Tumours of the Digestive System, 5th ed., IARC Press, 2019).

Многоцветная иммунофлюоресценция

Для проведения многоцветной TSA-модифицированной (tyramide signal amplification)иммунофлюоресценции использовали первичные антитела к CD8 (Ventana, clone SP57, 1:10), PD-1 (ABclonal, clone AMC0439, 1:500), CD20 (Leica Biosystems, clone L26, 1:600), CD163 (Diagnostic Biosystems, clone 10D6, 1:150), FoxP3 (Invitrogen, clone 236A/E7, 1:800), систему детекции EnVision FLEX/HRP (Dako) и набор тирамидов, конъюгированных с флюоресцентными метками Opal 7-color Fluorophore Kit (Akoya Biosciences). Методику проводили с применением автоматического иммуногистостейнера BOND RXm (Leica, Германия), она включала предварительную демаскировку ткани в буфере Epitope Retrieval Solution 2 (Leica Biosystems) в течение 20 мин при температуре 98,5°C и 5 циклов окрашивания. Каждый цикл окрашивания включал следующие этапы: нанесение EnVision FLEX Peroxidase-blocking reagent (Dako) (инкубация в течение 10 мин), Novocastra Protein block (Leica Biosystems) (10 мин), первичного антитела (30 мин), EnVision FLEX / HRP (30 мин), Opal (20 мин) и демаскировку в буфере Epitope Retrieval Solution 2. Ядра клеток были окрашены вручную с помощью Fluoroshield with DAPI (Sigma-Aldrich, США). Изображения получены с помощью системы Vectra 3.0 (Akoya Biosciences, США), клетки подсчитаны с использованием программного обеспечения inForm (Akoya Biosciences, США) в 7 репрезентативных областях среза ткани. Количество CD8⁺ цитотоксических лимфоцитов, CD20⁺ B-лимфоцитов, CD163⁺-макрофагов и FoxP3⁺-лимфоцитов было оценено в опухолевой ткани больных раком желудка, полученной до и после комбинированной анти-PD-1-иммунотерапии. Количественные данные представлены в процентах от всех клеток стромы опухоли.

Статистический анализ результатов

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Prism 10 (GraphPad, США). Количественные данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха Me (Q1-Q3). Оценка различий количественных признаков проведена с помощью критерия Вилкоксона для зависимых переменных. Различия считали достоверными при значении p <0,05.

Результаты

Опухолевое микроокружение рака желудка до начала химиоиммунотерапии было представлено различными субпопуляциями лимфоцитов и макрофагов (рис. 1). Показано, что на фоне терапии анти-PD-1-антителами происходит достоверное повышение количества CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов (3,18 (0,49—5,14) % против 6,23 (3,91—9,21)%; p=0,0391). Количество CD20⁺-B-лимфоцитов (0,79 (0,36—1,78) %, CD163⁺-макрофагов (3,53 (3,32—7,80)% и FoxP3⁺-лимфоцитов (4,21 (2,11—5,35)% не изменилось после проведения терапии анти-PD-1-антителами (1,12 (0,49—3,92)%, 6,63 (5,39—9,83)% и 2,71 (1,28—4,16)% соответственно; p>0,05) (рис. 2).

Рис. 1. Иммунофлюоресцентное окрашивание ткани рака желудка до и после проведения химиоиммунотерапии.

Многоцветная иммунофлюоресценция, ×400.

Рис. 2. Доля CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов, CD20⁺-B-лимфоцитов, CD163⁺-макрофагов и FoxP3⁺-лимфоцитов в ткани рака желудка до и после проведения комбинированной анти-PD-1-иммунотерапии.

Также было подсчитано соотношение ключевых клеточных популяций, относящихся к разным типам иммуновоспалительных реакций (рис. 3). Не обнаружено различий соотношения CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов и CD20⁺-B-лимфоцитов (2,93 (0,79—6,74) отн. ед. до терапии против 5,52 (1,78—18,19) отн. ед. после терапии; p>0,05). В свою очередь, соотношение CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов и FoxP3⁺-лимфоцитов существенно увеличивалось на фоне проведения комбинированной анти-PD-1-иммунотерапии (0,69 (0,29—1,04) отн. ед. до терапии против 3,22 (1,31—4,89) отн. ед. после терапии; p=0,0039).

Рис. 3. Соотношение CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов и CD20⁺-B-лимфоцитов, а также CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов и FoxP3⁺-лимфоцитов в ткани рака желудка до и после проведения комбинированной анти-PD-1-иммунотерапии.

