Установление постмортального интервала относится к одной из важных задач судебно-медицинской экспертизы. Как правило, для его оценки учитывают интенсивность развития трупных явлений. При отсутствии мягких тканей единственным источником, по которому можно идентифицировать эксгумированные останки или судить о сроках давности наступления смерти (ДНС), остаются кости. При длительном нахождении в природных условиях костная ткань подвергается сильной деградации, вызванной комплексом абиотических и биотических факторов среды, включая деятельность микроорганизмов. Такой процесс, в результате которого мягкие ткани разлагаются, а скелет подвергается постепенному разрушению, называют диагенезом [1, 2]. В статье термин «диагенез» используется для описания естественного процесса, который претерпевают фрагменты скелета в окружающей среде [3].
Экспериментально доказано, что микроорганизмы, участвующие в скелетировании, представляют собой очень сложное биологическое сообщество с разнообразными и сменяющимися видами, которые группируются по признакам экологического характера [4]. Микробная активность в процессе скелетирования прямо зависит от факторов среды: концентрации кислорода, влажности, окислительно-восстановительных условий и температуры [5, 6]. Деятельность микроорганизмов в процессах деградации костей оказывает сильное влияние не только на химический состав костной ткани, но и на ее микроструктуру [7, 8].
Цель работы — изучение разнообразия физиологических групп микроорганизмов, контролирующих трансформацию костных останков в природе.
Материал и методы
В качестве экспериментального материала использовали труп кролика Oryctolagus sp. Его поместили 08.08.17 на специально оборудованную площадку в природных условиях для развития процессов разложения. С 6-го месяца от начала эксперимента (27.01.18) заложили модельные опыты по диагенезу костей с участием специфических физиологических групп микроорганизмов. Для этого фрагменты костей в лабораторных условиях разместили в нестерильной увлажненной огородной почве с целью создания эффекта «почвенной ловушки» для микроорганизмов, участвующих в разложении костной ткани. Модельные опыты проводили при разных температурных условиях: 37; 21 и 5 °C. Общая продолжительность эксперимента составила 14 мес — с 08.08.17 по 28.10.18.
Все эксперименты проводили в соответствии с международными этическими нормами, изложенными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Рекомендации для врачей по проведению биомедицинских исследований на людях» и в Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, а также с требованиями, приведенными в приказе Минздрава СССР от 12.08.77 №755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» и других нормативных документах (заключение Комитета по медицинской этике при МЗиСР РК и Петрозаводском государственном университете №35 от 6 ноября 2015 г.).
Микрофлору с фрагментов костей получали методом смывов с помощью стерильных тампонов. Смывы с поверхности отбирали рандомно от 3 до 5 образцов. Микробиологический анализ проводили сразу после отбора образцов. Для этого пробы суспензировали в изотоническом растворе натрия хлорида и по 0,1 мл инокулировали в элективные питательные среды, предназначенные для развития узкой группы микроорганизмов, выполняющих определенную функцию в процессе диагенеза. Среды для получения накопительных культур физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза, их метаболитов и представителей доминантных родов представлены в табл. 1. Для преимущественного выделения из смывов с поверхности костей спорообразующих аммонифицирующих бактерий предварительно проводили пастеризацию отобранных смывов (прогревание при температуре 80 °C в течение 10 мин), при этом вегетативные клетки погибали и сохранялись только спорогенные бактерии [9]. С учетом принадлежности выделяемых микробов к мезофилам накопительные культуры получали при комнатной температуре в диапазоне от 24±3 до 37±1 °C [10]. Учет количества представителей определенной физиологической группы проводили методом предельных разведений с использованием таблицы Мак-Креди [11].
