Рак желудка (РЖ) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований во всем мире и чаще всего выявляется в Восточной Азии, а также Восточной Европе [1]. Несмотря на успехи в диагностике и лечении, РЖ остается на 5-м месте по распространенности в мире и занимает 5-ю позицию по смертности [1]. В последнее время активно изучаются многие прогностические факторы РЖ [2], в частности, феномен опухолевого почкования (tumor budding, TB), который, по данным литературы [3], предрасполагает к прогрессированию заболевания и неблагоприятному прогнозу. Феномен опухолевого почкования был впервые описан для колоректального рака [4], и в 2016 г. на Международной консенсусной конференции по феномену опухолевого почкования (International Tumour Budding Consensus Conference — ITBCC) был утвержден стандартизированный подход к методу определения ТВ в колоректальной карциноме [4]. Однако для РЖ до сих пор не определен оптимальный подход к оценке ТВ. Таким образом, существует необходимость выбора оптимального метода подсчета опухолевых почек для карцином желудка.

По данным анализа литературы, авторы наиболее активно применяют три метода для оценки феномена ТВ: H. Ueno, E. Karamitopolou и L. Wang. Метод H. Ueno [5] предполагает выбор одного поля зрения с максимально выраженным ТВ («hotspot») при окраске гематоксилином и эозином и подсчет опухолевых почек в этом поле с использованием объектива (об.) микроскопа ×20 (размер поля зрения 0,785 мм²). Метод E. Karamitopolou [6] заключается в применении иммуногистохимического окрашивания антителами к PanCK для идентификации опухолевых почек и оценки ТВ в 10 полях зрения при большом увеличении (об. ×40). L. Wang [7] предлагает использовать окраску гематоксилином и эозином и оценивать среднее количество опухолевых почек в 5 полях зрения с использованием об. ×20. Оценка ТВ в карциномах желудка описана в трех работах [8—10], в которых использовались различные методы подсчета количества опухолевых почек, однако сравнение данных методов на материале РЖ ранее не проводилось.

В литературе имеются отдельные публикации, анализирующие связь отдельных клинико-морфологических параметров РЖ с количеством опухолевых почек, однако они немногочисленны и противоречивы. При этом большинство исследователей [9—11] солидарны относительно перспективности использования подсчета ТВ в карциномах желудка.

Таким образом, цель нашей работы — оценка связи ТВ, определяемого тремя различными методами, с основными клинико-морфологическими характеристиками РЖ и выживаемостью, а также сравнение методов между собой и выбор наиболее оптимального метода оценки ТВ в карциномах желудка.

Материал и методы

В работе использован материал от 172 пациентов, оперированных по поводу РЖ. В исследование включены только аденокарциномы тубулярного строения, где в препаратах присутствовал инвазивный край опухоли. Подсчет ТВ проводился тремя методами:

— H. Ueno: окраска гематоксилином и эозином, оценка ТВ в зоне максимального почкования «hot spot» с использованием об. ×20;

— L.Wang: окраска гематоксилином и эозином, оценка ТВ в 5 зонах наибольшего почкования с использованием об. ×20 с вычислением среднего значения;

— E. Karamitopolou: иммуногистохимическая окраска с антителами к PanCK, оценка ТВ в 10 зонах наибольшего почкования с использованием об. ×40 и вычислением среднего значения.

Сравнение двух методов окрашивания продемонстрировано на рис.1.

Рис. 1. Инвазивный край опухолевой ткани, визуализируемый разными методами.

а — окраска гематоксилином и эозином, об. ×20; б — иммуногистохимическое окрашивание с антителами к PanCK, об. ×20.

В соответствии с рассматриваемыми методами изучались гистологические образцы, окрашенные рутинным методом с использованием гематоксилина и эозина, а также с применением антител к PanCK, где был визуализирован инвазивный край опухоли и подсчитаны опухолевые почки во всех случаях. На следующем этапе случаи были разделены на 2 группы: Bd1 включали менее 10 опухолевых почек и Bd2 — 10 опухолевых почек и более (рис. 2).

Рис. 2. Примеры инвазивного края опухоли с различной степенью опухолевого почкования.

а — область инвазивного края опухоли с низкой степенью опухолевого почкования; б — область инвазивного края опухоли с высокой степенью опухолевого почкования (стрелки). Окраска гематоксилином и эозином, об. ×20.

Было проведено сравнение образовавшихся подгрупп по основным клинико-морфологическим параметрам РЖ. Группы обозначены для метода H. Ueno как UBd1/UBd2, для метода L.Wang как WBd1/WBd2 и для метода E. Karamitopolou как KBd1/KBd2.

