Ермилов В.В.

ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет», Павших Борцов пл., 1, Волгоград, Российская федерация, 400131

Нестерова А.А.

ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет», Павших Борцов пл., 1, Волгоград, Российская федерация, 400131

Бета-амилоидопатия как проявление протеинопатии при возрастной макулярной дегенерации

Журнал: Вестник офтальмологии. 2015;131(2): 26-31

Просмотров : 16

Загрузок :

Как цитировать

Ермилов В. В., Нестерова А. А. Бета-амилоидопатия как проявление протеинопатии при возрастной макулярной дегенерации. Вестник офтальмологии. 2015;131(2):26-31. https://doi.org/10.17116/oftalma2015131226-31

Авторы:

Ермилов В.В.

ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет», Павших Борцов пл., 1, Волгоград, Российская федерация, 400131

Все авторы (2)

Привлечение новейших биотехнологий и методов генной инженерии к исследованию стареющего организма позволило выделить группу нейродегенеративных заболеваний (НДЗ), которые имеют сходный механизм патогенеза, включающий процессы патологической агрегации белков, депонирования фибриллярных нерастворимых структур в виде гистопатологических включений в нервной ткани, что позволило объединить их в группу с общим названием протеинопатии [1, 2].

К протеинопатиям относят болезнь Альцгеймера (БА), при которой выявляются β-амилоидные сенильные бляшки и внутриклеточные нейрофибриллярные клубки, болезнь Паркинсона (БП), характеризующуюся присутствием телец Леви, и другие НДЗ. Последние данные молекулярного анализа, указывающие на ключевую роль определенных белков в этиологии и патогенезе ряда НДЗ, в том числе и возрастной макулярной дегенерации (ВМД), дали импульс к разработке новых концепций, выделяющих отдельные разновидности протеинопатий, таких как таупатия, синуклеинопатия, амилоидопатия [3—6].

Результаты, полученные при изучении механизмов образования различных белковых включений в структурах нервной ткани головного мозга и сетчатки, обращают внимание на сходство принципиальных этапов формирования белковых отложений [1, 2, 4]. Под влиянием окислительного стресса, химических модификаций, генетических мутаций и других факторов происходит переход белка-предшественника из растворимой формы в патогенную, склонную к агрегации. Патогенная форма образует олигомеры, из которых впоследствии формируются протофибриллы. На заключительном этапе агрегации образующиеся из протофибрилл зрелые фибриллы формируют нерастворимые белковые отложения в нервной ткани как внутриклеточные, так и внеклеточные [1].

Некоторые исследователи, проведя анализ современных данных о молекулярных основах развития протеинопатий, считают амилоид лейтмотивом в патогенезе ряда НДЗ, в связи с чем проблема амилоидоза и амилоидогенеза по-прежнему остается актуальной [1—4].

Амилоидозом называют группу заболеваний с большим разнообразием клинических проявлений, вызванных системным или локальным отложением в органах и тканях фибриллярных белковых масс (амилоида), имеющих общую физическую структуру, но отличающихся по химическому составу фибрилл и по белку предшественнику [7, 8]. Распространенность амилоидоза среди населения существенно различается в зависимости от клинической формы (локальный, системный), этнической принадлежности, географической зоны и возраста. В соответствии с классификацией старческого амилоидоза выделяют старческий локальный неэндокринный амилоидоз глаза и старческий локальный неэндокринный амилоидоз головного мозга [9, 10].

В последнее время повысился интерес к изучению локального старческого амилоидоза глаза и его связи с НДЗ [4, 11]. Клиническим проявлением локального старческого амилоидоза с преимущественным поражением заднего отдела глаза является ВМД [12, 13]. Нами в 1990—2013 гг. были опубликованы работы, обосновывающие инициирующую роль локального старческого амилоидоза в патогенезе ВМД [9, 12—14].

Результаты изучения амилоидогенеза указывают на то, что способность различных белков формировать амилоид во многом зависит от аминокислотного состава полипептида, что определяет конформационную стабильность и склонность белков к агрегации [1, 4]. Широкое распространение получила гипотеза, согласно которой, первичными цитотоксическими агентами при развитии протеинопатий, в том числе и амилоидопатий, являются олигомеры склонных к агрегации белков [2—6]. В ряде работ показано, что нейротоксический эффект олигомеров и протофибрилл связан с их повреждающим действием на мембранные структуры клетки, в том числе митохондрии, что стимулирует гиперпродукцию активных форм кислорода, вызывающих повреждение и гибель нейронов [15]. В связи с этим дальнейшие этапы процесса агрегации белков некоторые авторы рассматривают как элементы защитного механизма, способствующего удалению цитотоксических форм амилоидогенных белков [1, 16].