Рис. 4. Доля CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов, CD20⁺-B-лимфоцитов, CD163⁺ макрофагов и FoxP3⁺-лимфоцитов, экспрессирующих PD-1, в ткани рака желудка до и после проведения комбинированной анти-PD-1-иммунотерапии.

Обнаруженные изменения количества CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов на фоне комбинированной анти-PD-1-иммунотерапии наиболее сильно проявились в субпопуляции, экспрессирующей PD-1. Было обнаружено достоверное повышение количества CD8⁺- PD1⁺-цитотоксических лимфоцитов после терапии по сравнению со значениями до терапии (0,00 (0,00—0,04)% против 0,22 (0,02—0,46)%; p=0,0156). Количество PD-1-экспрессирующих клеток остальных популяций не изменялось при проведении химиоиммунотерапии (p>0,05).

Мы оценили также связь иммунологических показателей у пациентов с клинико-патологическими параметрами. Была обнаружена ассоциация доли CD20⁺-B-лимфоцитов с полом пациентов. Достоверно меньшее количество клеток данной популяции до начала химиоиммунотерапии было обнаружено у пациентов мужского пола 0,56 (0,15—0,70)% против 1,78 (1,03—5,10)% у женского, p=0,0159. Кроме того, соотношение CD8/Foxp3 после проведенной химиоиммунотерапии было повышено у пациентов с pT2-3 по сравнению с лицами, имевшими pT0-1 (4,89 (4,31—5,74) отн. ед. против 1,49 (1,09—2,46) отн. ед.; p=0,0159). Ассоциации изучаемых иммунологических параметров с возрастом, cT, cN, pN, CPS не выявлено. Медиана наблюдения за пациентами к моменту анализа представленных результатов составляла 36 (9—42) мес. За данный период наблюдения ни у одного пациента не зафиксировано прогрессии заболевания или смерти. В этой связи COX-регрессионный анализ, который позволяет оценить связь иммунологических параметров с клиническими исходами у пациентов с раком желудка, получавших комбинированную анти-PD-1-иммунотерапию, не проводился.

Обсуждение

Выполненное исследование впервые позволило в образцах рака желудка, полученных от пациентов, изучить изменения состава опухолевого микроокружения на фоне проведения комбинированной анти-PD-1-иммунотерапии. Множество предыдущих исследований показало, что более высокая плотность TIL, в частности CD8⁺-цитотоксических T-лимфоцитов, ассоциировалась с лучшим исходом у пациентов с раком желудка [7]. В нашем исследовании только количество CD8-позитивных цитотоксических T-клеток изменялось в ответ на химиоиммунотерапию, причем среди них с большей статистической значимостью встречались PD-1-позитивные клетки. Существуют данные, свидетельствующие, что периферические PD-1+CD8⁺ T-клетки памяти являются ведущим подмножеством среди CD8⁺ лимфоцитов, экспрессирующих PD-1 в периферической крови [8]. Появляющиеся исследования подтверждают критическую роль неоантигенов в ответе на терапевтическую блокаду PD-1. Например, подчеркивается, что неоантигенспецифические CD8⁺-T-клеточные ответы были параллельны регрессии опухоли у пациентов с немелкоклеточным раком легкого, получавших пембролизумаб [9], что указывает на то, что анти-PD-1-терапия усиливает противоопухолевый неоантигенспецифический T-клеточный ответ, который завершается появлением T-клеток памяти. Все это может косвенно свидетельствовать о накоплении в ткани опухоли CD8⁺-лимфоцитов памяти на фоне проводимой комбинированной анти-PD-1-иммунотерапии. Кроме того, наши данные также подтверждают результаты механистических исследований, говорящих о том, что блокада взаимодействий PD-1/PD-L1 может в определенной степени восстановить функции истощенных T-клеток с высокой экспрессией PD-1 и привести к усилению противоопухолевого иммунитета [10]. Наши данные указывают на перспективность расширения анализа CD8⁺- PD-1-лимфоцитов с уточнением их функционального состояния, что позволит изучить механизмы резистентности к иммунотерапии при раке желудка.