Таблица 1. Соотношение физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза: среды для получения накопительных культур, метаболиты, доминантные роды
| Физиологическая группа [5] | Питательная среда | Метаболиты | Представитель доминантного рода |
| Уксусно-кислые бактерии | Элективная среда с 2% C2H4O2 | CH3COOH | Acetobacter |
| Молочно-кислые гомоферментативные бактерии | Питательная среда на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата | CH3CHOHCOOH | Streptococcus, Lactobacillus |
| Молочно-кислые гетероферментативные бактерии | Эндо | CH3CHOHCOOH, COOH(CH2)2COOH, CH3COOH, CH3CH2OH | Escherichia, Leuconostoc |
| Аммонификаторы (аэробы) | Мясопептонный агар (МПА) | NH3, H2S | Pseudomonas Proteus |
| Аммонификаторы (анаэробы) | Мясопептонный бульон (МПб) | NH3, H2S | Clostridium |
| Спорообразующие аммонификаторы | Мишустина | NH3, H2S, C8H7N | Bacillus |
| Нитрификаторы | Виноградского I фазы нитрификации | HNO2 | Nitrosomonas, Nitrosolobus, Nitrosococcus, Nitrosospira |
| Виноградского II фазы нитрификации | HNO3 | Nitrobacter, Nitrospina | |
| Азотфиксаторы (аэробы) | Эшби | NH3 | Azotobacter |
| Азотфиксаторы (анаэробы) | Жидкая среда Виноградского | CH3(CH2)2COOH CH3COOH CO2 | Clostridium |
| Анаэробные деструкторы клетчатки | Имшеницкого | CH3(CH2)2COOH | Cytophaga, Cellvibrio, Cellfalcicula, Sorangium, Polyangium |
| Денитрифицирующие бактерии | Гильтая | NH3 | Achromobacter, Pseudomonas |
| Десульфатирующие бактерии | Ван-Дельдена | H2S, FeS | Desulfovibrio |
| Тионовые бактерии | Якобсона | Соединения серы | Thiobacillus |
| Железобактерии | Дрожжевой бульон для железобактерий, двухкомпонентная железосодержащая среда для серобактерий | Fe(OH)3 | Leptothrix, Thiobacillus, Sphaerotilus |
При исследовании извлеченных из почвы костей применяли субъективные (визуальные) методы: учитывали интенсивность протекания гнилостных процессов, отсутствие на костях мягких тканей, состояние костной пластинки, цвет костей. С помощью прибора 4В1 pH-метр оценивали изменение абиотических факторов в почве и трупе — морфологические и физико-химические свойства (кислотность, влажность, температура). Для наблюдения за интенсивностью разложения трупа и изменениями костной ткани проводили макроскопический анализ, в процессе которого фиксировали гнилостные изменения трупа, цвет и структуру костей. Все изменения записывали и фотографировали.
Результаты и обсуждение
Интенсивность гнилостной трансформации и изменение биотических и абиотических факторов среды на примере трупа и почвы проследили с 09.08.17 по 09.09.17 (до развития полного скелетирования). Результаты описания интенсивности гниения трупа представлены в табл. 2.
Таблица 2. Интенсивность гнилостных процессов и изменение биотических и абиотических факторов среды
| Дата | Признаки интенсивности гниения | Биотические факторы | Абиотические факторы | |
| трупа | почвы | |||
| 09.08.17 | Объем трупа увеличился, появилось зеленое окрашивание передней брюшной стенки; глаза стали мутные с неразличимым зрачком | Наличие яйцекладок насекомых | pH 6,5; t°=17 °C; DRY | pH 6,5—7,0; t°=15 °C; DRY |
| 10.08.17 | Сильный гнилостный запах | Яйца насекомых расположены практически по всей поверхности трупа, появились личинки I стадии и жуки-могильщики (Nicrophorus) | pH 6,5; t°=20 °C; NOR | pH 6,5; t°=19 °C; DRY |
| 12.08.17 | Цвет трупа зеленый, сильный гнилостный запах, выпадает шерсть | Доминируют личинки I стадии жуки-могильщики. С поверхности трупа они стали перемещаться в глубь тканей | pH 6,5; t°=19 °C; DRY | pH 6,5—7,0; t°=17 °C; DRY |
| 18.08.17 | Труп стал темно-коричневым, пенится. Начало дезорганизации тканей, изменился цвет ложа трупа | Доминируют личинки насекомых | pH 5,5; t°=25 °C; DRY | pH 4,5—5,0; t°=17 °C; WET |