Исследования, проведенные на молекулярном уровне, показали, что под влиянием факторов риска трансмембранный белок-предшественник β-амилоида — APP (amyloid precursor protein), в норме присутствующий в мембранных структурах клеток, подвергается последовательному воздействию β- и γ-секретаз таким образом, что приводит к внутримембранному отщеплению от APP полипептидов β-амилоида с длиной цепи 42 (Аβ1−42) и 40 (Аβ1−40) аминокислотных остатков. Именно Аβ1−42 и Аβ1−40 склонны к образованию олигомеров и протофибрилл, оказывающих токсическое действие на нейроны, из которых в свою очередь образуются зрелые фибриллы, формирующие белковые отложения как внутри клеток сетчатки, так и внеклеточно, в том числе и в друзах сетчатки [2—4].

По мнению большинства авторов, образование «мягких», сливных друз в структурах гематоретинального барьера является одним из первых объективных клинико-морфологических признаков, который наблюдается при ВМД [17, 18]. В последнее время в ряде оригинальных статей исследователи показывают наличие Аβ в друзах, что подтверждается результатами иммуногистохимических методов [19, 20]. V. Luibl и соавт. [19], используя моноклональные антитела, показали наличие Аβ в друзах и сетчатке трансгенных мышей модели ВМД. J. Isas и соавт. [20] обнаружили как растворимые, так и нерастворимые формы Аβ в друзах макулярной области глаз человека. Более тонкие биохимические и иммуногистохимические исследования позволили идентифицировать белки и липиды, составляющие суть материала, образующего друзы. Таковыми являются: Аβ, витронектин, Р компонент амилоида, аполипопротеин Е, транстиретин, С3, С5b9, С5 фракции комплемента и др. [21]. Результаты экспериментальных работ показали, что введение в организм лабораторного животного антител к Аβ значительно уменьшало его отложения в сетчатке [22]. Большинство исследователей указывают на тот факт, что Аβ, аполипопротеин Е, белки комплемента, обнаруживаемые в составе друз, являются компонентами сенильных бляшек при БА [23, 24].

Клиницисты и морфологи обнаруживают различные морфофункциональные нарушения органа зрения у больных БА [24—26]. До сих пор не совсем понятны механизмы зрительных нарушений у данной группы больных, однако нельзя не учитывать тот факт, что сетчатка, развивающаяся из того же источника, что и головной мозг (нейроэктодерма), и включающая более чем 20 видов нейронов с различными фенотипическими и физиологическими характеристиками, демонстрирует синхронные процессы, происходящие в ней и в ткани головного мозга [24—26]. Авторы современных работ прямо указывают на значительную роль β-амилоидопатии в этиопатогенезе как БА, так и некоторых глазных заболеваний, таких как катаракта, псевдоэксфолиативный синдром, псевдоэксфолиативная глаукома [26—28]. Результаты недавних исследований, проведенных на животных моделях БА, показали коррелирующую иммунопозитивность к Аβ как в друзах сетчатки, так и в сенильных бляшках при БА [19—21].

Таким образом, учитывая общность амилоидогенеза в структурных элементах головного мозга при БА и гематоретинального барьера при ВМД, целью нашей работы явилось изучение клинико-морфологических особенностей амилоидогенеза при ВМД как проявления одного из видов протеинопатий — β-амилоидопатии.

Материал и методы

С целью изучения роли старческого локального амилоидоза глаза в патогенезе ВМД нами был проведен сравнительный анализ частоты характерных для этого заболевания патоморфологических изменений соответствующих тканей и наличия в них амилоидных включений. Исследовано 111 глаз у 56 умерших (по 2 глаза — у 55 трупов и 1 глаз — у 1) старше 60 лет с прижизненным офтальмологическим обследованием, у которых после смерти обнаружены морфологические признаки ВМД, а также изучен головной мозг на предмет выявления патоморфологических изменений, патогномоничных для БА. В качестве контроля были изучены 16 глаз и головной мозг (от 8 трупов) в возрастных группах 60—69 и 80—100 лет без признаков ВМД и Б.А. Глаза и головной мозг исследованы с помощью селективных методов выявления амилоида (окраска щелочным конго красным, флюоресценция с тиофлавином Т) и его белков (реакция с перманганатом калия и щелочно-гуанидиновый метод). Для установления связи между морфологическими проявлениями ВМД, БА и амилоидозом была проанализирована частота амилоидной ангиопатии глаза, амилоидных включений в структурах гематоретинального барьера и церебральной ангиопатии с сенильными бляшками.

