Морфологические маркеры патофизиологических изменений отростков нейронов в остром посттравматическом периоде диффузного аксонального повреждения мозга

Читать метаданные

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

установить морфологические маркеры патофизиологических изменений отростков нейронов в остром (до 36 ч) посттравматическом периоде диффузного аксонального повреждения (ДАП) головного мозга для целей экспертной практики. Провели гистологическое исследование ствола мозолистого тела трупов 66 погибших вследствие ДАП (основная группа) и 25 умерших от различных ненасильственных и насильственных, исключая травму головы, причин (группа контроля). При световой микроскопии с применением иммуногистохимического исследования при ДАП острого периода установлены морфологические маркеры конкретных патофизиологических изменений отростка нейрона. Неровные контуры отростков свидетельствовали о смещении элементов цитоскелета, участки вакуолизации цитоплазмы отростков — о нарушении внутриклеточного транспорта, обусловленного изменением проницаемости с сохранением целостности оболочки отростка без механического его разъединения, неравномерная толщина (3,9±1,6 мкм) отростков, варикозные и колбовидные их утолщения являлись проявление очагового отека отростка нейрона и сжатия цитоскелета в результате ионно-ферментативных нарушений, неравномерная окраска, участки фрагментарного уплотнения нейрофиламентов указывали на зоны деформации и сжатия цитоскелета, зоны зернисто-глыбчатого распада и фибриллолиза нейрофиламентов — на разрушение цитоскелета. Изменения отростков нейронов возникают вследствие полиэтиологического общепатологического процесса и не являются дифференциально-диагностическим критерием ДАП.

Ключевые слова:

черепно-мозговая травма

ДАП острого периода

отростки нейронов

морфологические маркеры ДАП

Авторы:

Колударова Е.М.

ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы»

ORCID: 0000-0003-1989-7789

Тучик Е.С.

ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы»;
ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

ORCID: 0000-0003-4330-2327

Зориков О.В.

ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы»

ORCID: 0000-0002-1396-7881

Дата поступления:

11.05.2022

Дата принятия в печать:

08.06.2022

Список литературы:

Ромодановский П.О. Некоторые аспекты диффузного аксонального повреждения мозга при травме головы. Судебно-медицинская экспертиза. 2013;3:18-20.
Xiong Y, Mahmood A, Chopp M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 2013;14(2):128-142. https://doi.org/10.1038/nrn3407
Ziogas NK, Koliatsos VE. Primary traumatic axonopathy in mice subjected to impact acceleration: a reappraisal of pathology and mechanisms with high-resolution anatomical methods. Journal of Neuroscience. 2018;38(16):4031-4047. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2343-17.2018
Liu S, Yin F, Zhang J, Qian Y. The role of calpains in traumatic brain injury. Brain Injury. 2014;28(2):133-337. https://doi.org/10.3109/02699052.2013.860479
King AE, Southam KA, Dittman J, Vickers JC. Excitotoxin-induced caspase-3 activation and microtubule disintegration in axons is inhibited by taxol. Acta Neuropathologica Communications. 2013;1:59. https://doi.org/10.1186/2051-5960-1-59
Tang-Schomer MD, Johnson VE, Baas PW, Stewart W, Smith DH. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Experimental Neurology. 2012;233(1):364-372. https://doi.org/10.1016/j.expneurol.2011.10.030
Kirkcaldie MTK, Collins JM. The axon as a physical structure in health and acute trauma. Journal of Chemical Neuroanatomy. 2016;76(A):9-18. https://doi.org/10.1016/j.jchemneu.2016.05.006
Tran HT, Ferla FM, Holtzman DM, Brody DL. Controlled cortical impact traumatic brain injury in 3xTg-AD mice causes acute intra-axonal amyloid-β accumulation and independently accelerates the development of tau abnormalities. Journal of Neuroscience. 2011;31(26):9513-9525. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0858-11.2011
Büki A, Povlishock JT. All roads lead to disconnection? Traumatic axonal injury revisited. Acta Neurochirurgica. 2006;148(2):181-193. https://doi.org/10.1007/s00701-005-0674-4
Колударова Е.М., Тучик Е.С., Зориков О.В. Аксотомия в посмертной диагностике диффузного аксонального повреждения головного мозга. Судебно-медицинская экспертиза. 2021;64(2):14-17. https://doi.org/10.17116/sudmed20216402114
Березовский Д.П, Шай А.Н., Оганесян Н.С, Шигеев С.В., Горностаев Д.В., Пиголкин Ю.И., Боронтова А.Э. Морфологическая и иммуногистохимическая оценка белого вещества головного мозга при ожоговой травме. Вестник судебной медицины. 2020;9(4):19-23.
Gu C. Rapid and reversible development of axonal varicosities: a new form of neural plasticity. Frontiers in Molecular Neuroscience. 2021;14:610857. https://doi.org/10.3389/fnmol.2021.610857
Коржевский Д.Э., Гилерович Е.Г., Кирик О.В., Григорьев И.П., Сухорукова Е.Г., Алексеева О.С., Колос Е.А., Гусельникова В.В., Карпенко М.Н., Безнин Г.В. Иммуногистохимическое исследование головного мозга. Под ред. Коржевского Д.Э. СПб.: СпецЛит; 2016.

