Несмотря на большое разнообразие лекарственных препаратов с различным фармакологическим действием, достичь целевого внутриглазного давления (ВГД) только с помощью применения гипотензивной местной терапии не всегда удается. В связи с этим остается актуальным вопрос, связанный с разработкой и внедрением эффективных и одновременно щадящих технологий, в том числе лазерных, для снижения уровня ВГД.

Среди лазерных транссклеральных вмешательств на сегодняшний день наибольшее распространение получила классическая контактная диодная циклолазеркоагуляция, предполагающая использование непрерывного излучения диодного лазера (λ = 0,810 мкм). Данная операция служит методом выбора при терминальной болящей глаукоме [1] и предполагает деструкцию отростков цилиарного тела (ЦТ), в том числе разрушение двуслойного эпителия цилиарных отростков, участвующего в продукции внутриглазной жидкости (ВГЖ). Метод носит достаточно травматичный характер и нередко вызывает осложнения в виде иридоциклита, гипотонии, субатрофии глазного яблока [2]. В связи с этим данный метод лечения используют, как правило, при терминальных стадиях глаукомы и ее формах, резистентных к лечению.

В последнее время получают распространение более щадящие транссклеральные методы лазерного лечения, что дает возможность их применения на более ранних стадиях глаукомы. К таким методам относится микроимпульсная транссклеральная циклокоагуляция (мЦФК; λ = 0,81 мкм). Лазерные аппликации при мЦФК наносят на склеру в проекции плоской части ЦТ. Технология мЦФК доказала свою безопасность и эффективность, в том числе при лечении начальных стадий глаукомы. Щадящий характер воздействия связан, главным образом, с особенностями работы данного лазера, а именно — с микроимпульсным режимом работы, суть которого заключается в излучении повторяющихся импульсов с продолжительностью рабочего цикла 31,3% («on»-time, активная фаза). Основную часть (⅔) цикла («off»-time, неактивная фаза) составляет период охлаждения. Благодаря данной особенности работы лазера исключается перегрев ЦТ и окружающих его тканей, что позволяет сохранить последние абсолютно интактными [3]. Несмотря на доказанную эффективность и безопасность данного метода, до конца не изучен механизм снижения ВГД. Предполагается, что гипотензивный эффект после мЦФК связан с усилением увеосклерального оттока [4]. Положительный результат мЦФК связан с возможным влиянием лазерного излучения на мышечные волокна цилиарной мышцы, сокращение которой способствует расширению склерального синуса и увеличению расстояния между цилиарной мышцей и склерой, что в конечном итоге потенцирует увеосклеральный путь оттока ВГЖ [5]. К тому же считается, что при мЦФК лазерное излучение вызывает активацию внутриклеточных метаболических процессов в клетках пигментного слоя эпителия ЦТ, вызывая ремоделирование внеклеточного матрикса, в том числе за счет усиления синтеза определенных металлопротеиназ [3].

Точкой приложения для другой относительно новой транссклеральной технологии — лазерной активации гидропроницаемости склеры (ЛАГС) — также является область плоской части ЦТ [6—9]. Предполагается, что снижение ВГД после ЛАГС происходит за счет усиления транссклеральной фильтрации на фоне расширения интрасклеральных пор [10, 11]. Однако недостаточно изученным остается вопрос, являются ли лазериндуцированные изменения в склере (появление пор) следствием прямого влияния лазерного излучения, или они связаны с вторично опосредованным влиянием, вызванным локальным сокращением склеральных волокон в зоне воздействия.

До недавнего времени технология ЛАГС, впервые предложенная и апробированная в НИИ глазных болезней им. М.М. Краснова, применялась исключительно при терминальной стадии глаукомы. Технология ЛАГС предполагает использование импульсно-периодического излучения Er-glass волоконного лазера (λ = 1,56 мкм). Ранее предпринимались попытки использования данного вида излучения также и с рефракционной целью [12, 13]. Хорошая переносимость и практически отсутствие побочных эффектов объясняют необходимость проведения дальнейших исследований, которые позволили бы обосновать расширение показаний к применению ЛАГС при ранних стадиях глаукомы.

