В настоящее время наиболее распространенным сердечно-сосудистым заболеванием (ССЗ) в мире является эссенциальная артериальная гипертония (ЭАГ), часто приводящая к развитию тромботических осложнений, инвалидности и смерти больных. При этом в последние десятилетия отмечается увеличение доли смертельных исходов вследствие тромботических осложнений ЭАГ, особенно в молодом возрасте [1]. Среди детей и подростков ЭАГ регистрируется с частотой 2,4-18% [2]. У лиц с ЭАГ в среднем школьном возрасте случаи нарушения мозгового кровообращения отмечаются в 7%, а в возрасте 15-18 лет достигает 10% [3].

Возникновению тромбоза предшествует развитие протромботических изменений (ПТИ) в системе гемостаза, которые могут сохраняться от нескольких лет до нескольких десятилетий. В последние годы активно обсуждается роль молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к тромбозам в развитии ПТИ у пациентов с ЭАГ. Однако результаты проведенных исследований по изучению данной проблемы до настоящего времени не всегда однозначны.

Цель исследования: определить распространенность и распределение генотипов и аллелей полиморфизмов генов предрасположенности к тромбозам у подростков с ЭАГ.

Обследовали 137 подростков в возрасте 14-17 лет, которые сформировали следующие группы исследования: 1-я - 37 подростков с ЭАГ и имеющие ПТИ в системе гемостаза (средний возраст 15,6±1,2 года), 2-я - 60 подростков с ЭАГ без ПТИ (средний возраст 15,7±1,2 года), 3-я (контрольная) - 40 здоровых подростков (средний возраст 15,8±0,9 года). Группы статистически значимо не различались по возрасту и полу. Все обследованные подростки относились к одной этнической группе (русские).

В работе с подростками соблюдали этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, 2000). Диагноз ЭАГ устанавливали на основании клинико-инструментальных критериев в соответствии с современной классификацией, разработанной экспертной группой Всероссийского научного общества кардиологов и Ассоциацией детских кардиологов России (2003).

Исследование показателей коагуляции проводили на автоматическом коагулометре STA-R Evolution («Roche Diagnostics», Швейцария) с наборами реагентов фирмы «Roche» (Швейцария). Определяли протромбиновое время по A.J. Quick (1935), активированное частичное тромбопластиновое время по J. Caen и соавт. (1968), тромбиновое время по R. Biggs и R. Macfarlane (1962), концентрацию фибриногена по хронометрическому методу A. Clauss (1957), уровень растворимых фибрин-мономерных комплексов с помощью полуколичественного метода агглютинации бедной тромбоцитами цитратной плазмы с ортофенантролином по В.А. Елыкомову и А.П. Момоту (1987), используя реагенты фирмы «Технология-Стандарт» (Россия). Подростки были отнесены в группу с ПТИ, если у них имелись изменения по одному или нескольким показателям коагуляционного гемостаза. Выделение ДНК из лейкоцитов цельной венозной крови проводили с помощью реагента ДНК-экспресс-кровь фирмы «Литех» (Россия). Определяли полиморфизмы генов свертывающей - II (FII) и V (FV) факторов свертывания и фибринолитической - ингибитора активатора плазминогена 1-го типа (PAI-1) систем, а также генов ферментов фолатного цикла - 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), метионинсинтазы-редуктазы (MTRR). Типирование генов выполняли методом полимеразной цепной реакции с последующим изучением полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием комплектов реагентов SNP-экспресс («Литех», Россия) по протоколу производителя. Полученные в результате амплификации фрагменты ДНК подвергали воздействию рестрицирующих эндонуклеаз. Инкубацию проводили при температуре 37 °С в течение 3 ч. Разделение продуктов амплификации осуществляли методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле при напряженности электрического поля 10-15 В на 1 см геля. Визуализацию результатов электрофореза осуществляли с помощью ультрафиолетового трансиллюминатора Vilber Lourmat (Франция).

В исследовании использовали вычислительные методы математической статистики, реализованные в лицензионном интегрированном статистическом пакете комплексной обработки данных Statistica 6.0 Stat-Soft Inc, США (правообладатель лицензии - ФГБУ НЦ ПЗС РЧ СО РАМН). Определяли различия между группами по качественным признакам с помощью критерия &khgr;² с поправкой Йетса на непрерывность и точного критерия Фишера при численности хотя бы в одной из групп менее 5. Все различия считались статистически значимыми при р<0,05.

При исследовании полиморфных генов различные неблагоприятные генотипы выявлены у всех (100%) подростков с ЭАГ и ПТИ, у 93,3% подростков с ЭАГ без ПТИ и у 87,5% здоровых лиц.

