Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Сидорова Н.А.

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России

Попов В.Л.

ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России

Лаврукова О.С.

ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет»

Особенности физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза костных останков

Авторы:

Сидорова Н.А., Попов В.Л., Лаврукова О.С.

Подробнее об авторах

Просмотров: 1044

Загрузок: 21


Как цитировать:

Сидорова Н.А., Попов В.Л., Лаврукова О.С. Особенности физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза костных останков. Судебно-медицинская экспертиза. 2021;64(5):41‑45.
Sidorova NA, Popov VL, Lavrukova OS. Features of physiological groups of microorganisms — participants in the diagenesis of bone remains. Forensic Medical Expertise. 2021;64(5):41‑45. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/sudmed20216405141

Рекомендуем статьи по данной теме:
Пра­во­вые и су­деб­но-ме­ди­цин­ские проб­ле­мы пос­мер­тно­го до­норства. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(3):5-9
При­чин­но-следствен­ные свя­зи в су­деб­ной ме­ди­ци­не в слу­ча­ях ос­трых ки­шеч­ных ин­фек­ций. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(3):19-23
Диаг­нос­ти­чес­кие кри­те­рии при­чи­ны смер­ти от действия низ­кой тем­пе­ра­ту­ры на воз­ду­хе и в во­де, ус­та­нав­ли­ва­емые с по­мощью тра­ди­ци­он­ных ме­то­дов эк­спертно­го ис­сле­до­ва­ния. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(3):29-33
Ят­ро­ген­ная па­то­ло­гия или ред­кая бо­лезнь?. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(3):45-49
Су­деб­но-ме­ди­цин­ская ха­рак­те­рис­ти­ка слу­ча­ев утоп­ле­ния в Рос­сий­ской Фе­де­ра­ции с 2013 по 2022 год. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(4):11-15
Ин­но­ва­ции в су­деб­ной ме­ди­ци­не: дос­то­вер­ность, до­ка­за­тель­ность и эф­фек­тив­ность про­во­ди­мых эк­спер­тиз в ус­ло­ви­ях чрез­вы­чай­ной си­ту­ации при мас­со­вой ги­бе­ли лю­дей. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(4):22-26
Ана­лиз де­фек­тов ока­за­ния ме­ди­цин­ской по­мо­щи де­тям по ма­те­ри­алам ко­мис­си­он­ных су­деб­но-ме­ди­цин­ских эк­спер­тиз, вы­пол­нен­ных в Рес­пуб­ли­ке Уз­бе­кис­тан. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(5):15-18
О со­вер­шенство­ва­нии нор­ма­тив­но­го ре­гу­ли­ро­ва­ния под­го­тов­ки кад­ров спе­ци­алис­тов в сфе­ре го­су­дарствен­ной су­деб­но-ме­ди­цин­ской де­ятель­нос­ти. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(5):62-66
О не­об­хо­ди­мос­ти раз­ра­бот­ки ме­ди­цин­ских кри­те­ри­ев при­чин­но-следствен­ной свя­зи по де­лам о не­над­ле­жа­щем ока­за­нии ме­ди­цин­ской по­мо­щи. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(6):5-11
Из­ме­не­ния в нор­ма­тив­ном ре­гу­ли­ро­ва­нии су­деб­но-ме­ди­цин­ской эк­спертной де­ятель­нос­ти в 2024 го­ду и что при этом не­об­хо­ди­мо знать вра­чам — анес­те­зи­оло­гам-ре­ани­ма­то­ло­гам, учас­тву­ющим в про­ве­де­нии ком­плексных су­деб­но-ме­ди­цин­ских эк­спер­тиз. Анес­те­зи­оло­гия и ре­ани­ма­то­ло­гия. 2024;(6):104-109

Установление постмортального интервала относится к одной из важных задач судебно-медицинской экспертизы. Как правило, для его оценки учитывают интенсивность развития трупных явлений. При отсутствии мягких тканей единственным источником, по которому можно идентифицировать эксгумированные останки или судить о сроках давности наступления смерти (ДНС), остаются кости. При длительном нахождении в природных условиях костная ткань подвергается сильной деградации, вызванной комплексом абиотических и биотических факторов среды, включая деятельность микроорганизмов. Такой процесс, в результате которого мягкие ткани разлагаются, а скелет подвергается постепенному разрушению, называют диагенезом [1, 2]. В статье термин «диагенез» используется для описания естественного процесса, который претерпевают фрагменты скелета в окружающей среде [3].