| 20.08.17 | Продолжается дезорганизация тканей | Доминируют паразитарные формы, личинки насекомых мигрируют в почву | pH 6,5; t°=28 °C; DRY | pH 6,5; t°=20 °C; NOR |
| 22.08.17 | Обнажение костей, начало скелетирования трупа | Доминируют паразиты, на фрагментах трупа развивается мицелий низших грибов (Mycota) | pH 6,5; t°<22—23 °C; DRY | pH 5,5—5,0; t°=20 °C; NOR |
| 24.08.17 | Первые явления мумификации, фрагменты трупа влажные | Доминируют жуки, паразиты, развивается мицелий Mycota | pH 6,5—7,0; t°<20 °C; DRY | pH 6,5; t°=18 °C; WET |
| 27.08.17 | Продолжается скелетирование | Доминируют паразиты, концентрация насекомых уменьшается, развивается мицелий Mycota | pH 6,5; t°=14 °C; WET | pH 6,5; t°=13 °C; DRY |
| 02.09.17 | То же | Имаго мелких мух, развивается мицелий Mycota | pH 6,5; t°=14 °C; WET | pH 5,5; t°=13 °C; WET |
| 09.09.17 | Полное скелетирование, кости «побелели» | Развивается мицелий Mycota | pH 5,0; t°=14 °C; WET+ | pH 6,3; t°=12 °C; WET+ |
Примечание. Влажность почвы: DRY — сухая; NOR — нормальная; WET — влажная; WET+ — очень влажная.
Признаки гниения в виде увеличения объема трупа и грязно-зеленого окрашивания передней брюшной стенки зафиксировали на 3-и сутки после наступления смерти. К этому времени появились первые яйцекладки насекомых; pH трупа и почвы слабокислый, ближе к нейтральному. На 10-е сутки ткани трупа приобрели темный цвет, что свидетельствует о начале трупного псевдомеланоза. На трупе преобладают личинки насекомых. Начало скелетирования — 12-е сутки после наступления смерти. К этому времени снизились температура трупа с 28 до 22 °C и влажность среды. В этих условиях начали развиваться паразиты, личинки насекомых мигрируют в почву, появляются низшие грибы (плесень), устойчивые к кислой среде (pH 5,0—6,0) и низкой влажности (75%).
После 5 мес разложения трупа, к моменту закладки в «почвенную ловушку», кости изменили окраску от светло-серых до темно-коричневых, наружная костная пластинка стала шероховатой. Далее, по мере нахождения костей в «почвенной ловушке» их поверхности оставались темно-коричневыми, осклизнялись, постепенно теряли плотность и стали распадаться на отдельные кусочки, а мелкие кости перестали обнаруживаться в почве.
Морфологические изменения трупа в динамике в совокупном анализе с коллагеназной активностью бациллярно-клостридиального комплекса микроорганизмов некробиома костной ткани будут представлены в отдельном сообщении.
В различные периоды нахождения фрагментов костей трупа в «почвенной ловушке» с 27.01.18 по 28.10.18 в составе смывов с поверхности костных фрагментов выделили 8 из 14 физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза (см. таблицу 1). Это аммонификаторы; нитрифицирующие бактерии; бактерии, разлагающие клетчатку; возбудители молочно-кислого и уксусно-кислого брожения; азотфиксаторы и денитрифицирующие бактерии.
Следует отметить, что в условиях модельного эксперимента при снижении температуры среды на 32 °C и увеличении срока диагенеза на 7 мес произошла существенная перестройка микробного сообщества. Доля группы аммонификаторов выросла на 19,8%. Характерно, что при всех температурных диапазонах аммонификаторы доминировали, их процентное соотношение относительно других физиологических групп не уменьшалось, оставаясь в пределах 73,1% (6-й месяц с момента наступления смерти) — 92,9% (13-й месяц с момента наступления смерти). Количество бактерий, разлагающих клетчатку, или целлюлозоразрушающих бактерий, было довольно значительным на 6-й месяц разложения; к этому сроку доля целлюлозолитиков составила 17,9%. Снижение температуры и продолжительность периода гниения вызвали сокращение их доли к концу эксперимента до 4,2%.