Полученные в нашей работе результаты позволяют рассуждать о еще одном возможном механизме влияния иммунотерапии на состав опухолевого микроокружения. Известно, что воздействие анти-PD-1-антител приводит к реактивации синтеза цитокинов. Именно цитокиновый репертуар микроокружения может контролировать баланс Th1- и Th2-иммуновоспалительных реакций. Известно, что цитотоксические лимфоциты имеют негативные перекрестные связи с иммуносупрессорными клетками, включая опухолеассоциированные фибробласты, регуляторные T-клетки (FoxP3⁺-лимфоциты) и проопухолевые M2-макрофаги. В нашем исследовании оценка соотношения CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов и CD20⁺-B-лимфоцитов, а также соотношения CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов и FoxP3⁺-лимфоцитов позволила показать обратную зависимость между изменением количества CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов и FoxP3⁺-лимфоцитов, подчеркивая важность оценки баланса Th1- и Th2-иммуновоспалительных реакций в микроокружении опухоли. Сформулированная ранее концепция иммуновоспалительных реакций позволяет рассуждать о значении соотношения клеток в микроокружении. Повышение количества CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов может сдвигать баланс в сторону Th1-иммунного ответа и предотвращать промоцию опухолевого роста за счет антагонизма продукции Th2-цитокинов, которые могут стимулировать эпителиально-мезенхимальный переход, инвазию и метастазирование. Иными словами, ожидаемый эффект от действия анти-PD-1-терапии может быть опосредован не столько цитотоксическим действием на опухоль, что сопровождалось более высокой долей полной регрессии, сколько формированием микроокружения, не стимулирующего в опухолевых клетках агрессивные свойства.

Настоящее исследование не показало изменение количества M2- макрофагов, хотя известно, что при прямом ингибировании PD-1 в опухолеассоциированных макрофагах их фенотип сдвигается в сторону противоопухолевого профиля с более высокими уровнями TNF-α, iNOS и MHCII [11]. Это подчеркивает, что данные механистических исследований не всегда воспроизводятся при исследованиях у пациентов. Отсутствие влияния на количество макрофагов может быть обусловлено высокой пластичностью и имеющимися в организме человека резервами моноцитов, которые способны восполнять пул клеток, подвергшихся воздействию химиопрепаратов [12].

Проведенная работа оставляет несколько открытых вопросов. Исследование не охватывало популяции фибробластов и лимфоцитов врожденной иммунной системы, и в анализ не входили иные иммунные контрольные точки (CTLA-4, LAG-3). В литературе [13, 14] имеется малое число сведений, касающихся участия данных клеток и иммунных контрольных точек в непосредственной реализации эффектов анти-PD-1-терапии при раке желудка, однако существуют косвенные свидетельства их возможного участия. Безусловно, продолжение исследований в этом направлении позволит расширить фундаментальные представления о механизмах действия иммунотерапии.

Заключение

Настоящее исследование впервые продемонстрировало, что комбинированная анти-PD-1-иммунотерапия существенно изменяет клеточный состав опухолевого микроокружения у пациентов с карциномой желудка. Выявлено статистически значимое увеличение количества CD8⁺ цитотоксических T-лимфоцитов, особенно их PD-1-позитивной субпопуляции, что свидетельствует о восстановлении функций истощенных T-клеток и об активации противоопухолевого иммунного ответа. Существенное повышение соотношения клеток CD8⁺/FoxP3⁺ указывает на смещение иммунного баланса в сторону клеточного иммунитета и ослабление иммуносупрессивного воздействия регуляторных T-лимфоцитов. Полученные результаты подтверждают, что анти-PD-1-терапия не только воздействует непосредственно на опухолевые клетки, но и способствует формированию микросреды, менее благоприятной для прогрессии опухоли. При этом обнаруженное отсутствие значимых изменений в численности CD20⁺-B-лимфоцитов и CD163⁺-макрофагов подчеркивает специфичность эффекта терапии, направленного преимущественно на активацию клеточного иммунитета.

Необходимо отметить, что ограничения данного исследования, такие как небольшой размер выборки и отсутствие данных о клинических исходах, требуют дальнейшей валидации на более масштабной когорте пациентов. Перспективными направлениями дальнейших исследований являются детальное изучение функционального состояния CD8⁺-PD-1⁺-T-лимфоцитов, анализ влияния терапии на транскриптомный и протеомный профили опухолевых тканей, а также оценка взаимосвязи иммунных изменений с клиническими результатами лечения.

Таким образом, проведенное исследование подчеркивает потенциал анти-PD-1-терапии в ремоделировании опухолевого микроокружения при раке желудка и открывает новые возможности для оптимизации комбинированных лечебных стратегий, направленных на усиление противоопухолевого иммунного ответа.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 20-75-10033-П).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Таширева Л.А.

Сбор и обработка материала — Калинчук А.Ю., Лоос Д.М., Царенкова Е.А., Августинович А.В., Афанасьев С.Г.

Статистическая обработка данных — Таширева Л.А.

Написание текста — Таширева Л.А., Калинчук А.Ю

Редактирование — Вторушин С.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict s of interest.