В настоящей работе предполагается проведение дополнительных морфологических исследований по дальнейшему изучению механизма действия ЛАГС и безопасности использования данной технологии в перспективе при более ранних стадиях глаукомы [14, 15]. Кроме того, проведение морфологических исследований после ЛАГС и мЦФК позволит расширить представление о наиболее вероятных механизмах снижения ВГД в сравнительном аспекте.

Цель исследования — провести сравнительный морфологический анализ глазных тканей после лазерного воздействия с использованием транссклеральных технологий последнего поколения — мЦФК и ЛАГС — в условиях анатомического эксперимента.

Материал и методы

В работе использовали диодный лазер с излучением на длине волны λ = 0,81 мкм в микроимпульсном режиме для мЦФК (прибор Cyclo G6 Glaucoma Laser System компании IRIDEX, США) и Er-glass волоконный лазер с импульсно-периодическим излучением на длине волны λ = 1,56 мкм для ЛАГС (прибор «ЛАХТА-МИЛОН», Россия).

Анатомический эксперимент с гистологическим исследованием полученных препаратов проводили на восьми цельных изолированных кадаверных глазах человека с сохранной герметичностью всех оболочек. Сохранение целостности глазных оболочек способствовало созданию условий, максимально приближенных к естественным, и позволяло в дальнейшем интерпретировать выявленные постлазерные изменения как полученные в обычных витальных условиях.

Аутопсийный материал получали post mortem не позднее 12 ч. Полученный материал не имел явных признаков общих хронических и офтальмологических заболеваний. Получение, обработка и утилизация данного материала выполнялись в соответствии с действующим законодательством Российской Федерации.

Лазерное воздействие выполняли по той же технологии, по которой мЦФК и ЛАГС проводятся в клинической практике. При мЦФК на наконечник зонда Micro Pulse Pars Plana Probe (MP3) наносили каплю глазного геля (декспантенол 5%), после чего устанавливали его перпендикулярно глазному яблоку в проекции плоской части ЦТ таким образом, чтобы край рабочей поверхности излучателя не переходил границу в области лимба. Наконечником излучателя осуществляли скольжение с небольшим давлением по дуге окружности длиной 180° в одной полусфере глазного яблока вдоль лимба. Мощность лазерного воздействия при этом составляла 2500 мВт, общее время лазерного воздействия — 40 с (20 с на «проход» в одну сторону полусферы по дуге окружности). Вторую полусферу сохраняли интактной в качестве контроля.

При проведении эксперимента с проведением ЛАГС лазерные аппликации наносили на склеру (в пределах одной полусферы) в проекции плоской части ЦТ в 3—4 мм от лимба на одинаковом расстоянии (1,5 мм) друг от друга в два ряда в шахматном порядке. Мощность лазерного излучения составляла 0,66 Вт. Во избежание эффекта перегревания тканей на каждую точку воздействовали в течение 3 с дважды с перерывом в 5 с. Указанные параметры лазерного излучения были отработаны экспериментальным путем и соответствовали значениям, ранее представленным в патенте [16]. Вторая полусфера оставалась интактной в качестве контроля.

После лазерного воздействия в течение 3—4 ч энуклеированные глаза фиксировали в холодном 2,5% растворе глутаральдегида, затем их препарировали, рассекая вдоль экватора с выделением корнеосклерального лоскута таким образом, чтобы поверхность была направлена перпендикулярно оболочкам глаза (поперечный срез) и перпендикулярно лимбу (радиальное направление). При этом срез проходил вдоль зоны воздействия. Полученные блоки в течение 5 мин промывали в физиологическом растворе, после чего фиксировали в холодном 2,5% растворе глутаральдегида в течение суток. Далее полученные блоки фиксировали в 1% растворе осмиевой кислоты (1 ч) с последующим обезвоживанием в спиртах возрастающей концентрации и помещением их в смесь эпоксидных смол эпон-аралдит. Полутонкие срезы получали с помощью ультратома LKB-IV (LKB, Швеция), после чего проводили их окрашивание с помощью метиленового синего и фуксина (полихромное окрашивание). Всего в рамках исследования было подготовлено 112 гистологических препаратов (36 — после лазерного воздействия при мЦФК, 44 — после проведения ЛАГС, 32 — контрольные интактные препараты). Серийные срезы исследовали с использованием стандартной световой микроскопии.