В процессе приготовления гистологических препаратов для ориентировки структур глаза пользовались методикой, предложенной В.Н. Архангельским [29]. Для проведения микроскопического исследования глаза и фрагменты головного мозга фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в 96% спирте и заливали в парафин. Перед парафинизацией все глазные яблоки разрезали горизонтально по центральному меридиану для лучшего пропитывания парафином и получения гистологических препаратов с возможностью изучения в одном срезе диска зрительного нерва и области макулы (В.Н. Архангельский, 1957). Все срезы глазных яблок и головного мозга окрашивали гематоксилином и эозином и по Нисслю.

Этапы иммуногистохимического окрашивания на Аβ1−42 осуществляли по стандартному протоколу. Срезы головного мозга и глазных яблок инкубировались с первичными кроличьими поликлональными антителами к Аβ1−42 («Abbiotec») в разведении 1:200 в течение 30 мин. В качестве детекционной системы использовали полимерную систему (Ultravision Quanto Detection System HPR Polymer, «Thermoscientific»). Для анализа окрашенных препаратов применяли как негативные бессубстратные контроли, так и позитивные контроли с использованием архивных срезов головного мозга и глаз.

Для электронной микроскопии использовали материал, залитый в парафин, который после депарафинизации дофиксировали в 1% осмиевой кислоте, обезвоживали в спирте и ацетоне. После пропитки в смесях ацетона с аралдитом и чистой смоле кусочки мозга и задней стенки глаз заливали в аралдит и помещали в термостат (при 58 °С).

Для определения количества ядер клеток пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) в макулярной области использовали линейную горизонтальную шкалу окулярмикрометра со 100 делениями (Автандилов Г.Г. , 1990) [30]. Определяли среднее число ядер клеток ПЭС в 100 делениях (объектив 40, окуляр 10) в двух возрастных группах — от 60 до 69 и от 80 до 100 лет.

Анализ данных проводили с использованием статистической программы Statistica 6.0. Статистическую обработку результатов выполняли с использованием t-критерия Стьюдента. Для выборок с отклонением от нормального распределения использовали U-критерий Манна—Уитни. Различия при p<0,05 считались статистически значимыми.

Результаты и обсуждение

Во всех 111 глазах группы с прижизненным офтальмологическим обследованием после смерти микроскопически обнаружены морфологические признаки ВМД, при этом мы не ставили задачу провести корреляцию морфологических изменений в сетчатке и структурах гематоретинального барьера с офтальмоскопическими данными, определяющими клиническую стадию заболевания. Все 111 глаз с морфологическими признаками ВМД были разделены на 2 группы: в одну из них включены 100 глаз с «сухой» формой ВМД с атрофическими изменениями тканей дна глаза (друзы, атрофия и уменьшение количества клеток ПЭС, миграция пигмента, атрофия и склероз хориоидеи, утолщение мембраны Бруха — МБ), в другую — 11 глаз с «влажной» формой ВМД с преимущественно экссудативными изменениями (экссудативная отслойка ПЭС, неоваскуляризация, кровоизлияния) и формированием фиброзной ткани. Все морфологические изменения при «сухой» и «влажной» ВМД имели четкую тенденцию к повышению с возрастом (рис. 1).

Рис. 1. Частота различных типов морфологических изменений при ВМД в глазах с амилоидозом и без него в исследуемых возрастных группах (p<0,05). По горизонтали — десятилетия жизни, по вертикали — проценты.

В структурных элементах заднего отдела глаза амилоидные отложения при ВМД были обнаружены в друзах, в МБ, сосудах хориоидеи (амилоидная ангиопатия). Ультраструктурно эти отложения имели характерное для амилоидных фибрилл строение (рис. 2).

Рис. 2. Ультраструктура фибрилл амилоида во внутреннем коллагеновом слое МБ (стрелка 1) с наличием апоптозных телец (стрелки 2, 3) при локальном старческом амилоидозе с развитием ВМД. Ув. 24 000.

При «сухой» форме ВМД амилоид был выявлен в 39%, а при «влажной» форме — в 80% исследованных глаз. В МБ, содержимом мягких и твердых друз, в стенке сосудов хориоидеи при реакции с тиофлавином Т отложения амилоида давали характерное свечение. При микроскопическом исследовании глаз с «влажной» формой ВМД друзы уплощались, сливались между собой, деформируя МБ и клетки ПЭС. Вероятно, на этой стадии развития заболевания, когда амилоид уже стимулирует новообразование сосудов хориоидеи [31], офтальмоскопическая картина демонстрирует уменьшение количества друз и на первый план выступает неоваскулогенез и его последствия. Таким образом, при морфологическом исследовании при переходе от «сухой» к «влажной» форме ВМД в пораженных структурах дна глаза почти вдвое увеличивается частота амилоидоза, что позволило считать амилоидоз причастным к прогрессированию ВМД.

