Диффузное аксональное повреждение (ДАП) головного мозга (ГМ) характеризуется первичным повреждением аксонов [1], изучение которых в остром посттравматическом периоде в основном проводили на экспериментальных моделях животных.

Для воспроизведения аспектов ДАП за последние три десятилетия были предложены разные модели на животных [2], на которых отростки нейронов изучали с использованием высокотехнологичных методов микроскопии [3]. Исследователи установили разнообразные патофизиологические изменения в отростках нейронов [4, 5], некоторые из них были визуализированы. Авторы привели доказательства того, что морфологическим маркером смещения субаксолеммального цитоскелета являются волнообразные аксоны [6], повреждения цитоскелета — зоны уплотнения нейрофиламентов [7], нарушения аксоплазматического транспорта — зоны утолщений и варикозных расширений аксона [8].

Существующая гипотеза механического разрыва отростков нейронов не подтвердилась ни в момент получения ДАП на экспериментальных моделях [9], ни в первые часы посттравматического периода при исследованиях трупов погибших лиц [10]. Доказано, что ДАП характеризуется аксонопатией, обусловленной протеолитической деградацией цитоскелета, которая, как установлено N.K. Ziogas и V.E. Koliatsos [3], прогрессирует в посттравматический период от 3 до 24 ч и необратимо приводит к аксотомии. Однако временны́е показатели морфологических маркеров конкретных изменений отростков нейронов и аксотомии после получения травмы головы у исследователей противоречивы.

При том что современные модели на крысах имитировали проявления острого периода ДАП, полученные результаты исследований являются ориентировочными для дифференциальной диагностики и определения давности этой формы черепно-мозговой травмы и малопригодны для экспертной практики, поскольку для выявления большинства предложенных маркеров изменений отростков нейронов требуется особая материально-техническая база. Кроме того, считавшиеся специфичными для ДАП маркеры повреждений отростков нейронов были обнаружены при различных внечерепных травматических [11] и нетравматических патологических процессах [12].

Противоречивость опубликованных данных исследований определила цель настоящего исследования — установить морфологические маркеры патофизиологических изменений отростков нейронов в остром (до 36 ч) посттравматическом периоде ДАП мозга для целей экспертной практики.

Материал и методы

Провели гистологическое исследование ствола мозолистого тела (МТ) 51 мужчины и 15 женщин, погибших в возрасте от 16 до 85 лет по причине ДАП в посттравматический период до 36 ч.

Группой контроля служили МТ 18 мужчин и 7 женщин, умерших в возрасте от 10 до 88 лет вследствие различных ненасильственных и насильственных (исключая травму головы) причин: сердечно-сосудистых заболеваний (кардиомиопатия, ишемическая болезнь сердца, врожденная аномалия сердца, разрыв аневризмы артерии основания мозга), острых воспалительных заболеваний легких (пневмония) и почек (гнойный пиелонефрит), онкологического заболевания (остеосаркома плечевой кости), ожоговой болезни, механической асфиксии (утопление, повешение), острых отравлений алкоголем, наркотическими и психотропными средствами.

Подготовку материала для гистологического исследования осуществляли в соответствии с общепринятой методикой по стандартным протоколам. Изготавливали сагиттальные и фронтальные срезы ствола МТ толщиной 4—5 мкм. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартным процедурам. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование выполняли в строгом соответствии с протоколом производителя в стандартизированных условиях с цитоспецифическими и функциональными маркерами для исследования ГМ человека [13]: антителами к нейрофиламентам нейронов (NFP) [Neurofilament (2F11) Mouse Monoclonal Antibody (Cell Marque Corporation)] в разведении 1:300; к β-APP белку в нейронах [Amyloid beta (A4) precurcor protein Rabbit Monoclonal Antibody (Spring Bioscience)] в разведении 1:100, к основному белку миелина (MBP) [Myelin Basic Protein Rabbit Polyclonal Antibody (Cell Marque Corporation)] в разведении 1:200; с системой визуализации ultraVIEM Universal DAB (Ventana Medical Systems), срезы докрашивали гематоксилином II (Ventana Medical Systems). Для правильной интерпретации результатов ИГХ-исследования проводили позитивный и негативный контроли. Гистологические препараты исследовали в проходящем свете под микроскопом Axio Imager.A2 (Zeiss) с увеличением 40, 100, 200, 400, 630 и 1000. Морфометрию осуществляли с помощью цифровой камеры AxioCam HRc с максимальным разрешением 3600×3030 пикселей и программного обеспечения ZEN lite 2012 (Carl Zeiss).

Морфологические изменения отростков нейронов оценивали по следующим параметрам: целостность оболочки отростка нейрона, его контур и толщина, состояние нейрофиламентов и цитоплазмы отростка, признаки демиелинизации, наличие ретракционных шаров.

Статистический анализ проводили с помощью табличного редактора Microsoft Excel (2016) и пакета прикладных программ Statistica 13.3 for Windows.