Закрыть метаданные

Диффузное аксональное повреждение (ДАП) головного мозга (ГМ) характеризуется первичным повреждением аксонов [1], изучение которых в остром посттравматическом периоде в основном проводили на экспериментальных моделях животных.

Для воспроизведения аспектов ДАП за последние три десятилетия были предложены разные модели на животных [2], на которых отростки нейронов изучали с использованием высокотехнологичных методов микроскопии [3]. Исследователи установили разнообразные патофизиологические изменения в отростках нейронов [4, 5], некоторые из них были визуализированы. Авторы привели доказательства того, что морфологическим маркером смещения субаксолеммального цитоскелета являются волнообразные аксоны [6], повреждения цитоскелета — зоны уплотнения нейрофиламентов [7], нарушения аксоплазматического транспорта — зоны утолщений и варикозных расширений аксона [8].

Существующая гипотеза механического разрыва отростков нейронов не подтвердилась ни в момент получения ДАП на экспериментальных моделях [9], ни в первые часы посттравматического периода при исследованиях трупов погибших лиц [10]. Доказано, что ДАП характеризуется аксонопатией, обусловленной протеолитической деградацией цитоскелета, которая, как установлено N.K. Ziogas и V.E. Koliatsos [3], прогрессирует в посттравматический период от 3 до 24 ч и необратимо приводит к аксотомии. Однако временны́е показатели морфологических маркеров конкретных изменений отростков нейронов и аксотомии после получения травмы головы у исследователей противоречивы.

При том что современные модели на крысах имитировали проявления острого периода ДАП, полученные результаты исследований являются ориентировочными для дифференциальной диагностики и определения давности этой формы черепно-мозговой травмы и малопригодны для экспертной практики, поскольку для выявления большинства предложенных маркеров изменений отростков нейронов требуется особая материально-техническая база. Кроме того, считавшиеся специфичными для ДАП маркеры повреждений отростков нейронов были обнаружены при различных внечерепных травматических [11] и нетравматических патологических процессах [12].

Противоречивость опубликованных данных исследований определила цель настоящего исследования — установить морфологические маркеры патофизиологических изменений отростков нейронов в остром (до 36 ч) посттравматическом периоде ДАП мозга для целей экспертной практики.

Материал и методы

Провели гистологическое исследование ствола мозолистого тела (МТ) 51 мужчины и 15 женщин, погибших в возрасте от 16 до 85 лет по причине ДАП в посттравматический период до 36 ч.

Группой контроля служили МТ 18 мужчин и 7 женщин, умерших в возрасте от 10 до 88 лет вследствие различных ненасильственных и насильственных (исключая травму головы) причин: сердечно-сосудистых заболеваний (кардиомиопатия, ишемическая болезнь сердца, врожденная аномалия сердца, разрыв аневризмы артерии основания мозга), острых воспалительных заболеваний легких (пневмония) и почек (гнойный пиелонефрит), онкологического заболевания (остеосаркома плечевой кости), ожоговой болезни, механической асфиксии (утопление, повешение), острых отравлений алкоголем, наркотическими и психотропными средствами.

Подготовку материала для гистологического исследования осуществляли в соответствии с общепринятой методикой по стандартным протоколам. Изготавливали сагиттальные и фронтальные срезы ствола МТ толщиной 4—5 мкм. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартным процедурам. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование выполняли в строгом соответствии с протоколом производителя в стандартизированных условиях с цитоспецифическими и функциональными маркерами для исследования ГМ человека [13]: антителами к нейрофиламентам нейронов (NFP) [Neurofilament (2F11) Mouse Monoclonal Antibody (Cell Marque Corporation)] в разведении 1:300; к β-APP белку в нейронах [Amyloid beta (A4) precurcor protein Rabbit Monoclonal Antibody (Spring Bioscience)] в разведении 1:100, к основному белку миелина (MBP) [Myelin Basic Protein Rabbit Polyclonal Antibody (Cell Marque Corporation)] в разведении 1:200; с системой визуализации ultraVIEM Universal DAB (Ventana Medical Systems), срезы докрашивали гематоксилином II (Ventana Medical Systems). Для правильной интерпретации результатов ИГХ-исследования проводили позитивный и негативный контроли. Гистологические препараты исследовали в проходящем свете под микроскопом Axio Imager.A2 (Zeiss) с увеличением 40, 100, 200, 400, 630 и 1000. Морфометрию осуществляли с помощью цифровой камеры AxioCam HRc с максимальным разрешением 3600×3030 пикселей и программного обеспечения ZEN lite 2012 (Carl Zeiss).

Морфологические изменения отростков нейронов оценивали по следующим параметрам: целостность оболочки отростка нейрона, его контур и толщина, состояние нейрофиламентов и цитоплазмы отростка, признаки демиелинизации, наличие ретракционных шаров.