Носительство гетерозиготной формы полиморфизма R506Q гена FV (генотип R/Q), при которой риск тромбоза повышается в 3-6 раз, выявлено по 1 случаю в каждой группе, что составило 2,7, 1,7 и 2,5% в 1, 2 и 3-й группах соответственно. Среди всех обследованных гетерозиготный полиморфизм G20210A гена FII (генотип G/A) обнаружен лишь у 1 (1,7%) подростка, отнесенного в группу с ЭАГ без ПТИ, а частота аллеля А составила 0,8%. Носителей гомозиготных вариантов полиморфных генов FV (генотип Q/Q, увеличивающий риск тромбоза в 80-90 раз) и FII (генотип А/А) ни в одной из 3 групп не выявлено. Распространенность аллеля R среди подростков 1-й группы составила 98,6%, 2-й группы - 99,2%, 3-й - 98,7%. Минорный аллель Q встречался с частотой 1,4, 0,8 и 1,3% соответственно.

Неблагоприятные генотипы 4G/4G и 5G/4G полиморфизма –675 4G/5G гена PAI-1 статистически незначимо чаще встречались в 1-й группе подростков - у 7 (18,9%) и 17 (45,9%) соответственно, а доля «дикого» генотипа 5G/5G была наименьшей по сравнению с другими группами - у 13 (35,2%). Среди подростков 2-й группы генотип 4G/4G обнаружен у 10 (16,7%), 5G/4G - у 23 (38,3%), 5G/5G - у 27 (45%). В 3-й группе у 20 (50%) лиц имелся генотип 5G/5G, а генотипы 5G/4G и 4G/4G встречались у 16 (40%) и 4 (10%) подростков соответственно. Распространенность аллелей 5G и 4G составила 58,1 и 41,9% в 1-й группе, 64,2 и 35,8% - во 2-й группе, 70 и 30% - 3-й группе (&khgr;²=2,37; df=2; р=0,31).

В результате исследования установлено, что подростки, страдающие ЭАГ и имеющие ПТИ, в 2,5 раза чаще являются носителями гетеро- и гомозиготных форм полиморфизма С677Т гена MTHFR, чем пациенты с ЭАГ без ПТИ, и в 2,8 раза чаще, чем здоровые подростки (см. таблицу).

При попарном сравнительном анализе определено, что различия по распространенности генотипов С/С и С/Т статистически значимы при сравнении 1-й и 2-й групп (&khgr;²=8,23; df=1; р=0,004 - для С/С и &khgr;²=4,46; df=1; р=0,03 - для С/Т), а также 1-й и 3-й групп (&khgr;²=10,13; df=1; р=0,001 - для С/С и &khgr;²=5,81; df=1; р=0,02 - для С/Т). Несмотря на то что распределение генотипа Т/Т в группах статистически значимо не различалось, наиболее часто гомозиготная форма полиморфизма встречалась в 1-й группе. Различий по распространенности генотипов С/С, С/Т и Т/Т не выявлено между 2-й и 3-й группами (&khgr;²=0,20; df=1; р=0,65 и &khgr;²=0,14; df=1; р=0,71 и р(F)=0,47 соответственно).

Кроме того, группы значимо различались по частотным характеристикам распределения аллелей С и Т полиморфизма С677Т (&khgr;²=11,95; df=2; р=0,003). Так, среди всех обследованных подростки из 1-й группы являлись носителями аллеля Т в 1,8 раза чаще, чем обследованные из 2-й группы (&khgr;²=7,15; df=1; р=0,01), и в 2,1 раза чаще, чем лица из 3-й группы (&khgr;²=8,52; df=1; р=0,003).

Несмотря на то что в проведенном нами исследовании распространенность неблагоприятных аллелей и генотипов полиморфизмов А1298С гена MTHFR и A66G гена MTRR у пациентов с ЭАГ и ПТИ была несколько выше, чем у подростков c ЭАГ, не имеющих ПТИ и здоровых лиц, показатели во всех группах исследования были сопоставимы с литературными данными о распространенности полиморфных генов в популяции, а значимых различий между группами не установлено.