Особого внимания заслуживают результаты морфометрического исследования клеток ПЭС в макулярной области, показавшие достоверное уменьшение количества ядер клеток ПЭС с возрастом, причем наименьшее их число было обнаружено в глазах с ВМД и амилоидозом (см. таблицу).

Количество ядер клеток ПЭС в макулярной области при ВМД и без нее с наличием амилоидоза и без такового в разных возрастных группах Примечание. р<0,05.

Исследование препаратов головного мозга и глаз с ВМД показало сочетание локальных форм амилоидоза в 50,6% случаев, что характеризовалось содружественным отложением Аβ в сосудах и веществе головного мозга (сенильных бляшках), а также в сосудах хориоидеи и структурных элементах заднего отдела глаза (друзы, МБ, сетчатка) с типичными для Аβ гистохимическими и иммуногистохимическими характеристиками (рис. 3).

Рис. 3. Картина микропрепаратов головного мозга и глаз с ВМД. Содружественное отложение Аβ в структурных элементах глаза и головного мозга. а — свечение амилоида в стенке сосуда хориоидеи при ВМД (амилоидная ангиопатия); б — свечение амилоида в стенке церебрального сосуда (амилоидная ангиопатия); в — свечение амилоида в содержимом твердой друзы и в МБ; г — положительная Аβ1−42 иммунная реактивность сенильных бляшек при ВМД в сочетании с БА. а—в — реакция с тиофлавином Т; а—г — ув. 400.

При сочетании ВМД и БА у женщин амилоид обнаруживался в возрасте на 10 лет раньше и в 2 раза чаще, чем у мужчин. По мере старения возрастает частота сочетанного старческого амилоидоза глаза и головного мозга, а процент случаев старческого локального амилоидоза глаза наиболее высок при с БА.

Таким образом, результаты проведенного исследования продемонстрировали, что амилоидные отложения в структурных элементах заднего отдела глаза способствуют и усугубляют течение ВМД. Чаще всего в амилоидный процесс вовлекаются МБ, сосуды хориоидеи и сетчатка. Нами выявлена прямая зависимость между тяжестью патологических изменений при ВМД и частотой выявления амилоидных включений в структурах дна глаза. Более чем в половине случаев морфологические признаки ВМД сочетались с морфологическими проявлениями БА (сенильные бляшки, амилоидная ангиопатия).

Полученные нами данные, а также результаты молекулярных исследований дают возможность предположить патогенетическую общность ВМД и БА, основанную на едином метаболическом пути предшественника Аβ — АРР.

В норме трансмембранный белок APP присутствует во многих клетках, включая ПЭС, нейроны сетчатки и головного мозга. Неамилоидогенный метаболический путь АРР включает последовательное воздействие на него α- и γ-секретаз с образованием s-APPα, P3 и AICD (APP intracellular domain), участвующих в адекватном клеточном обмене. В стареющем организме под влиянием факторов риска в клетках ПЭС, нейронах сетчатки и головного мозга снижается активность протеосомно-лизосомальной системы, увеличивается количество фаголизосом, эндосом, гранул липофусцина. Указанные внутриклеточные изменения вызывают развитие окислительного стресса и цитотоксичности. В таких условиях метаболизм АРР протекает по амилоидогенному пути с образованием олигомерных, префибриллярных и в конечном счете нерастворимых фибриллярных форм Аβ, откладывающихся в сенильных бляшках головного мозга при БА, а также в слоях сетчатки, материале друз, структурах гематоретинального барьера при ВМД. Анализ современных данных, полученных при изучении молекулярно-клеточных процессов, лежащих в основе развития НДЗ, позволяет утверждать, что лейтмотивом патогенеза при ВМД и БА является агрегация β-амилоида, лежащая в основе цитотоксичности и нейродегенерации. Это позволяет, на наш взгляд, трактовать ВМД как разновидность протеинопатии — β-амилоидопатию.

Такой взгляд на проблему создает предпосылки для выработки новых стратегий и создания нейропротекторных и офтальмогериатрических препаратов нового поколения, патогенетически оправданных и воздействующих непосредственно на звенья патогенеза, включая все этапы патологической агрегации ключевого белка — Аβ, его стабильность и метаболизм.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.Е., А.Н.

Сбор и обработка материала: А.Н.

Статистическая обработка: А.Н., В.Е.

Написание текста: В.Е., А.Н.

Редактирование: В.Е.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail