Клетки злокачественной опухоли, как известно, для выживания и размножения используют иммунное уклонение [1], а глаз, с учетом особенностей иммуноэмбриогенеза, — это мишень и индуктор иммунных процессов. Несмотря на некоторую автономность, он находится под контролем общих систем иммунитета [2—6]. Это связано со способностью иммунной системы формировать защитные эффекты против клеток опухоли в качестве иммунного надзора за ними или, напротив, эффекты уклонения (ускользания) опухолевых клеток от иммунной атаки [7]. Важную роль в метастазировании играет и микроокружение опухоли, которое формируют в первую очередь Т-лимфоциты [8]. Опухолевые клетки, модулируя свое микроокружение, могут обеспечивать себе рост и метастазирование за счет уклонения от иммунитета и активизации опухолевого ангиогенеза. Доказано, что активное микроокружение — маркер плохого витального прогноза [7, 9—12].

МикроРНК-155 — многофункциональная молекула, имеющая основное значение в биологии клетки, но нередко роль ее оказывается противоречивой при различных типах злокачественных опухолей [13—15]. Характер и уровень ее экспрессии варьируют в разных типах клеток и в тканевой среде и регулируются множеством путей в ответ на клеточные сигналы и индуцированное воспаление [16—20]. К примеру, в плазме крови пациентов с некоторыми видами рака уровень экспрессии микроРНК-155 увеличивался в 1,68—8,8 раза по сравнению с группой контроля [21—23]. Не является исключением и увеальная меланома (УМ) [24—26]. Увеличение экспрессии микроРНК-155 в плазме крови пациентов с УМ наблюдали как при одиночном узле опухоли в глазу, так и на фоне ее гематогенного метастазирования [27]. Правда, это увеличение экспрессии и в ткани опухоли, и в биологических жидкостях по сравнению с группой контроля было невелико (до 62%) [28, 29]. МикроРНК-155 отличается от других молекул микроРНК своей способностью активировать миелоидные и лимфоидные клетки, контролировать множественные физиологические процессы, начиная от воспаления и заканчивая иммунологической памятью [30]. Одной из ее особенностей является способность экспрессироваться как иммунными клетками, так и клетками самой меланомы. Но если при некоторых опухолях, в том числе и кожной меланоме, иммунные клетки, инфильтрируя ее ткань, активизируют противоопухолевый иммунитет, чем и улучшают витальный прогноз [5, 6, 20, 31], то у пациентов с УМ наличие инфильтрации ткани опухоли Т-лимфоцитами и макрофагами свидетельствует о высоком риске метастазирования [11, 12, 32]. Суммируя изложенное, можно заключить, что к настоящему моменту описаны и изучены не только морфологические признаки самой опухоли, но и сопутствующие изменения воспалительно-иммунного характера в ее микроокружении; имеется достаточно информации о прогностической значимости изменений экспрессии микроРНК-155 в плазме крови больных УМ, подчеркивающей неблагоприятный витальный прогноз. Однако данные о возможной связи эпигенетической регуляции опухолевого процесса с локальными воспалительными изменениями отсутствуют.

Цель исследования — изучить особенности корреляции экспрессии микроРНК-155 в плазме крови пациентов с УМ после первичной энуклеации с патоморфологическими изменениями воспалительного характера.

Материал и методы

Из 83 обследованных нами больных, подвергнутых энуклеации, лимфоидная инфильтрация УМ выявлена в 21 глазу. Средний возраст в этой группе составил 64,0±11,7 года (от 36 до 83 лет). Толщина опухоли достигала в среднем 9,57±5,1 мм (от 2,23 до 20,0 мм), максимальный базальный диаметр — 14,0±3,7 мм (от 7,62 до 22,1 мм). В трех глазах УМ располагалась юкстапапиллярно при толщине опухоли в пределах 2,23—4,12 мм и максимальном базальном диаметре 10—14 мм. Основанием для энуклеации послужило аннулярное расположение опухоли со снижением зрительных функций (рис. 1, а, б).

Рис. 1. Юкстапапиллярная меланома хориоидеи.

а — фотография глазного дна больного 53 лет, диагноз: «аннулярная меланома хориоидеи», по данным ОКТ — выход за пределы сетчатки. Патогистологический диагноз: «веретеноклеточная меланома хориоидеи». К моменту операции гематогенные метастазы отсутствуют (по результатам КТ, МРТ органов брюшной полости и грудной клетки); б — фотография глазного дна больной 72 лет, диагноз: «аннулярная меланома хориоидеи», по данным КТ, МРТ метастазы не выявлены. Патогистологический диагноз — «эпителиоидноклеточная меланома хориоидеи с формированием эписклерального узла». К моменту операции гематогенные метастазы отсутствуют (по результатам КТ, МРТ органов брюшной полости и грудной клетки).

