Выживаемость при увеальной меланоме: роль молекулярно-генетических факторов

Увеальная меланома (УМ) — наиболее распространенная первичная внутриглазная злокачественная опухоль во взрослой популяции [1, 2]. Отмечены также отдельные случаи развития УМ у детей и подростков [3, 4]. Около 50% больных с УМ умирают в результате метастатической болезни. Эта пропорция оставалась неизменной в течение всего прошлого столетия [5]. В 1996 г. G. Prescher и соавт. [6] выявили выраженную взаимосвязь между полной потерей (моносомией) хромосомы 3 в опухоли и смертью пациентов от метастатической болезни. В дальнейшем это было подтверждено другими исследователями вне зависимости от используемой методики генотипирования при определении статуса хромосомы 3 [7—11]. Удвоение хромосомы 8q усиливает прогрессирование опухоли при моносомии хромосомы 3, но не при дисомии хромосомы 3. В УМ хромосомные перестройки в коротком плече хромосомы 1 обнаруживаются примерно у трети пациентов и сходны по структуре с нарушениями, обнаруживаемыми в меланоме кожи [12]. Отмечено, что наличие перестроек в коротком плече хромосомы 1 в меланомах является признаком опухолевого прогрессирования. T. Häusler и соавт. [13] обнаружили статистически значимую (р=0,0001) корреляцию между делецией короткого плеча хромосомы 1 и моносомией 3.

В исследованиях, посвященных изучению профиля экспрессии генов (GEP), показано, что существует два разных класса УМ, ассоциирующихся со статусом хромосомы 3 и витальным прогнозом [14, 15]. Согласно данным L. Worley и соавт. [16], GEP можно рассматривать как более точный критерий при прогнозировании метастазов по сравнению с моносомией хромосомы 3 при его определении методом сравнительной геномной гибридизации или флюоресцентной гибридизации in situ. К одним из изучаемых генов относится RASSF1A, характерный для меланомы кожи. Метилирование RASSF1A показано и для клеточных линий УМ (91%), и в выборке из 39 первичных УМ с частотой 50% [17]. RASSF1A располагается в локусе p21.3 хромосомы 3, наиболее часто повреждаемой в клетках УМ, и является регулятором клеточного цикла; снижение его экспрессии нарушает контроль клеточного цикла в фазе G1/S, он является супрессором циклина D, гиперэкспрессия которого приводит к функциональной инактивации RВ, что вызывает прогрессирование УМ [18].

Выраженная ассоциация молекулярно-генетического профиля УМ с метастатической болезнью способствует развитию данного вида диагностики, и в ряде исследований показано, что большинство пациентов хотят знать риск развития у них метастазов вне зависимости от того, насколько эффективно и доступно их лечение [19—21]. К практической значимости молекулярно-генетических исследований следует отнести возможность проведения адъювантной терапии УМ, так как в такие исследования могут быть включены пациенты с высоким риском развития метастазов [19]. В связи со значимостью определения молекулярно-генетических аберраций для прогнозирования УМ нами была поставлена цель — проанализировать выживаемость группы пациентов с УМ и ее корреляцию с такими изменениями, как моносомия хромосомы 3, делеция короткого плеча хромосомы 1 и метилирование гена RASSF1A.

Характеристика клинического материала. Обследованы 104 пациента с УМ, пролеченных в период 2005—2007 гг. Возраст пациентов составил 22—84 года (в среднем 53,7±12,2 года). Женщин было 66 (63,4%), мужчин — 38 (36,6%). Срок наблюдения составил 41—84 мес (60,9±8,8 мес).

У 101 (97,1%) пациента проведена энуклеация, у 3 (2,9%) — по показаниям выполнена блокэксцизия опухоли. У 4 (3,9%) больных энуклеации предшествовало органосохраняющее лечение (курс брахитерапии с применением Ru/Rh офтальмоаппликаторов).

В зависимости от локализации выделяли меланому цилиохориоидальной зоны — 26 (25%) пациентов, хориоидеи — 67 (64,4%), радужки — 4 (3,85%) и иридоцилиохориоидальной зоны — 7 (6,7%) пациентов.

Образцы тканей. После энуклеации пораженного глаза биопсийный материал опухоли и относительно неповрежденной хориоидеи, а также образцы периферической крови (консервант — 0,5 М раствора ЭДТА) сохраняли при –20 °С. Для исследования образцов тонкоигольной аспирационной биопсии материал собирали с цитологических препаратов.

