Привлечение новейших биотехнологий и методов генной инженерии к исследованию стареющего организма позволило выделить группу нейродегенеративных заболеваний (НДЗ), которые имеют сходный механизм патогенеза, включающий процессы патологической агрегации белков, депонирования фибриллярных нерастворимых структур в виде гистопатологических включений в нервной ткани, что позволило объединить их в группу с общим названием протеинопатии [1, 2].
К протеинопатиям относят болезнь Альцгеймера (БА), при которой выявляются β-амилоидные сенильные бляшки и внутриклеточные нейрофибриллярные клубки, болезнь Паркинсона (БП), характеризующуюся присутствием телец Леви, и другие НДЗ. Последние данные молекулярного анализа, указывающие на ключевую роль определенных белков в этиологии и патогенезе ряда НДЗ, в том числе и возрастной макулярной дегенерации (ВМД), дали импульс к разработке новых концепций, выделяющих отдельные разновидности протеинопатий, таких как таупатия, синуклеинопатия, амилоидопатия [3—6].
Результаты, полученные при изучении механизмов образования различных белковых включений в структурах нервной ткани головного мозга и сетчатки, обращают внимание на сходство принципиальных этапов формирования белковых отложений [1, 2, 4]. Под влиянием окислительного стресса, химических модификаций, генетических мутаций и других факторов происходит переход белка-предшественника из растворимой формы в патогенную, склонную к агрегации. Патогенная форма образует олигомеры, из которых впоследствии формируются протофибриллы. На заключительном этапе агрегации образующиеся из протофибрилл зрелые фибриллы формируют нерастворимые белковые отложения в нервной ткани как внутриклеточные, так и внеклеточные [1].
Некоторые исследователи, проведя анализ современных данных о молекулярных основах развития протеинопатий, считают амилоид лейтмотивом в патогенезе ряда НДЗ, в связи с чем проблема амилоидоза и амилоидогенеза по-прежнему остается актуальной [1—4].
Амилоидозом называют группу заболеваний с большим разнообразием клинических проявлений, вызванных системным или локальным отложением в органах и тканях фибриллярных белковых масс (амилоида), имеющих общую физическую структуру, но отличающихся по химическому составу фибрилл и по белку предшественнику [7, 8]. Распространенность амилоидоза среди населения существенно различается в зависимости от клинической формы (локальный, системный), этнической принадлежности, географической зоны и возраста. В соответствии с классификацией старческого амилоидоза выделяют старческий локальный неэндокринный амилоидоз глаза и старческий локальный неэндокринный амилоидоз головного мозга [9, 10].
В последнее время повысился интерес к изучению локального старческого амилоидоза глаза и его связи с НДЗ [4, 11]. Клиническим проявлением локального старческого амилоидоза с преимущественным поражением заднего отдела глаза является ВМД [12, 13]. Нами в 1990—2013 гг. были опубликованы работы, обосновывающие инициирующую роль локального старческого амилоидоза в патогенезе ВМД [9, 12—14].
Результаты изучения амилоидогенеза указывают на то, что способность различных белков формировать амилоид во многом зависит от аминокислотного состава полипептида, что определяет конформационную стабильность и склонность белков к агрегации [1, 4]. Широкое распространение получила гипотеза, согласно которой, первичными цитотоксическими агентами при развитии протеинопатий, в том числе и амилоидопатий, являются олигомеры склонных к агрегации белков [2—6]. В ряде работ показано, что нейротоксический эффект олигомеров и протофибрилл связан с их повреждающим действием на мембранные структуры клетки, в том числе митохондрии, что стимулирует гиперпродукцию активных форм кислорода, вызывающих повреждение и гибель нейронов [15]. В связи с этим дальнейшие этапы процесса агрегации белков некоторые авторы рассматривают как элементы защитного механизма, способствующего удалению цитотоксических форм амилоидогенных белков [1, 16].