Патоморфологическое исследование удаленных глаз проведено в патогистологическом отделении ММНКЦ им. С.П. Боткина. Полученный операционный материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, обрабатывали в рамках рутинных гистологических техник и заливали в парафин. Срезы, полученные с парафиновых блоков, окрашивали рутинно гематоксилином и эозином. Подсчет опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов осуществляли так же, как в случаях злокачественной меланомы кожи. В рамках этого способа учитывали в первую очередь выраженность инфильтрации опухоли лимфоцитами: расположение лимфоидного инфильтрата на периферии опухолевого узла, а также единичные мелкие фокусы инвазии лимфоцитов в опухолевую строму расценивали как незначительное распространение (non Brisk TIL; рис. 2, а) Диффузное распространение лимфоидного инфильтрата вне зависимости от его выраженности в толще опухоли было расценено как значительное (Brisk TIL; рис. 2, б). Непосредственно подсчет инфильтрирующих опухоль лимфоцитов в строме проводили методом световой микроскопии при увеличении 400, в 10 полях зрения, затем высчитывали среднее арифметическое значение и полученный результат делили на 100. Таким образом формировали процентное соотношение. Степень инфильтрации опухоли лимфоцитами была оценена в процентах от общего числа клеток в анализируемом поле.

Рис. 2. Инфильтрация меланомы хориоидеи лимфоцитами.

а — non-Brisk; б — Brisk. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.

Статистический анализ проводили в пакетах программ Microsoft Excel 2019 и IBM SPSS Statistics 27. Использовали параметрические методы сравнения значений (t-критерий Стьюдента), для оценки взаимосвязи между двумя количественными переменными проводили корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции Пирсона. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Распределение УМ по клеточному типу и частота выявления лимфоцитарной инфильтрации зоны интереса представлены в табл. 1.

Таблица 1. Частота лимфоидной инфильтрации увеальной меланомы в энуклеированных глазах с учетом морфологического типа опухоли

Характер экспрессии микроРНК-155 в плазме крови изучен в группе больных с лимфоидной инфильтрацией УМ (n=21) и без нее (n=62) до и после первичной энуклеации. В 21 наблюдении результаты экспрессии микроРНК-155 в сыворотке крови сопоставлены с результатами патоморфологических изменений непосредственно в меланоме и в окружающей ее ткани. До операции инструментально во всех случаях исключены гематогенные метастазы (КТ, МРТ легких и печени). Срок наблюдения за больными в послеоперационном периоде составил 6—53 мес (в среднем 21,5±14,9 мес). В двух случаях за период наблюдения через 6 и 10 мес после операции выявлены гематогенные метастазы в печень. Исследования уровня экспрессии микроРНК-155 в сыворотке крови больных как до операции, так и после энуклеации, выполняли на базе Научно-исследовательского института молекулярной и персонализированной медицины РМАНПО Минздрава России. Уровень экспрессии микроРНК-155 представлен в табл. 2.

Таблица 2. Уровень экспрессии микроРНК-155 у пациентов с УМ с лимфоидной инфильтрацией опухоли

Примечание. * — различия показателей статистически значимы (p<0,05).

Результаты и обсуждение

Частота глаз с лимфоидной инфильтрацией в анализируемой группе пациентов с УМ (см. табл. 1) составила 25,3%. Степень проявления ее в первичном опухолевом узле колебалась от 1 до 25%. Следует отметить, что первые сведения о 5% инфильтрации УМ лимфоцитами принадлежат F.H. Durie (1990) [33]. Поздние показатели лимфоидной инфильтрации, подавляющей активацию иммунной системы, среди диагностированных УМ достигают 12—24% [34—36]. В цитируемых исследованиях анализировали 20 полей зрения, и положительным результатом увеличения лимфоидной инфильтрации считали 100 клеток и более. Речь в описываемых случаях шла о больных с метастатической УМ. Все наши пациенты имели УМ T_3—4N₀M₀. Таким образом, лимфоидную инфильтрацию мы оценивали в группе больных с наличием первичного очага и доказанным отсутствием метастазов. Подсчет лимфоцитов проведен по описанной методике, но в 10 полях. Минимальные показатели лимфоидной инфильтрации составляли 1%, максимальные — 25%. По характеру инфильтрация была представлена в виде отдельных фокусов (17 глаз), вариация инфильтрации колебалась в пределах от 1 до 10%. Сплошная (или плотная) инфильтрация опухоли имелась в четырех глазах. В шести глазах инфильтрация меланомы сочеталась с появлением лимфоидного микроокружения. Более низкий процент лимфоидной инфильтрации опухоли наблюдали при веретеноклеточном типе УМ (14 глаз), но именно в этой группе были больные с метастазами в печень при лимфоидной инфильтрации опухоли не более 10% (сроки выявления метастазов — через 6 и 10 мес после энуклеации). Локальная воспалительная реакция в трех случаях веретеноклеточных УМ сопровождалась перифокальным лимфоидным микроокружением. Два из этих наблюдений относятся к нашим больным с развившимися метастазами. Складывается впечатление, что в большей степени угрозой метастазирования является именно формирование микроокружения. Доказательством этого является и увеличение лимфоидной инфильтрации и в метастатических очагах [10, 12, 37—39].