Результаты и обсуждение

При световой микроскопии с применением ИГХ-исследования при ДАП посттравматического периода до 36 ч установили следующие морфологические маркеры патофизиологических изменений отростков нейронов:

— неровные контуры отростков (ИГХ с антителами NFP и β-APP), которые свидетельствовали о смещении элементов цитоскелета;

— участки вакуолизации цитоплазмы отростков (ИГХ с антителами к β-APP) — указывали на нарушения внутриклеточного транспорта;

— сохраненная целостность оболочки отростка (ИГХ с антителами NFP) — удостоверяла, что внутриклеточные нарушения обусловлены изменением проницаемости оболочки отростка нейрона без механического его разъединения;

— неравномерная толщина (3,9±1,6 мкм) отростков, варикозные и колбовидные их утолщения, иммунопозитивные с антителами NFP и β-APP, представленные на сагиттальных срезах округлыми образованиями с неровными контурами размером 5,7±1,9 мкм, которые являлись проявлением очагового отека отростка нейрона и сжатия цитоскелета в результате внутриклеточных ионно-ферментативных нарушений;

— неравномерная окраска, участки фрагментарного уплотнения нейрофиламентов (ИГХ с антителами NFP) — указывали на зоны деформации и сжатия элементов цитоскелета;

— зоны зернисто-глыбчатого распада и фибриллолиза нейрофиламентов с участками запустевания цитоскелета отростков, чередованием иммунопозитивных и иммунонегативных областей с антителами к NFP — являлись признаками разрушения цитоскелета отростка.

Указанные морфологические изменения выявили в разные сроки острого посттравматического периода ДАП лишь в некоторых отростках нейронов, расположенных среди отростков с сохранной на светооптическом уровне гистоструктурой. Установленный полиморфизм отростков нейронов, представленный сочетанием различных патофизиологических изменений морфологических маркеров после, свидетельствует о гетерогенности и стадийности развивающихся во времени посттравматических нейровоспалительных процессов.

В посттравматическом периоде ДАП до 36 ч MBP-иммунонегативных участков в качестве маркера демиелинизации нейронов не выявили. Ретракционные шары как морфологический маркер аксотомии отсутствовали.

В группе контроля независимо от возраста умерших, вида и причины смерти, длительности агонального периода: среди неизмененных отростков обнаружили отростки нейронов с неровными контурами, неравномерной толщины (2,7±0,9 мкм) с участками варикозных и колбовидных утолщений, которые на сагиттальных срезах были представлены округлыми образованиями с неровными контурами размером 3,7±0,4 мкм; некоторые отростки имели неравномерную окраску цитоплазмы с зонами ее вакуолизации, участки фрагментарного уплотнения нейрофиламентов с признаками их разрушения, проявляющимися в виде чередования иммунопозитивных и иммунонегативных зон с антителами к NFP.

Наряду с этим при окраске срезов гематоксилином и эозином и ИГХ с антителами NFP были выявлены ретракционные шары и нейроны с признаками демиелинизации (ИГХ с антителами MBP) у мужчины 73 лет, смерть которого наступила вследствие отека ГМ и гнойной пневмонии на 26-е сутки стационарного лечения после ожоговой травмы.

Статистически значимые различия толщины продольных и поперечных срезов отростков нейронов при ДАП и в группе контроля [t-критерий Стьюдента 2,99 (p=0,003) при сравнении толщины продольного среза; 4,15 (p=0,000055) при сравнении толщины поперечного среза и критическом (p=0,05) значении 1,977] демонстрируют, что при ДАП патологический процесс в отростках нейронов прогрессирует быстрее, чем при иных видах смерти.

Таким образом, морфологические изменения отростков нейронов, выявленные в остром (до 36 ч) посттравматическом периоде ДАП, были сходными с изменениями в отростках нейронов при иных причинах смерти и не могут рассматриваться как маркеры их повреждений травматического генеза.

Кроме того, ретракционные шары и участки демиелинизации отростков нейронов, считавшиеся маркерами ДАП, но обнаруженные при ожоговой травме, — проявления полиэтиологического общепатологического процесса, прогрессирование которого на фоне различных мультифокальных нарушений в каскадно задействованных клеточных структурах ГМ ведет к необратимым изменениям, разъединению отростков нейронов и аксотомии.

Заключение

При ДАП острого (до 36 ч) посттравматического периода при световой микроскопии плоскостных срезов гистологических препаратов с применением традиционных гистологических методик установлены морфологические маркеры конкретных патофизиологических изменений основных структурных компонентов отростка нейрона, которые возникают вследствие неспецифического общепатологического процесса, быстро прогрессирующего при ДАП. В этой связи проведение дифференциальной диагностики ДАП следует осуществлять на основании комплексной экспертной оценки морфологических маркеров изменений отростков нейронов с учетом сопутствующих ДАП иных травм, отравлений, соматических заболеваний, фоновых состояний организма, оказывающих влияние на гемоциркуляторные, метаболические и другие процессы в ГМ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.