Экспериментально доказано, что микроорганизмы, участвующие в скелетировании, представляют собой очень сложное биологическое сообщество с разнообразными и сменяющимися видами, которые группируются по признакам экологического характера [4]. Микробная активность в процессе скелетирования прямо зависит от факторов среды: концентрации кислорода, влажности, окислительно-восстановительных условий и температуры [5, 6]. Деятельность микроорганизмов в процессах деградации костей оказывает сильное влияние не только на химический состав костной ткани, но и на ее микроструктуру [7, 8].

Цель работы — изучение разнообразия физиологических групп микроорганизмов, контролирующих трансформацию костных останков в природе.

Материал и методы

В качестве экспериментального материала использовали труп кролика Oryctolagus sp. Его поместили 08.08.17 на специально оборудованную площадку в природных условиях для развития процессов разложения. С 6-го месяца от начала эксперимента (27.01.18) заложили модельные опыты по диагенезу костей с участием специфических физиологических групп микроорганизмов. Для этого фрагменты костей в лабораторных условиях разместили в нестерильной увлажненной огородной почве с целью создания эффекта «почвенной ловушки» для микроорганизмов, участвующих в разложении костной ткани. Модельные опыты проводили при разных температурных условиях: 37; 21 и 5 °C. Общая продолжительность эксперимента составила 14 мес — с 08.08.17 по 28.10.18.

Все эксперименты проводили в соответствии с международными этическими нормами, изложенными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Рекомендации для врачей по проведению биомедицинских исследований на людях» и в Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, а также с требованиями, приведенными в приказе Минздрава СССР от 12.08.77 №755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» и других нормативных документах (заключение Комитета по медицинской этике при МЗиСР РК и Петрозаводском государственном университете №35 от 6 ноября 2015 г.).

Микрофлору с фрагментов костей получали методом смывов с помощью стерильных тампонов. Смывы с поверхности отбирали рандомно от 3 до 5 образцов. Микробиологический анализ проводили сразу после отбора образцов. Для этого пробы суспензировали в изотоническом растворе натрия хлорида и по 0,1 мл инокулировали в элективные питательные среды, предназначенные для развития узкой группы микроорганизмов, выполняющих определенную функцию в процессе диагенеза. Среды для получения накопительных культур физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза, их метаболитов и представителей доминантных родов представлены в табл. 1. Для преимущественного выделения из смывов с поверхности костей спорообразующих аммонифицирующих бактерий предварительно проводили пастеризацию отобранных смывов (прогревание при температуре 80 °C в течение 10 мин), при этом вегетативные клетки погибали и сохранялись только спорогенные бактерии [9]. С учетом принадлежности выделяемых микробов к мезофилам накопительные культуры получали при комнатной температуре в диапазоне от 24±3 до 37±1 °C [10]. Учет количества представителей определенной физиологической группы проводили методом предельных разведений с использованием таблицы Мак-Креди [11].

Таблица 1. Соотношение физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза: среды для получения накопительных культур, метаболиты, доминантные роды

Физиологическая группа [5]

Питательная среда

Метаболиты

Представитель доминантного рода

Уксусно-кислые бактерии

Элективная среда с 2% C2H4O2

CH3COOH

Acetobacter

Молочно-кислые гомоферментативные бактерии

Питательная среда на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата

CH3CHOHCOOH

Streptococcus, Lactobacillus

Молочно-кислые гетероферментативные бактерии

Эндо

CH3CHOHCOOH,

COOH(CH2)2COOH,

CH3COOH,

CH3CH2OH

Escherichia, Leuconostoc

Аммонификаторы (аэробы)