Физиологические группы бактерий, вызывающих брожение углеродсодержащих субстратов, азотфиксаторы и микроорганизмы-денитрификаторы оказались чувствительными к ингибирующему действию температур. В условиях модельного эксперимента к 13-му месяцу с момента наступления смерти их доля в микробном сообществе значительно сократилась: молочно-кислых гомоферментативных бактерий до 0,4%, молочно-кислых гетероферментативных бактерий до 0,7%, уксусно-кислых бактерий до 0,2%, денитрификаторов до 0,6%. При заданных условиях опыта количество азотфиксаторов оставалось незначительным и изменялось от 6,4% (37 °C, 8-й месяц с момента наступления смерти) до 0,3% (37 °C, 13-й месяц после наступления смерти). При температуре 5 °C на 13-й месяц после наступления смерти азотфиксаторы не обнаруживались.
На разнообразие микробного сообщества в процессе разложения костных фрагментов сильное влияние оказал pH. В период исследования с 09.08 по 09.09.17 кислотность трупа изменилась с 5,0 до 7,0. Кислотность почвы, как правило, соответствовала значениям pH трупа или была на несколько единиц ниже. Результаты анализа по изменению кислотности почвы и общего количества микробных клеток в сообществе в условиях модельного эксперимента представлены в табл. 3.
Таблица 3. Изменение кислотности почвы и количества микроорганизмов в модельном эксперименте в различные периоды разложения костных фрагментов
| Продолжительность захоронения, мес | pH | Общее микробное число, КОЕ/г почвы |
| 6 | 5,4 | 0,4±0,7×104 |
| 8 | 6,9 | 1,7±1,5×104 |
| 11 | 7,4 | 2,8±0,5×106 |
| 13 | 8,3 | 6,4±0,3×106 |
За 7 мес эксперимента водородный показатель pH почвы в зоне микробной трансформации костных фрагментов изменился с 5,4 до 8,3, при этом совокупная численность жизнеспособных микроорганизмов возросла с (0,4±0,7)×104 до (6,4±0,3)×106 КОЕ в 1 г почвы. Доминирование, а также физиологическая и биохимическая активность определенных физиологических групп бактерий в сообществе вызвали закисление почвенного субстрата к 6-му месяцу эксперимента и защелачивание до 8,3 к 13-му месяцу. Полученные результаты можно объяснить накоплением молочной и уксусной кислот на начальных стадиях диагенеза костных фрагментов, что связано с метаболической активностью молочно-кислых и уксусно-кислых бактерий, общая доля которых составила к этому периоду микробной трансформации костей 45,6%. По мере увеличения с момента наступления смерти продолжительности разложения костных фрагментов доля бактерий, вызывающих брожение, постепенно снизилась с 21,6% на 8-м месяце до 11,7% на 13-м месяце. Защелачивание почвенного субстрата до pH 8,3 оказалось идеальным для развития группы аммонификаторов, которые способствовали увеличению общего числа микробных клеток в почве к 13-му месяцу модельного эксперимента.
Выводы
1. Получены первичные качественные и количественные данные о функциональном потенциале физиологических групп микроорганизмов, контролирующих разложение костных останков в составе естественного микробного сообщества трупа и ложа трупа.
2. Дифференцированы 8 из 14 физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза, которые отражают этап разложения костей и особенности биоты в зависимости от комплекса абиотических и биотических факторов среды. Основную массу составили копиотрофные группы, способные к росту на субстратах с высоким содержанием органического вещества.
3. Экспериментально подтверждено, что плотность микроорганизмов в исследованном биологическом материале является важным фактором, влияющим на интенсивность микробного разложения костных фрагментов. За 7 мес модельного эксперимента совокупная численность жизнеспособных микроорганизмов увеличилась более чем в 16 раз, при этом доля споровых аммонификаторов оставалась значительной (от 20,5 до 39,1%) на различных этапах разложения.
4. Структурно-функциональное описание физиологических групп микроорганизмов — участников диагенеза доказывает возможность применения физиологических характеристик микробных сообществ трупа и ложа трупа в судебно-медицинской экспертизе для решения вопросов о ДНС или сроке захоронения по костным останкам.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема №0752-2020-0007) и реализации программы развития опорного университета ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» на период 2017—2021 гг.