Данные по общей выживаемости получены для 144 пациентов. Анализ выживаемости проводился с использованием метода Каплана–Мейера. Для оценки предикторов выживаемости использовалась многофакторная регрессионная модель Кокса с алгоритмом пошагового включения Вальда.

Результаты

При анализе связи опухолевого почкования с клинико-морфологическими характеристиками РЖ для всех методов были рассмотрены основные клинико-морфологические характеристики. Описательные статистические данные внесены в табл. 1.

Таблица 1. Описательная статистика клинико-морфологических характеристик выборки пациентов с низкой и высокой степенью опухолевого почкования, определенной методами H. Ueno, L. Wang, E. Karamitopolou, в аденокарциноме желудка

В случаях, где были обнаружены опухолевые эмболы в просветах лимфатических и кровеносных сосудов, в значительной степени преобладала высокая степень опухолевого почкования. При использовании метода H. Ueno, в 75 (61%) и 110 (90%) случаях среди опухолей с низкой степенью ТВ не определялась лимфатическая и венозная инвазия соответственно. В опухолях с высокой степенью ТВ лимфатическая и венозная инвазия не выявлялась только в 22 (42%) и 36 (70%) случаях. При использовании других методов были получены схожие результаты (рис. 3).

Рис. 3. Столбчатые диаграммы для опухолевых эмболов в лимфатических (а—в) и кровеносных сосудах (г—е) в зависимости от степени опухолевого почкования, определенной методами H. Ueno, L. Wang, E. Karamitopolou.

Таким образом, установлено, что такие клинико-морфологические параметры, как 2-й и 4-й тип опухоли по R. Bormann, высокая степень злокачественности (high grade), промежуточный гистологический тип по P. Lauren, наличие перстневидных клеток и опухолевых эмболов в лимфатических и кровеносных сосудах, большая глубина инвазии новообразования, поражение регионарных лимфатических узлов, наличие отдаленных метастазов, а также более продвинутая клиническая стадия онкологического процесса, значимо коррелируют с высокой степенью опухолевого почкования, определенного любым из предложенных методов (p<0,05).

При анализе выживаемости пациентов были получены однозначные результаты: значительно больший процент выживших наблюдался в группе с ТВ низкой степени. Общая 5-летняя выживаемость больных в группе пациентов с опухолью желудка низкой степени ТВ значительно выше таковой в группе с высокой степенью опухолевого почкования (табл. 2). Медиана выживаемости в группе пациентов с низкой степенью ТВ составила 91/96/96 мес. В группе с высокой степенью ТВ медиана выживаемости составила всего 20/20/21 мес., что указывает на лучший прогноз в группе с низкой степенью опухолевого почкования.

Таблица 2. Статус выживаемости пациентов с низкой и высокой степенью ТВ, определенного методами H. Ueno/ L. Wang/E. Karamitopolou

При статистической обработке данных установлено, что степень опухолевого почкования, определенная любым из методов, значимо ассоциирована со статусом выживаемости пациентов (p=0,000/p=0,000/p=0,000). Для наглядной демонстрации выживаемости пациентов в зависимости от степени опухолевого почкования были построены кривые Каплана–Мейера (рис. 4).

Рис. 4. Кривые Каплана–Мейера для оценки выживаемости пациентов с карциномой желудка в зависимости от степени опухолевого почкования и схемы, кратко иллюстрирующие особенности подсчета опухолевого почкования методами H. Ueno (а, б), L. Wang (в, г), E. Karamitopolou (д, е).

Дополнительно был проведен многофакторный анализ выживаемости в регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса с алгоритмом пошагового включения Вальда, где и было установлено, что степень опухолевого почкования является значимым положительным независимым прогностическим признаком. При высокой степени опухолевого почкования, определенной методами H. Ueno, L. Wang, E. Karamitopolou, увеличивается риск летального исхода в 1,77, 2,12 и 1,81 раза соответственно, установленный любым из методов (p=0,03, p=0,01, p=0,02 соответственно). Также показано, что мужской пол сопряжен с увеличением риска летального исхода в 2,08, 1,96, 2,06 раза (p=0,01), увеличением количества пораженных лимфатических узлов в 1,50, 1,44, 1,48 раза (p<0,01), с наличием отдаленных метастазов в 2,61, 2,39, 2,53 раза (p=0,01) для каждого из методов соответственно (рис. 5).

Рис. 5. Регрессионная модель пропорциональных рисков Кокса для степени опухолевого почкования, определенной методами H. Ueno (а), L. Wang (б), E. Karamitopolou (в).