Мясопептонный агар (МПА)

NH3, H2S

Pseudomonas

Proteus

Аммонификаторы (анаэробы)

Мясопептонный бульон (МПб)

NH3, H2S

Clostridium

Спорообразующие аммонификаторы

Мишустина

NH3, H2S, C8H7N

Bacillus

Нитрификаторы

Виноградского

I фазы нитрификации

HNO2

Nitrosomonas, Nitrosolobus, Nitrosococcus, Nitrosospira

Виноградского

II фазы нитрификации

HNO3

Nitrobacter, Nitrospina

Азотфиксаторы (аэробы)

Эшби

NH3

Azotobacter

Азотфиксаторы (анаэробы)

Жидкая среда Виноградского

CH3(CH2)2COOH

CH3COOH

CO2

Clostridium

Анаэробные деструкторы клетчатки

Имшеницкого

CH3(CH2)2COOH

Cytophaga, Cellvibrio, Cellfalcicula, Sorangium, Polyangium

Денитрифицирующие бактерии

Гильтая

NH3

Achromobacter, Pseudomonas

Десульфатирующие бактерии

Ван-Дельдена

H2S, FeS

Desulfovibrio

Тионовые бактерии

Якобсона

Соединения серы

Thiobacillus

Железобактерии

Дрожжевой бульон для железобактерий, двухкомпонентная железосодержащая среда для серобактерий

Fe(OH)3

Leptothrix, Thiobacillus, Sphaerotilus

При исследовании извлеченных из почвы костей применяли субъективные (визуальные) методы: учитывали интенсивность протекания гнилостных процессов, отсутствие на костях мягких тканей, состояние костной пластинки, цвет костей. С помощью прибора 4В1 pH-метр оценивали изменение абиотических факторов в почве и трупе — морфологические и физико-химические свойства (кислотность, влажность, температура). Для наблюдения за интенсивностью разложения трупа и изменениями костной ткани проводили макроскопический анализ, в процессе которого фиксировали гнилостные изменения трупа, цвет и структуру костей. Все изменения записывали и фотографировали.

Результаты и обсуждение

Интенсивность гнилостной трансформации и изменение биотических и абиотических факторов среды на примере трупа и почвы проследили с 09.08.17 по 09.09.17 (до развития полного скелетирования). Результаты описания интенсивности гниения трупа представлены в табл. 2.

Таблица 2. Интенсивность гнилостных процессов и изменение биотических и абиотических факторов среды

Дата

Признаки интенсивности гниения

Биотические факторы

Абиотические факторы

трупа

почвы

09.08.17

Объем трупа увеличился, появилось зеленое окрашивание передней брюшной стенки; глаза стали мутные с неразличимым зрачком

Наличие яйцекладок насекомых

pH 6,5; t°=17 °C; DRY

pH 6,5—7,0; t°=15 °C; DRY

10.08.17

Сильный гнилостный запах

Яйца насекомых расположены практически по всей поверхности трупа, появились личинки I стадии и жуки-могильщики (Nicrophorus)

pH 6,5; t°=20 °C; NOR

pH 6,5; t°=19 °C; DRY

12.08.17

Цвет трупа зеленый, сильный гнилостный запах, выпадает шерсть

Доминируют личинки I стадии жуки-могильщики. С поверхности трупа они стали перемещаться в глубь тканей

pH 6,5; t°=19 °C; DRY

pH 6,5—7,0; t°=17 °C; DRY

18.08.17

Труп стал темно-коричневым, пенится. Начало дезорганизации тканей, изменился цвет ложа трупа