Исследования, проведенные на молекулярном уровне, показали, что под влиянием факторов риска трансмембранный белок-предшественник β-амилоида — APP (amyloid precursor protein), в норме присутствующий в мембранных структурах клеток, подвергается последовательному воздействию β- и γ-секретаз таким образом, что приводит к внутримембранному отщеплению от APP полипептидов β-амилоида с длиной цепи 42 (Аβ1−42) и 40 (Аβ1−40) аминокислотных остатков. Именно Аβ1−42 и Аβ1−40 склонны к образованию олигомеров и протофибрилл, оказывающих токсическое действие на нейроны, из которых в свою очередь образуются зрелые фибриллы, формирующие белковые отложения как внутри клеток сетчатки, так и внеклеточно, в том числе и в друзах сетчатки [2—4].
По мнению большинства авторов, образование «мягких», сливных друз в структурах гематоретинального барьера является одним из первых объективных клинико-морфологических признаков, который наблюдается при ВМД [17, 18]. В последнее время в ряде оригинальных статей исследователи показывают наличие Аβ в друзах, что подтверждается результатами иммуногистохимических методов [19, 20]. V. Luibl и соавт. [19], используя моноклональные антитела, показали наличие Аβ в друзах и сетчатке трансгенных мышей модели ВМД. J. Isas и соавт. [20] обнаружили как растворимые, так и нерастворимые формы Аβ в друзах макулярной области глаз человека. Более тонкие биохимические и иммуногистохимические исследования позволили идентифицировать белки и липиды, составляющие суть материала, образующего друзы. Таковыми являются: Аβ, витронектин, Р компонент амилоида, аполипопротеин Е, транстиретин, С3, С5b9, С5 фракции комплемента и др. [21]. Результаты экспериментальных работ показали, что введение в организм лабораторного животного антител к Аβ значительно уменьшало его отложения в сетчатке [22]. Большинство исследователей указывают на тот факт, что Аβ, аполипопротеин Е, белки комплемента, обнаруживаемые в составе друз, являются компонентами сенильных бляшек при БА [23, 24].
Клиницисты и морфологи обнаруживают различные морфофункциональные нарушения органа зрения у больных БА [24—26]. До сих пор не совсем понятны механизмы зрительных нарушений у данной группы больных, однако нельзя не учитывать тот факт, что сетчатка, развивающаяся из того же источника, что и головной мозг (нейроэктодерма), и включающая более чем 20 видов нейронов с различными фенотипическими и физиологическими характеристиками, демонстрирует синхронные процессы, происходящие в ней и в ткани головного мозга [24—26]. Авторы современных работ прямо указывают на значительную роль β-амилоидопатии в этиопатогенезе как БА, так и некоторых глазных заболеваний, таких как катаракта, псевдоэксфолиативный синдром, псевдоэксфолиативная глаукома [26—28]. Результаты недавних исследований, проведенных на животных моделях БА, показали коррелирующую иммунопозитивность к Аβ как в друзах сетчатки, так и в сенильных бляшках при БА [19—21].
Таким образом, учитывая общность амилоидогенеза в структурных элементах головного мозга при БА и гематоретинального барьера при ВМД, целью нашей работы явилось изучение клинико-морфологических особенностей амилоидогенеза при ВМД как проявления одного из видов протеинопатий — β-амилоидопатии.
Материал и методы
С целью изучения роли старческого локального амилоидоза глаза в патогенезе ВМД нами был проведен сравнительный анализ частоты характерных для этого заболевания патоморфологических изменений соответствующих тканей и наличия в них амилоидных включений. Исследовано 111 глаз у 56 умерших (по 2 глаза — у 55 трупов и 1 глаз — у 1) старше 60 лет с прижизненным офтальмологическим обследованием, у которых после смерти обнаружены морфологические признаки ВМД, а также изучен головной мозг на предмет выявления патоморфологических изменений, патогномоничных для БА. В качестве контроля были изучены 16 глаз и головной мозг (от 8 трупов) в возрастных группах 60—69 и 80—100 лет без признаков ВМД и Б.А. Глаза и головной мозг исследованы с помощью селективных методов выявления амилоида (окраска щелочным конго красным, флюоресценция с тиофлавином Т) и его белков (реакция с перманганатом калия и щелочно-гуанидиновый метод). Для установления связи между морфологическими проявлениями ВМД, БА и амилоидозом была проанализирована частота амилоидной ангиопатии глаза, амилоидных включений в структурах гематоретинального барьера и церебральной ангиопатии с сенильными бляшками.