Статистический анализ проводили с помощью табличного редактора Microsoft Excel (2016) и пакета прикладных программ Statistica 13.3 for Windows.

Результаты и обсуждение

При световой микроскопии с применением ИГХ-исследования при ДАП посттравматического периода до 36 ч установили следующие морфологические маркеры патофизиологических изменений отростков нейронов:

— неровные контуры отростков (ИГХ с антителами NFP и β-APP), которые свидетельствовали о смещении элементов цитоскелета;

— участки вакуолизации цитоплазмы отростков (ИГХ с антителами к β-APP) — указывали на нарушения внутриклеточного транспорта;

— сохраненная целостность оболочки отростка (ИГХ с антителами NFP) — удостоверяла, что внутриклеточные нарушения обусловлены изменением проницаемости оболочки отростка нейрона без механического его разъединения;

— неравномерная толщина (3,9±1,6 мкм) отростков, варикозные и колбовидные их утолщения, иммунопозитивные с антителами NFP и β-APP, представленные на сагиттальных срезах округлыми образованиями с неровными контурами размером 5,7±1,9 мкм, которые являлись проявлением очагового отека отростка нейрона и сжатия цитоскелета в результате внутриклеточных ионно-ферментативных нарушений;

— неравномерная окраска, участки фрагментарного уплотнения нейрофиламентов (ИГХ с антителами NFP) — указывали на зоны деформации и сжатия элементов цитоскелета;

— зоны зернисто-глыбчатого распада и фибриллолиза нейрофиламентов с участками запустевания цитоскелета отростков, чередованием иммунопозитивных и иммунонегативных областей с антителами к NFP — являлись признаками разрушения цитоскелета отростка.

Указанные морфологические изменения выявили в разные сроки острого посттравматического периода ДАП лишь в некоторых отростках нейронов, расположенных среди отростков с сохранной на светооптическом уровне гистоструктурой. Установленный полиморфизм отростков нейронов, представленный сочетанием различных патофизиологических изменений морфологических маркеров после, свидетельствует о гетерогенности и стадийности развивающихся во времени посттравматических нейровоспалительных процессов.

В посттравматическом периоде ДАП до 36 ч MBP-иммунонегативных участков в качестве маркера демиелинизации нейронов не выявили. Ретракционные шары как морфологический маркер аксотомии отсутствовали.

В группе контроля независимо от возраста умерших, вида и причины смерти, длительности агонального периода: среди неизмененных отростков обнаружили отростки нейронов с неровными контурами, неравномерной толщины (2,7±0,9 мкм) с участками варикозных и колбовидных утолщений, которые на сагиттальных срезах были представлены округлыми образованиями с неровными контурами размером 3,7±0,4 мкм; некоторые отростки имели неравномерную окраску цитоплазмы с зонами ее вакуолизации, участки фрагментарного уплотнения нейрофиламентов с признаками их разрушения, проявляющимися в виде чередования иммунопозитивных и иммунонегативных зон с антителами к NFP.

Наряду с этим при окраске срезов гематоксилином и эозином и ИГХ с антителами NFP были выявлены ретракционные шары и нейроны с признаками демиелинизации (ИГХ с антителами MBP) у мужчины 73 лет, смерть которого наступила вследствие отека ГМ и гнойной пневмонии на 26-е сутки стационарного лечения после ожоговой травмы.

Статистически значимые различия толщины продольных и поперечных срезов отростков нейронов при ДАП и в группе контроля [t-критерий Стьюдента 2,99 (p=0,003) при сравнении толщины продольного среза; 4,15 (p=0,000055) при сравнении толщины поперечного среза и критическом (p=0,05) значении 1,977] демонстрируют, что при ДАП патологический процесс в отростках нейронов прогрессирует быстрее, чем при иных видах смерти.

Таким образом, морфологические изменения отростков нейронов, выявленные в остром (до 36 ч) посттравматическом периоде ДАП, были сходными с изменениями в отростках нейронов при иных причинах смерти и не могут рассматриваться как маркеры их повреждений травматического генеза.

Кроме того, ретракционные шары и участки демиелинизации отростков нейронов, считавшиеся маркерами ДАП, но обнаруженные при ожоговой травме, — проявления полиэтиологического общепатологического процесса, прогрессирование которого на фоне различных мультифокальных нарушений в каскадно задействованных клеточных структурах ГМ ведет к необратимым изменениям, разъединению отростков нейронов и аксотомии.

Заключение

При ДАП острого (до 36 ч) посттравматического периода при световой микроскопии плоскостных срезов гистологических препаратов с применением традиционных гистологических методик установлены морфологические маркеры конкретных патофизиологических изменений основных структурных компонентов отростка нейрона, которые возникают вследствие неспецифического общепатологического процесса, быстро прогрессирующего при ДАП. В этой связи проведение дифференциальной диагностики ДАП следует осуществлять на основании комплексной экспертной оценки морфологических маркеров изменений отростков нейронов с учетом сопутствующих ДАП иных травм, отравлений, соматических заболеваний, фоновых состояний организма, оказывающих влияние на гемоциркуляторные, метаболические и другие процессы в ГМ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.