Эпителиоидноклеточная меланома представлена одним наблюдением, инфильтрация ткани опухоли не превышала 7%. При сроках наблюдения до 15 мес (на момент написания статьи) признаки метастазирования отсутствуют. Известно, что эпителиоидноклеточная УМ относится к наиболее агрессивно растущим внутриглазным меланомам. Количество представителей иммунитета в опухоли ненамного выше, но в сочетании с такими признаками, как высокая плотность ангиогенеза, аннулярная форма роста юкстапапиллярной УМ (см. рис. 1, б), выход опухоли за пределы склеры, они резко ухудшают витальный прогноз в данном случае. Доля глаз со смешанноклеточной меланомой составила 13,3%, лимфоидная инфильтрация в пределах 2—25% отмечена практически в половине случаев (шесть глаз), представлена она была в виде отдельных фокусов скопления лимфоцитов (три глаза), диффузной инфильтрации лимфоцитами (три глаза). В трех из этих опухолей имеется перифокальная инфильтрация. При сроках наблюдения 10—19 мес (в среднем 15,5±3,14 мес) видимых метастазов не выявлено. Однако локальное лимфоидное окружение УМ остается тревожным симптомом их возникновения [8].

Таким образом, лимфоидная инфильтрация как элемент воспалительного неспецифического ответа на развитие опухоли имеется и при УМ, но в отличие от других локализаций увеличение степени ее инфильтрации свидетельствует, скорее всего, об агрессивности процесса. Уровень экспрессии микроРНК-155 у больных с лимфоидной инфильтрацией представлен на рис. 3. Несмотря на то что средняя степень лимфоидной инфильтрации ограничивается достаточно низкими показателями (медиана — 5,5%), анализ уровня экспрессии микроРНК-155 в этой группе оказался выше (p=0,02), чем у пациентов с УМ без лимфоидной инфильтрации (см. рис. 3).

Рис. 3. Графическое изображение уровня экспрессии микроРНК-155 в плазме крови пациентов с УМ до энуклеации с лимфоидной инфильтрацией опухоли и без нее (средние показатели; различия показателей статистически значимы — p<0,05).

Показатели экспрессии микроРНК-155 в плазме крови пациентов с УМ во второй группе практически соответствует данным литературы [29]. Сопоставление уровня экспрессии микроРНК-155 в плазме крови у всех пациентов с УМ (n=21) со степенью активности лимфоидной инфильтрации первичного узла (рис. 4) четко указывает на тенденцию увеличения экспрессии микроРНК-155 в плазме крови по мере увеличения степени лимфоидной инфильтрации УМ (коэффициент корреляции Пирсона 0,94; p<0,001).

Рис. 4. Графическое изображение корреляции уровня экспрессии микроРНК-155 плазмы крови больных со степенью лимфоидной инфильтрации ткани УМ (коэффициент корреляции Пирсона 0,94; p<0,001).

Оказалось, что после энуклеации уровень экспрессии микроРНК-155 в плазме крови тех же больных снижается в среднем в 14,1 раза (рис. 5). Исключением явились два пациента, у которых в ранние сроки были выявлены гематогенные метастазы: экспрессия микроРНК-155 снизилась у них значительно меньше (в 4,2 и 4,6 раза соответственно). Конечно, сроки наблюдения в нашей группе больных невелики, но выявление двух случаев метастазов в достаточно малочисленной группе больных (n=21) уже свидетельствует об агрессивности лимфоидной инфильтрации на ранней стадии ее проявления. Представленные в данной статье показатели увеличения потенциала микроРНК-155 в плазме крови больных при прогрессировании УМ напрямую связаны с инфильтрацией опухоли лимфоцитами, основными представителями которых являются T-лимфоциты [40].

Рис. 5. Уровень экспрессии микроРНК-155 в плазме крови пациентов с УМ с лимфоидной инфильтрацией первичного узла до и после энуклеации.

* — уровень экспрессии микроРНК-155 в плазме крови больных после энуклеации на фоне выявленных гематогенных метастазов.

Заключение

Результаты исследования свидетельствуют о том, что УМ может метастазировать и при более низком проценте лимфоидной инфильтрации в условиях подсчета в 10 полях зрения. И было бы неправильным считать предиктором плохого прогноза только высокий уровень лимфоидной инфильтрации, на что указывают в литературе [36]. Уже сама по себе подобная инфильтрация УМ с появлением перифокального лимфоидного окружения свидетельствует о плохом прогнозе. А контроль уровня экспрессии микроРНК-155 в плазме крови таких больных позволяет до энуклеации высказать подозрение о наличии скрытого метастазирования. Это не только важно в плане диспансерного наблюдения, но и сыграет важную роль в дальнейшем развитии таргетного лечения.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ в рамках научного проекта №24-25-00340.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Бровкина А.Ф.

Сбор и обработка материала: Кабардикова Л.А., Щербаков П.А., Буре И.В.

Статистическая обработка данных: Кабардикова Л.А., Мирзаев К.Б.

Написание текста: Бровкина А.Ф., Кабардикова Л.А., Щербаков П.А.

Редактирование: Бровкина А.Ф., Мирзаев К.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.