Геномную ДНК из образцов опухолей, условно интактной хориоидеи и периферической крови выделяли с помощью протеиназы К с последующей фенолхлороформной экстракцией. При выделении ДНК из цитологических препаратов собранный со стекла материал обрабатывали лизирующим буфером, содержащим протеиназу К, и полученный лизат использовали в качестве матрицы для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Потерю гетерозиготности в хромосомных районах 1p36, 1р31.3, 3p25.3, 3p21.3, 3p14.2, 3q12, 3q26.3, 3q28 идентифицировали с использованием высокополиморфных маркеров D1S243, D1S2145, D1S1635, D1S407, D1S3669, D1S438, D3S1038, D3S1317, D3S1568, D3S966, D3S1300, D3S1234, D3S2459, 16xTG_3q26.31, D3S3520, D3S2398. Контролем служила ДНК лейкоцитов периферической крови.

Для определения метилирования СpG-островков промоторных областей генов применяли метод метилчувствительной ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК из клеток УМ, предварительно гидролизованную рестриктазами HpaII (для гена RASSF1A).

Диспансеризация больных УМ. Диспансерное наблюдение осуществляли в соответствии с приказом № 135 Минздрава Р.Ф. от 19.04.1999 1 раз в 3 мес в течение первого года, затем один раз в 6 мес в течение второго года, в дальнейшем — 1 раз в год во взрослом консультативно-поликлиническом отделении МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца. Пациенты, которые по различным причинам не могли приехать на контрольный осмотр, сообщали о себе по телефону, факсу и через родственников путем передачи справок от онкологов и офтальмологов с места жительства. Часть данных получена путем запросов в департаменты здравоохранения по месту жительства пациентов.

Статистический анализ проводили с применением точного критерия Фишера и его значимости. Для исследования выживаемости пациентов после лечения использовали статистический метод множительных оценок Каплана—Мейера, а для оценки различия между двумя выборками — двухвыборочный критерий Уилкоксона (Манна—Уитни) и регрессионную модель Кокса. Для анализа полученной информации все наблюдения разделены на 2 типа: цензурированные (незавершенные), в которых исход не наступил на момент окончания исследования (пациенты живы) либо пациенты выбыли из исследования (в том числе смерть от других причин), и нецензурированные (завершенные), при которых зафиксирована смерть пациента от метастатической болезни. Расчеты проводили в пакетах программ для Windows (Microsoft Excel, Statistica 10.1).

В период с октября 2005 г. по ноябрь 2007 г. в отделе офтальмоонкологии и радиологии МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца проведена 101 энуклеация и 3 блок-эксцизии УМ с последующим патогистологическим и молекулярно-генетическим исследованием во всех изучаемых случаях. Долгосрочное наблюдение пациентов (5 лет и более) проведено во всех случаях. На основе результатов проведенного молекулярно-генетического анализа все пациенты разделены на 3 группы: 1-я группа — пациенты с моносомией хромосомы 3 (n=45, 43,3%), 2-я группа — с делецией короткого плеча хромосомы 1 (n=30, 28,8%) и 3-я группа — с метилированием гена RASSF1A (n=23, 22,1%). Группы сравнения составили пациенты без исследуемых аберраций. В 11,5% случаев (n=12) мы отмечали наличие у пациента как моносомии хромосомы 3, так и делеции короткого плеча хромосомы 1. В 5,8% случаев (n=6) выявлены одновременно моносомия хромосомы 3 и метилирование гена RASSF1A. Сочетание делеции короткого плеча хромосомы 1 и метилирования гена RASSF1A обнаружено у 9 (8,7%) из 104 исследуемых. Наконец, сочетание трех молекулярно-генетических аберраций выявлено у 2 (1,9%) пациентов. У 29 (27,9%) человек не выявлено ни одной из исследуемых аберраций.

Для каждой группы приведены клинические и патоморфологические характеристики (см. таблицу). Статистически значимые (p<0,05) ассоциации удалось выявить при сопоставлении пациентов из группы моносомии хромосомы 3 и гистологических типов опухоли, причем для данной группы характерно преобладание прогностически наименее благоприятных типов — смешаноклеточного и эпителиоидно-клеточного (77,8%). Анализ ассоциаций гистологических типов УМ с опухолями из групп 1p и RASSF1A не выявил значимых различий между типами У.М. Также в группе моносомии хромосомы 3 выявлена ассоциация с вовлечением цилиарного тела в опухолевый процесс, что расценивается как неблагоприятный фактор, ухудшающий витальный прогноз [22]. Так, в данной группе мы наблюдали больше половины (51,1%) пациентов с цилиохориоидальной и иридоцилиохориоидальной локализацией УМ, что представляется значимым по сравнению с группами 1p, RASSF1A, а также общей когортой пациентов, где преобладали новообразования хориоидальной локализации без вовлечения цилиарного тела (p=0,038). В группе пациентов с делецией короткого плеча хромосомы 1 выявлена значимая ассоциация с экстрабульбарным ростом опухоли, одним из наиболее неблагоприятных прогностических факторов, увеличивающих вероятность развития метастатической болезни [23]. По нашим данным, выживаемость в группе делеции короткого плеча хромосомы 1 не отличалась от общей выживаемости, в связи с чем данная ассоциация может носить случайный характер.