В процессе приготовления гистологических препаратов для ориентировки структур глаза пользовались методикой, предложенной В.Н. Архангельским [29]. Для проведения микроскопического исследования глаза и фрагменты головного мозга фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в 96% спирте и заливали в парафин. Перед парафинизацией все глазные яблоки разрезали горизонтально по центральному меридиану для лучшего пропитывания парафином и получения гистологических препаратов с возможностью изучения в одном срезе диска зрительного нерва и области макулы (В.Н. Архангельский, 1957). Все срезы глазных яблок и головного мозга окрашивали гематоксилином и эозином и по Нисслю.
Этапы иммуногистохимического окрашивания на Аβ1−42 осуществляли по стандартному протоколу. Срезы головного мозга и глазных яблок инкубировались с первичными кроличьими поликлональными антителами к Аβ1−42 («Abbiotec») в разведении 1:200 в течение 30 мин. В качестве детекционной системы использовали полимерную систему (Ultravision Quanto Detection System HPR Polymer, «Thermoscientific»). Для анализа окрашенных препаратов применяли как негативные бессубстратные контроли, так и позитивные контроли с использованием архивных срезов головного мозга и глаз.
Для электронной микроскопии использовали материал, залитый в парафин, который после депарафинизации дофиксировали в 1% осмиевой кислоте, обезвоживали в спирте и ацетоне. После пропитки в смесях ацетона с аралдитом и чистой смоле кусочки мозга и задней стенки глаз заливали в аралдит и помещали в термостат (при 58 °С).
Для определения количества ядер клеток пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) в макулярной области использовали линейную горизонтальную шкалу окулярмикрометра со 100 делениями (Автандилов Г.Г. , 1990) [30]. Определяли среднее число ядер клеток ПЭС в 100 делениях (объектив 40, окуляр 10) в двух возрастных группах — от 60 до 69 и от 80 до 100 лет.
Анализ данных проводили с использованием статистической программы Statistica 6.0. Статистическую обработку результатов выполняли с использованием t-критерия Стьюдента. Для выборок с отклонением от нормального распределения использовали U-критерий Манна—Уитни. Различия при p<0,05 считались статистически значимыми.
Результаты и обсуждение
Во всех 111 глазах группы с прижизненным офтальмологическим обследованием после смерти микроскопически обнаружены морфологические признаки ВМД, при этом мы не ставили задачу провести корреляцию морфологических изменений в сетчатке и структурах гематоретинального барьера с офтальмоскопическими данными, определяющими клиническую стадию заболевания. Все 111 глаз с морфологическими признаками ВМД были разделены на 2 группы: в одну из них включены 100 глаз с «сухой» формой ВМД с атрофическими изменениями тканей дна глаза (друзы, атрофия и уменьшение количества клеток ПЭС, миграция пигмента, атрофия и склероз хориоидеи, утолщение мембраны Бруха — МБ), в другую — 11 глаз с «влажной» формой ВМД с преимущественно экссудативными изменениями (экссудативная отслойка ПЭС, неоваскуляризация, кровоизлияния) и формированием фиброзной ткани. Все морфологические изменения при «сухой» и «влажной» ВМД имели четкую тенденцию к повышению с возрастом (рис. 1).
В структурных элементах заднего отдела глаза амилоидные отложения при ВМД были обнаружены в друзах, в МБ, сосудах хориоидеи (амилоидная ангиопатия). Ультраструктурно эти отложения имели характерное для амилоидных фибрилл строение (рис. 2).
При «сухой» форме ВМД амилоид был выявлен в 39%, а при «влажной» форме — в 80% исследованных глаз. В МБ, содержимом мягких и твердых друз, в стенке сосудов хориоидеи при реакции с тиофлавином Т отложения амилоида давали характерное свечение. При микроскопическом исследовании глаз с «влажной» формой ВМД друзы уплощались, сливались между собой, деформируя МБ и клетки ПЭС. Вероятно, на этой стадии развития заболевания, когда амилоид уже стимулирует новообразование сосудов хориоидеи [31], офтальмоскопическая картина демонстрирует уменьшение количества друз и на первый план выступает неоваскулогенез и его последствия. Таким образом, при морфологическом исследовании при переходе от «сухой» к «влажной» форме ВМД в пораженных структурах дна глаза почти вдвое увеличивается частота амилоидоза, что позволило считать амилоидоз причастным к прогрессированию ВМД.