Доминируют личинки насекомых

pH 5,5; t°=25 °C; DRY

pH 4,5—5,0; t°=17 °C; WET

20.08.17

Продолжается дезорганизация тканей

Доминируют паразитарные формы, личинки насекомых мигрируют в почву

pH 6,5; t°=28 °C; DRY

pH 6,5; t°=20 °C; NOR

22.08.17

Обнажение костей, начало скелетирования трупа

Доминируют паразиты, на фрагментах трупа развивается мицелий низших грибов (Mycota)

pH 6,5; t°<22—23 °C; DRY

pH 5,5—5,0; t°=20 °C; NOR

24.08.17

Первые явления мумификации, фрагменты трупа влажные

Доминируют жуки, паразиты, развивается мицелий Mycota

pH 6,5—7,0; t°<20 °C; DRY

pH 6,5; t°=18 °C; WET

27.08.17

Продолжается скелетирование

Доминируют паразиты, концентрация насекомых уменьшается, развивается мицелий Mycota

pH 6,5; t°=14 °C; WET

pH 6,5; t°=13 °C; DRY

02.09.17

То же

Имаго мелких мух, развивается мицелий Mycota

pH 6,5; t°=14 °C; WET

pH 5,5; t°=13 °C; WET

09.09.17

Полное скелетирование, кости «побелели»

Развивается мицелий Mycota

pH 5,0; t°=14 °C; WET+

pH 6,3; t°=12 °C; WET+

Примечание. Влажность почвы: DRY — сухая; NOR — нормальная; WET — влажная; WET+ — очень влажная.

Признаки гниения в виде увеличения объема трупа и грязно-зеленого окрашивания передней брюшной стенки зафиксировали на 3-и сутки после наступления смерти. К этому времени появились первые яйцекладки насекомых; pH трупа и почвы слабокислый, ближе к нейтральному. На 10-е сутки ткани трупа приобрели темный цвет, что свидетельствует о начале трупного псевдомеланоза. На трупе преобладают личинки насекомых. Начало скелетирования — 12-е сутки после наступления смерти. К этому времени снизились температура трупа с 28 до 22 °C и влажность среды. В этих условиях начали развиваться паразиты, личинки насекомых мигрируют в почву, появляются низшие грибы (плесень), устойчивые к кислой среде (pH 5,0—6,0) и низкой влажности (75%).

После 5 мес разложения трупа, к моменту закладки в «почвенную ловушку», кости изменили окраску от светло-серых до темно-коричневых, наружная костная пластинка стала шероховатой. Далее, по мере нахождения костей в «почвенной ловушке» их поверхности оставались темно-коричневыми, осклизнялись, постепенно теряли плотность и стали распадаться на отдельные кусочки, а мелкие кости перестали обнаруживаться в почве.

Морфологические изменения трупа в динамике в совокупном анализе с коллагеназной активностью бациллярно-клостридиального комплекса микроорганизмов некробиома костной ткани будут представлены в отдельном сообщении.

В различные периоды нахождения фрагментов костей трупа в «почвенной ловушке» с 27.01.18 по 28.10.18 в составе смывов с поверхности костных фрагментов выделили 8 из 14 физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза (см. таблицу 1). Это аммонификаторы; нитрифицирующие бактерии; бактерии, разлагающие клетчатку; возбудители молочно-кислого и уксусно-кислого брожения; азотфиксаторы и денитрифицирующие бактерии.

Следует отметить, что в условиях модельного эксперимента при снижении температуры среды на 32 °C и увеличении срока диагенеза на 7 мес произошла существенная перестройка микробного сообщества. Доля группы аммонификаторов выросла на 19,8%. Характерно, что при всех температурных диапазонах аммонификаторы доминировали, их процентное соотношение относительно других физиологических групп не уменьшалось, оставаясь в пределах 73,1% (6-й месяц с момента наступления смерти) — 92,9% (13-й месяц с момента наступления смерти). Количество бактерий, разлагающих клетчатку, или целлюлозоразрушающих бактерий, было довольно значительным на 6-й месяц разложения; к этому сроку доля целлюлозолитиков составила 17,9%. Снижение температуры и продолжительность периода гниения вызвали сокращение их доли к концу эксперимента до 4,2%.