Полиморфизмы белков системы свертывания крови, по данным литературы, встречаются у 1-4% населения [4]. Наиболее распространенными генетическими дефектами, предрасполагающими к тромбозам, являются полиморфизм R506Q гена FV и полиморфизм G20210A гена FII, которые приводят к увеличению тромбина, вследствие чего усиливаются прокоагуляционные свойства крови. В случае полиморфизма R506Q гена FV данный эффект связан с возникновением резистентности активированного FV к расщепляющему действию белка С, а при наличии полиморфизма G20210A гена FII - с усилением синтеза протромбина - основного предшественника тромбина. Распространенность гетерозиготной формы полиморфизма R506Q в европейской популяции согласно данным литературы составляет 3-8%, при венозных тромбозах - 15-60%, гомозиготной - 0,1% [5]. Частота гетерозиготной формы полиморфизма G20210A в европейской популяции составляет 2-3% и около 6% среди больных с тромбозами [6].

Проведенный сравнительный анализ показателей распространенности генотипов и аллелей полиморфных генов, указанных коагуляционных факторов крови у обследованных подростков, не выявил статистически значимых межгрупповых различий, а частотные характеристики в группах были сопоставимы с распространенностью полиморфизмов в популяции.

В настоящее время активно изучается роль полиморфизма –675 4G/5G гена PAI-1 в снижении фибринолитического потенциала крови и развитии ПТИ. Носительство аллеля 4G сопровождается повышением уровня PAI-1 в крови в результате усиления транскрипции его гена, снижением активности фибринолитической системы и увеличением риска тромбообразования в молодом возрасте (у лиц с генотипом 4G/4G выше в среднем в 1,6-1,7 раза). Распространенность генотипа 4G/4G в европейских популяциях составляет от 5-8 до 32-38% [7].

В проведенном нами исследовании статистически значимых межгрупповых различий в распределении генотипов 5G/5G, 5G/4G и 4G/4G не выявлено (&khgr;²=1,79; df=2; р=0,41, &khgr;²=0,57; df=2; р=0,75 и &khgr;²=1,33; df=2; р=0,52 соответственно), поэтому роль данного полиморфизма в снижении фибринолитического потенциала крови и развитии ПТИ у подростков с ЭАГ, по нашему мнению, маловероятна.

Известно, что независимым фактором риска развития тромбозов является гипергомоцистеинемия (ГГЦ). Показана связь между возникновением инфаркта миокарда, инсульта и высоким уровнем гомоцистеина (ГЦ) в плазме. Важным фактором, способствующим увеличению ГЦ в крови, является наследственная предрасположенность, обусловленная дефицитом ферментов фолатного обмена (MTHFR, MTRR) у носителей низкофункциональных вариантов генов. Наибольшее клиническое значение имеет полиморфизм С677Т гена MTHFR, который в популяции встречается с частотой от 5 до 15% в гомозиготной форме и до 60% в гетерозиготной [8].

Анализ полученных данных показал, что у подростков с ЭАГ и ПТИ неблагоприятные аллели и генотипы полиморфизма С677Т выявляются чаще, чем у пациентов с ЭАГ без ПТИ и у здоровых подростков.

При сравнении полученных нами результатов с данными литературы о распространенности С677Т в популяции оказалось, что в нашем исследовании среди подростков с ЭАГ и ПТИ распространенность генотипа С/Т была несколько выше. Между тем перечисленные показатели среди подростков с ЭАГ без ПТИ и здоровых лиц были сопоставимы с популяционными [8].

Выявленные различия по распространенности неблагоприятных генотипов и аллелей между исследуемыми группами могут свидетельствовать, что полиморфизм С677Т является фактором риска развития ПТИ в системе гемостаза у подростков с ЭАГ.

Согласно данным литературы в популяции достаточно широко распространены также полиморфизмы А1298С гена MTHFR (аллель С - около 36%) и A66G гена MTRR (А/G - 45-50%, G/G - 15-25%) [9]. Данные об их роли в развитии ГГЦ и ССЗ весьма противоречивы. Одни авторы подтверждают связь между носительством указанных полиморфных генов и развитием ГГЦ и ССЗ [10], другие опровергают этот факт [11]. Отсутствие значимых различий по распространенности неблагоприятных аллелей и генотипов этих двух полиморфных генов дает нам основания предполагать, что данные полиморфизмы не влияют на состояние системы коагуляционного гемостаза у подростков с ЭАГ.

В результате проведенного исследования установлено, что среди всех исследованных молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к тромбозам только полиморфизм С677Т может выступать в качестве фактора риска развития ПТИ в системе гемостаза у подростков с ЭАГ, увеличивая риск возникновения тромботических осложнений в старшем возрасте. Определение молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к тромбозам у подростков с ЭАГ, по нашему мнению, необходимо активно использовать для формирования группы риска, что позволит персонализировать подход к диагностике, профилактике и лечению возникших гемокоагуляционных изменений, а также снизить заболеваемость и смертность от тромботических осложнений ЭАГ в дальнейшем.