Результаты

Оценка структурных изменений в тканях глаза после проведения мЦФК. При обзорном увеличении сагиттальных срезов донорских глаз после лазерного облучения диодным лазером (λ = 0,810 мкм) в микроимпульсном режиме каких-либо заметных структурных изменений в склере выявлено не было. Гистологическая картина склеры в области воздействия на всех срезах свидетельствовала о том, что коллагеновые волокна не изменяли своего вида и сохраняли плотное прилегание друг к другу на всем протяжении (рис. 1).

Рис. 1. Гистологический препарат в зоне мЦФК.

Красными стрелками указана область лазерного облучения, желтыми стрелками — интактная отростчатая часть ЦТ. Полутонкий срез, полихромное окрашивание.

В области отростчатой части ЦТ после лазерного воздействия, так же как и на контрольных интактных срезах, значительных изменений не наблюдалось. Беспигментный слой эпителия цилиарных отростков сохранял относительную целостность, при этом отсутствовали явные признаки коагуляционного некроза и повреждений мышечных волокон ЦТ в средних и внутренних слоях.

Однако на всех срезах фиксировали изменения в области плоской части ЦТ в виде появления участков истонченного пигментного слоя эпителия, местами прерывистого (рис. 2). Вместе с тем на тех же препаратах отмечали локальное, ограниченное зоной воздействия увеличение промежутков между передними длинными соединительнотканными волокнами, фиксирующими ЦТ к склере, и расширение супрахориоидального пространства, что могло указывать на возможность потенцирования увеосклерального оттока и объяснять механизм гипотензивного эффекта после мЦФК.

Рис. 2. Гистологический препарат в зоне мЦФК.

Желтыми стрелками указан участок плоской части ЦТ с истонченным и прерывистым эпителием. Красными стрелками указано расширение пространств между передними длинными соединительнотканными волокнами. Полутонкий срез, полихромное окрашивание.

Область склерального синуса и трабекулярного переплета после мЦФК сохраняла свое исходное состояние: полностью проходимый канал и трабекулярный переплет с неизмененными межпластинчатыми пространствами выглядели интактными (рис. 3).

Рис. 3. Область трабекулярного переплета и склерального синуса после мЦФК сохраняет свое нативное строение.

Полутонкий срез, полихромное окрашивание.

Полученные данные соотносятся с общепринятыми на сегодняшний день представлениями о щадящем характере воздействия лазерного излучения в микроимпульсном режиме и отсутствии выраженного побочного коллатерального деструктивного влияния на соседние ткани глаза.

Оценка структурных изменений в тканях глаза после проведения ЛАГС. На гистологических срезах в области лазерных аппликаций (2—3 мм от лимба) после воздействия импульсно-периодическим излучением Er-glass волоконного лазера (λ = 1,56 мкм) визуализировались изменения в области конъюнктивы и склеры (рис. 4). На поперечном срезе склеры можно различить две зоны: более плотную внутреннюю, прилегающую к слабо пигментированной бурой пластинке, которая граничит с увеальным трактом, и расположенную ближе к глазной поверхности наружную зону со множественными щелевидными меридионально ориентированными пространствами. Последние являются результатом неполного расслоения последовательно расположенных в проекции лазерного излучения коллагеновых пучков, формирующих фиброзную ткань склеры. При этом отсутствует какая-либо выраженная реакция со стороны отростчатой и плоской частей ЦТ. При большом увеличении примерно четверть внутренней толщины склеры, прилежащей к слабо пигментированной бурой пластинке, приобретала компактный вид с плохо различимыми межволоконными пространствами, напоминая картину тепловой денатурации, сопровождающуюся местным обезвоживанием и «усадкой» ткани (рис. 5). Наружные слои склеры, напротив, пребывали в состоянии «фиссуризации» (от лат. fissura — щель) за счет появления щелевидных пространств и расширений (растяжений) межволоконных промежутков, небольшой отечности самих волокон и дилатации межволоконных сосудов, что придавало склере вид более светлой ткани по сравнению с окружающими зону лазерного воздействия участками. Супрахориоидальное пространство было неравномерно расширено.

Рис. 4. Гистологический препарат в зоне ЛАГС.

Четко различимы по плотности слои склеры: компактные внутренние (желтые стрелки), прилежащие к бурой пластинке, и наружные, более рыхлые за счет множественных щелевидных полостей (красные стрелки). Полутонкий срез, полихромное окрашивание.

Рис. 5. Склера в зоне проведения ЛАГС.

Желтыми стрелками обозначена граница участков компактного и разреженного расположения коллагеновых волокон. Зоны разрежения обусловлены участками частичного щелевидного расхождения соседних волокон. Волокна склеры отечные, сосуды между ними дилатированы. Полутонкий срез, полихромное окрашивание.

Зафиксированные после ЛАГС изменения в конъюнктиве характеризовались участками просветления, локального отека и умеренного изменения рельефа. Обращают на себя внимание дилатированные сосуды конъюнктивы на фоне умеренно расширенного субконъюнктивального пространства (рис. 6).

Рис. 6. Изменения в конъюнктиве после ЛАГС

Мелкодисперсная деструкция глубоких слоев конъюнктивы, локальный отек с выстоянием рельефа, дилатации сосудов. Малочисленная фиссуризация склеры затрагивает лишь наружную четверть ее толщи. Полутонкий срез, полихромное окрашивание.

На рис. 7 продемонстрированы эффект фиссуризации склеры в облученном участке (рис. 7, а) и его отсутствие в интактной (не подвергавшейся облучению) склере (рис. 7, б), а также в участках склеры, расположенных рядом с областью воздействия (рис. 7, в). Отсутствие деструктивных изменений в соседних с облучением участках склеры говорит об отсутствии побочного коллатерального действия ЛАГС на окружающие ткани.

Рис. 7. Патоморфологическая картина склеры кадаверного глаза.

а — склера в зоне лазерного воздействия (ЛАГС): при слабо выраженной бурой пластинке (желтая стрелка) внутренние слои склеры выглядят компактными (красные стрелки), отмечается расхождение соседних коллагеновых пучков с образованием узких меридиональных щелей с сохранными соединительными межфасцикулярными волокнами-перемычками внутри щелей (белые стрелки); б — интактная склера: склеральная ткань однородна, не содержит щелевидных полостей, коллагеновые пучки на всем протяжении плотно прилежат друг к другу кроме участков прохождения сосудисто-нервного пучка (красная стрелка); в — соседний с облучением участок склеры: изменений не выявлено, гистологическая картина практически соответствует интактной склере.

Отмечено, что эффект компактизации внутренних слоев собственно склеры зависит от пигментации самого внутреннего склерального слоя — бурой пластинки (lamina fusca sclerae), состоящей из истонченных волокон склеры с примесью эластической ткани и пигментосодержащих клеток. При слабопигментированной и тонкой бурой пластинке эффект компактизации внутренних слоев выражен слабее, чем при ее большей толщине и хорошо пигментированной организации. Также важно отметить относительную сохранность после ЛАГС межфасцикулярных коллагеновых волокон в участках, примыкающих к компактным слоям склеры. Указанные волокна выполняют роль перемычек, препятствующих значительному расхождению смежных коллагеновых пучков и образованию чрезмерно широких меридиональных щелей.

Результаты исследования наглядно доказывают, что проведение ЛАГС не сопровождается деструкцией отростков ЦТ: отсутствуют признаки воспалительной реакции, разрушения пигментного эпителия и мышечных волокон. При большом увеличении на гистологических срезах отмечается лишь частичная дезорганизация беспигментного слоя эпителия (рис. 8).

Рис. 8. ЦТ после ЛАГС.

Частичная дезорганизация беспигментного слоя цилиарного эпителия.

Обсуждение

Благодаря анатомическому эксперименту с проведением гистологических исследований удалось визуализировать картину острых постлазерных изменений, возникающих в тканях-мишенях после проведения мЦФК и ЛАГС. Полученная морфологическая картина позволила определить наиболее вероятные механизмы лазериндуцированного действия и степень безопасности рассматриваемых транссклеральных технологий.

При исследовании гистологических срезов в местах, подвергшихся лазерному воздействию излучением диодного лазера (λ = 0,81 мкм) в микроимпульсном режиме и импульсно-периодического Er-glass волоконного лазера (λ = 1,56 мкм), значимых деструктивных изменений в зонах непосредственного облучения и в участках тканей, примыкающих к нему, выявлено не было. Отсутствовали выраженная воспалительная реакция, явления коагуляционного некроза, не было отмечено значительной дезорганизации соединительной и мышечной тканей. Перечисленное доказывает атравматичный характер указанных лазерных вмешательств.

Наиболее вероятным механизмом снижения ВГД после мЦФК является усиление увеосклерального оттока за счет расширения супрахориоидального пространства, связанного с увеличением промежутков между передними длинными соединительнотканными волокнами, фиксирующими ЦТ к склере. Кроме того, важным проявлением, зафиксированным на всех гистологических срезах и характеризующим лазериндуцированные изменения после мЦФК, следует считать прерывистость и даже полную очаговую денудацию (от лат. denudatio — обнажение) цилиарного эпителия в области pars plana, играющего главную роль в своеобразном «крове-жидкостном» барьере глаза. Можно предположить, что в результате этого создаются условия для фистулизирующего эффекта в виде создания своеобразного дренажа ВГЖ через ЦТ в супрахроидальное пространство, способствующего усилению гидродинамики по увеосклеральному пути оттока и одновременно разгружающего трабекулярный путь.

Если говорить о влиянии излучения Er-glass волоконного лазера (λ = 1,56 мкм), то проведение настоящего исследования позволило выявить изменения, главным образом, в склере, а не в ЦТ после ЛАГС. Вследствие этого можно предположить, что решающая роль в механизме гипотензивного действия данного лазерного излучения — это усиление транссклеральной фильтрации. Эффект усиления гидропроницаемости склеры связан с лазериндуцированным локальным сокращением склеральных волокон и опосредованным расширением пор в склере. Проведенные после ЛАГС исследования показали, что основная часть склеры (собственно склера) в проекции лазерного воздействия подразделяется на внутренний (примерно четверть толщины), более компактный, и наружный, со множественными щелевидными пространствами, слои. При этом внутренние волокна собственно склеры после ЛАГС дегидратированы и находятся в состоянии контракции, но без явных признаков повреждения волокон. Уплотнение внутренних волокон является результатом тепловой денатурации внутренних коллагеновых пучков над пигментированной бурой пластинкой в участках трансформации энергии лазерного излучения в тепловую энергию. В результате создается натяжение со стороны денатурированной внутренней части склеры ее наружных слоев, что в итоге приводит к разрушению соединительных волокон между соседними коллагеновыми пучками и формированию интрасклеральных пор (см. рис. 6). Множественные поры имеют неправильную прерывистую форму в силу непараллельного расположения склеральных волокон. Таким образом, проведение ЛАГС обеспечивает избирательность лазерного излучения, ограничиваясь преимущественным воздействием на склеру и образуя в ней систему щелевидных полостей, что, вероятнее всего, облегчает фильтрацию ВГЖ.

Заключение

Выявленные в ходе нашего анатомического эксперимента структурные изменения глазных тканей, предположительно, могут указывать на возможность снижения ВГД после проведения мЦФК и ЛАГС, главным образом за счет потенцирования увеосклерального оттока. В первом случае гипотензивный эффект обусловлен расширением промежутков между передними соединительнотканными волокнами ЦТ в супрахориоидальном пространстве, во втором — с усилением транссклеральной фильтрации. Результаты настоящего исследования и доказанная безопасность указывают на перспективы использования современных транссклеральных лазерных технологий и расширение показаний для их применения на более ранних стадиях глаукомы.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Ю.Ю., А.Г., О.Б.

Сбор и обработка материала: А.Г., А.Ф., П.Г.

Написание текста: А.Г., А.Ф., П.Г.

Редактирование: А.Г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.