Таким образом, вне зависимости от выбранного метода подсчета опухолевых почек в РЖ статистически значимыми являются одни и те же клинико-морфологические формы. Показано, что ТВ является сильным негативным прогностическим фактором при РЖ. Хотя метод L. Wang имеет наибольшую отрицательную прогностическую ценность (RR=2,12), мы считаем, что следует использовать метод H. Ueno, поскольку он является наименее трудоемким.

Обсуждение

В данной работе исследовалась связь опухолевого почкования в РЖ, которое было оценено различными ранее разработанными методами, с его основными клинико-морфологическими характеристиками и выживаемостью, с последующим выявлением более оптимального метода определения ТВ.

Среди множества методик имеются различия в выборе области, в которой оценивается опухолевое почкование. В одном многоцентровом исследовании воспроизводимости почкования опухоли методы H. Ueno и L. Wang имели сопоставимую межнаблюдательную вариабельность (k=0,35 против 0,25) [12], что согласуется с данными, полученными в исследовании РЖ. В том же многоцентровом исследовании [12] авторы изучали и воспроизводимость оценок ТВ при окрашивании гематоксилином и эозином в сравнении с PanCK в выборке из 50 случаев колоректальной карциномы. Воспроизводимость в целом была одинаковой, и хотя окрашивание цитокератином увеличивало количество опухолевых почек (частично за счет обнаружения отдельных клеток в железах, разрушенных воспалительным инфильтратом), это не увеличивало вероятность расхождения между наблюдателями [12]. При исследовании аденокарцином желудка были получены схожие результаты.

Оценка опухолевого почкования как общего неблагоприятного прогностического фактора в когортах пациентов, перенесших резекцию желудка, была воспроизведена в трех исследованиях, в которых использовались различные методы оценки ТВ [8, 9, 11]. Выборку из 52 аденокарцином желудка кишечного типа оценивали с использованием количества почек в 10 полях зрения при об. ×20 при среднем количестве 1 почка и более на поле, которое считалось положительным для определения ТВ (63% случаев) [11]. ТВ высокой степени было достоверно связано с метастазированием в лимфатические узлы (p<0,001). Более крупную когорту [8] из 153 аденокарцином желудка кишечного типа оценивали с использованием среднего количества почек по меньшей мере в 3 полях зрения при об. ×40 в области максимального почкования с использованием окрашивания цитокератином. Пациенты были разделены на 2 группы: с ТВ низкой и высокой степени в соответствии со средним количеством опухолевых почек. ТВ высокой степени было достоверно связано со снижением общей выживаемости (ОР: 1,61, 1,12—2,41; p<0,01). Третье исследование [14] с когортой из 296 пациентов с любой Т-стадией аденокарциномы желудка показало снижение общей выживаемости (ОР: 2,260, 1,617—3,159) при ТВ высокой степени, однако в этом исследовании была объединена когорта аденокарциномы кишечного и диффузного типов, поэтому интерпретация их результатов затруднена из-за смешивающегося фактора заведомо плохого прогноза для аденокарциномы диффузного типа по сравнению с аденокарциномой кишечного типа.

Несмотря на разнообразие методик, обнаружено, что повышенная плотность опухолевых почек постоянно коррелирует с неблагоприятными признаками при РЖ, включая больший размер опухоли, низкую дифференцировку, диффузный подтип по P. Lauren, продвинутую стадию T, наличие метастазов в лимфатических узлах и отдаленных метастазов, лимфоваскулярной и периневральной инвазии [13]. Среди этих клинико-морфологических характеристик подтип по P. Lauren и метастазирование в лимфатические узлы могут иметь наиболее важное практическое значение. Что касается метастазирования в лимфатические узлы, важного фактора, определяющего выживаемость пациентов с РЖ, то почти во всех исследованиях изучалась его связь с ТВ и было продемонстрировано, что высокая степень способствует метастазированию в регионарные лимфатические узлы. В исследованиях D. Ulase и соавт. [14] и L. Szalai и соавт. [15] не только само метастазирование в лимфатические узлы, но и количество пораженных лимфатических узлов было значительно больше у пациентов с ТВ высокой степени.

Заключение

Все статистически значимые параметры ТВ высокой степени согласовывались с известными ранее факторами неблагоприятного прогноза. Вне зависимости от методов оценки степени опухолевого почкования показано, что ТВ является сильным негативным прогностическим фактором при РЖ. Несмотря на отсутствие значимых различий в методах подсчета ТВ, мы рекомендуем использовать метод H. Ueno ввиду его простоты и минимальных материальных затрат на исследование.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Данилова Н.В.

Сбор и обработка материала — Данилова Н.В., Сотникова Т.Н., Полушкина Т.В.

Статистическая обработка данных — Полушкина Т.В.

Написание текста — Полушкина Т.В.

Редактирование — Данилова Н.В., Сотникова Т.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.