Смертность от метастатической болезни составила 30,8% (n=32) (рис. 1). Живые на момент исследования (n=65, 62,5%) и умершие по другим причинам (n=7, 6,7%) составили 69,2% от общего количества пациентов в исследуемой группе. Средний срок наблюдения в общей группе пациентов составил 60,1±9,3 мес, при этом средняя продолжительность жизни пациентов от ликвидационного хирургического лечения до гибели вследствие метастатической болезни — 62,9±10,1 мес. Следует отметить, что в исследование вошли пациенты с «большими» УМ (средняя высота опухоли — 9,3±2,7 мм, диаметр основания — 15,7±3,6 мм). Таким образом, наши данные по общей выживаемости согласуются с данными других авторов, изучавших данный вопрос [24].

Отдельный интерес представляло изучение кумулятивной доли выживших в группе с моносомией хромосомы 3 (n=47) по сравнению с группой сравнения (n=57) (рис. 2, а). Анализ полученных данных показал, что в группе моносомии хромосомы 3 смертность от метастатической болезни превысила выживаемость (53,2% против 46,8%, p=0,002), что свидетельствует о значимой роли моносомии хромосомы 3 в выживаемости пациентов с У.М. Аналогичные данные приводят зарубежные авторы [13, 15, 20]. В группе сравнения выживаемость составила 87,7%, а смертность — 12,3%, что более чем в 4 раза ниже, чем в группе моносомии хромосомы 3. Таким образом, нами подтверждена ассоциация моносомии хромосомы 3 со сниженной выживаемостью при УМ.

Анализ выживаемости в группах с делецией короткого плеча хромосомы 1 (n=30) и в группе сравнения (n=74) показал, что смертность в группе 1p составила 36,7%, а в группе сравнения — 28,4% (см. рис. 2, б). Различия в выживаемости в двух подгруппах статистически не значимы (p=0,064). Схожие данные получены при сопоставлении пациентов из группы с метилированием RASSF1A (n=23) и группы сравнения (n=81) (смертность 26,1 и 32,1% соответственно; рис. 3). Однако следует отметить, что в отличие от группы с делецией короткого плеча хромосомы 1 данные различия статистически достоверны (p=0,037 по регрессионной модели Кокса), что может свидетельствовать о более благоприятном характере течения опухолевого процесса в новообразованиях с метилированием гена RASSF1A.

В группе пациентов с сочетанием моносомии хромосомы 3 и делецией короткого плеча хромосомы 1 (n=12) смертность составила 75%, что значительно превышает общую онкологическую смертность (p=0,001). При сочетании моносомии хромосомы 3 и метилирования гена RASSF1A (n=6) мы выявляли смертность в 2/3 случаев, т. е. в 67% (p=0,03), а при сочетании делеции короткого плеча хромосомы 1 и метилирования гена RASSF1A (n=9) — в 22,2% случаев (p=0,068). Из двух пациентов, имевших все три молекулярно-генетические аберрации, один умер от метастатической болезни через 51 мес после проведенного лечения.

Таким образом, делеция короткого плеча хромосомы 1 не оказывала существенного влияния на выживаемость пациентов с УМ, а метилирование гена RASSF1A ассоциировано с благоприятным витальным прогнозом. Сочетание нескольких молекулярно-генетических изменений значимо ухудшало выживаемость пациентов.

1. Изучено распределение частоты таких молекулярно-генетических изменений при УМ, как моносомия хромосомы 3, делеция короткого плеча хромосомы 1 и метилирование гена RASSF1A, а также их ассоциация с клинико-морфологическими параметрами УМ.

2. Показана статистически значимая ассоциация моносомии хромосомы 3 со смешаноклеточным и эпителиоидно-клеточным типом УМ, вовлеченностью в процесс цилиарного тела, а также ассоциация делеции короткого плеча хромосомы 1 с наличием экстрабульбарного роста опухоли.

3. Изучена общая 5-летняя выживаемость пациентов и смертность в результате метастатической болезни в группе «больших» УМ.

4. Показана достоверная ассоциация моносомии хромосомы 3 со сниженной выживаемостью пациентов, а метилирования гена RASSF1A — с улучшением витального прогноза.

5. Сочетание двух и более молекулярно-генетических изменений ухудшает выживаемость пациентов с УМ.

6. Выявленные особенности могут быть использованы для прогнозирования течения УМ у пациентов при выполнении энуклеации, блок-эксцизии опухоли, тонкоигольной аспирационной биопсии, а также для проведения в перспективе адъювантной терапии УМ у пациентов с высоким риском развития метастатической болезни.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.С., Д.З.

Сбор и обработка материала: А.Ц., Н.С., Д.З.

Статистическая обработка данных: А.А., А.Ц.

Написание текста: А.Ц., Н.С.

Редактирование: С.С., А.А.

Конфликт интересов отсутствует.