Особого внимания заслуживают результаты морфометрического исследования клеток ПЭС в макулярной области, показавшие достоверное уменьшение количества ядер клеток ПЭС с возрастом, причем наименьшее их число было обнаружено в глазах с ВМД и амилоидозом (см. таблицу).
Исследование препаратов головного мозга и глаз с ВМД показало сочетание локальных форм амилоидоза в 50,6% случаев, что характеризовалось содружественным отложением Аβ в сосудах и веществе головного мозга (сенильных бляшках), а также в сосудах хориоидеи и структурных элементах заднего отдела глаза (друзы, МБ, сетчатка) с типичными для Аβ гистохимическими и иммуногистохимическими характеристиками (рис. 3).
При сочетании ВМД и БА у женщин амилоид обнаруживался в возрасте на 10 лет раньше и в 2 раза чаще, чем у мужчин. По мере старения возрастает частота сочетанного старческого амилоидоза глаза и головного мозга, а процент случаев старческого локального амилоидоза глаза наиболее высок при с БА.
Таким образом, результаты проведенного исследования продемонстрировали, что амилоидные отложения в структурных элементах заднего отдела глаза способствуют и усугубляют течение ВМД. Чаще всего в амилоидный процесс вовлекаются МБ, сосуды хориоидеи и сетчатка. Нами выявлена прямая зависимость между тяжестью патологических изменений при ВМД и частотой выявления амилоидных включений в структурах дна глаза. Более чем в половине случаев морфологические признаки ВМД сочетались с морфологическими проявлениями БА (сенильные бляшки, амилоидная ангиопатия).
Полученные нами данные, а также результаты молекулярных исследований дают возможность предположить патогенетическую общность ВМД и БА, основанную на едином метаболическом пути предшественника Аβ — АРР.
В норме трансмембранный белок APP присутствует во многих клетках, включая ПЭС, нейроны сетчатки и головного мозга. Неамилоидогенный метаболический путь АРР включает последовательное воздействие на него α- и γ-секретаз с образованием s-APPα, P3 и AICD (APP intracellular domain), участвующих в адекватном клеточном обмене. В стареющем организме под влиянием факторов риска в клетках ПЭС, нейронах сетчатки и головного мозга снижается активность протеосомно-лизосомальной системы, увеличивается количество фаголизосом, эндосом, гранул липофусцина. Указанные внутриклеточные изменения вызывают развитие окислительного стресса и цитотоксичности. В таких условиях метаболизм АРР протекает по амилоидогенному пути с образованием олигомерных, префибриллярных и в конечном счете нерастворимых фибриллярных форм Аβ, откладывающихся в сенильных бляшках головного мозга при БА, а также в слоях сетчатки, материале друз, структурах гематоретинального барьера при ВМД. Анализ современных данных, полученных при изучении молекулярно-клеточных процессов, лежащих в основе развития НДЗ, позволяет утверждать, что лейтмотивом патогенеза при ВМД и БА является агрегация β-амилоида, лежащая в основе цитотоксичности и нейродегенерации. Это позволяет, на наш взгляд, трактовать ВМД как разновидность протеинопатии — β-амилоидопатию.
Такой взгляд на проблему создает предпосылки для выработки новых стратегий и создания нейропротекторных и офтальмогериатрических препаратов нового поколения, патогенетически оправданных и воздействующих непосредственно на звенья патогенеза, включая все этапы патологической агрегации ключевого белка — Аβ, его стабильность и метаболизм.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: В.Е., А.Н.
Сбор и обработка материала: А.Н.
Статистическая обработка: А.Н., В.Е.
Написание текста: В.Е., А.Н.
Редактирование: В.Е.
Конфликт интересов отсутствует.