Физиологические группы бактерий, вызывающих брожение углеродсодержащих субстратов, азотфиксаторы и микроорганизмы-денитрификаторы оказались чувствительными к ингибирующему действию температур. В условиях модельного эксперимента к 13-му месяцу с момента наступления смерти их доля в микробном сообществе значительно сократилась: молочно-кислых гомоферментативных бактерий до 0,4%, молочно-кислых гетероферментативных бактерий до 0,7%, уксусно-кислых бактерий до 0,2%, денитрификаторов до 0,6%. При заданных условиях опыта количество азотфиксаторов оставалось незначительным и изменялось от 6,4% (37 °C, 8-й месяц с момента наступления смерти) до 0,3% (37 °C, 13-й месяц после наступления смерти). При температуре 5 °C на 13-й месяц после наступления смерти азотфиксаторы не обнаруживались.

На разнообразие микробного сообщества в процессе разложения костных фрагментов сильное влияние оказал pH. В период исследования с 09.08 по 09.09.17 кислотность трупа изменилась с 5,0 до 7,0. Кислотность почвы, как правило, соответствовала значениям pH трупа или была на несколько единиц ниже. Результаты анализа по изменению кислотности почвы и общего количества микробных клеток в сообществе в условиях модельного эксперимента представлены в табл. 3.

Таблица 3. Изменение кислотности почвы и количества микроорганизмов в модельном эксперименте в различные периоды разложения костных фрагментов

Продолжительность захоронения, мес

pH

Общее микробное число, КОЕ/г почвы

6

5,4

0,4±0,7×104

8

6,9

1,7±1,5×104

11

7,4

2,8±0,5×106

13

8,3

6,4±0,3×106

За 7 мес эксперимента водородный показатель pH почвы в зоне микробной трансформации костных фрагментов изменился с 5,4 до 8,3, при этом совокупная численность жизнеспособных микроорганизмов возросла с (0,4±0,7)×104 до (6,4±0,3)×106 КОЕ в 1 г почвы. Доминирование, а также физиологическая и биохимическая активность определенных физиологических групп бактерий в сообществе вызвали закисление почвенного субстрата к 6-му месяцу эксперимента и защелачивание до 8,3 к 13-му месяцу. Полученные результаты можно объяснить накоплением молочной и уксусной кислот на начальных стадиях диагенеза костных фрагментов, что связано с метаболической активностью молочно-кислых и уксусно-кислых бактерий, общая доля которых составила к этому периоду микробной трансформации костей 45,6%. По мере увеличения с момента наступления смерти продолжительности разложения костных фрагментов доля бактерий, вызывающих брожение, постепенно снизилась с 21,6% на 8-м месяце до 11,7% на 13-м месяце. Защелачивание почвенного субстрата до pH 8,3 оказалось идеальным для развития группы аммонификаторов, которые способствовали увеличению общего числа микробных клеток в почве к 13-му месяцу модельного эксперимента.

Выводы

1. Получены первичные качественные и количественные данные о функциональном потенциале физиологических групп микроорганизмов, контролирующих разложение костных останков в составе естественного микробного сообщества трупа и ложа трупа.

2. Дифференцированы 8 из 14 физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза, которые отражают этап разложения костей и особенности биоты в зависимости от комплекса абиотических и биотических факторов среды. Основную массу составили копиотрофные группы, способные к росту на субстратах с высоким содержанием органического вещества.

3. Экспериментально подтверждено, что плотность микроорганизмов в исследованном биологическом материале является важным фактором, влияющим на интенсивность микробного разложения костных фрагментов. За 7 мес модельного эксперимента совокупная численность жизнеспособных микроорганизмов увеличилась более чем в 16 раз, при этом доля споровых аммонификаторов оставалась значительной (от 20,5 до 39,1%) на различных этапах разложения.

4. Структурно-функциональное описание физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза доказывает возможность применения физиологических характеристик микробных сообществ трупа и ложа трупа в судебно-медицинской экспертизе для решения вопросов о ДНС или сроке захоронения по костным останкам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема №0752-2020-0007) и реализации программы развития опорного университета ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» на период 2017—2021 гг.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.