Введение

Развитие большинства экспертных, в том числе судебно-биологических подразделений государственных судебно-медицинских экспертных учреждений Российской Федерации (ГСМЭУ РФ), помимо укомплектованности кадрами, обновления имеющегося оборудования, предполагает непрерывное обучение персонала и совершенствование выполняемых экспертных исследований с применением высокотехнологичных методов, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью [1—3].

Практическая реализация указанных положений заключается во внедрении в работу судебно-биологических подразделений ГСМЭУ РФ современных количественных методов исследования следов крови, выделений и разработке методик внутрилабораторного контроля качества (ВЛКК), что является необходимым и обязательным условием их полноценного применения [4—12].

В частности, к данному виду ВЛКК относят комплекс специальных исследований, направленный на установление контрольных пределов, значения которых позволяют определить приемлемость полученных результатов и проверить их соответствие необходимым интервальным значениям и характеристикам. Иными словами, ВЛКК заключается в обнаружении возможных погрешностей в лабораторных исследованиях, которые могут исказить полученные результаты и повлиять на достоверность экспертных оценок. При этом необходимо отметить, что ряд оригинальных, а также усовершенствованных технологий и методик на основе колориметрического метода и количественного иммуноферментного анализа (ИФА) ранее уже был разработан и введен в экспертную практику не только в нашей стране, но и за рубежом [13—20]. В настоящее время ведется работа по дальнейшему совершенствованию методов ВЛКК в работе соответствующих подразделений ГСМЭУ РФ [21—27].

Цель работы — разработка методики проведения ВЛКК при установлении видовой принадлежности крови по общему иммуноглобулину G (IgG_общ) с помощью количественного ИФА.

По сравнению с «традиционными» качественными методиками, ИФА обладает большей чувствительностью, производительностью и объективностью экспертных оценок при формулировании и обосновании экспертных выводов.

Материал и методы

Для установления видовой принадлежности исследовали концентрацию общего иммуноглобулина класса G (IgG_общ) в водных экстрактах из пятен крови человека на вещественных доказательствах. Плановые пробы готовили из водных экстрактов следов, для этого вырезали фрагменты визуально видимых пятен, либо образцов, заведомо содержащих кровь человека, размерами от 0,5×0,5 до 10×10 см. В зависимости от тактики экспертного исследования, характера и величины следов, фрагменты этих пятен заливали необходимым объемом дистиллированной воды с небольшим избытком, полностью покрывающим исследуемый материал с pH 7,2—7,4 и экстрагировали при температуре 4 °C в течение 18 — 24 ч.

Принадлежность крови человеку, а не животным в полученных экстрактах определяли с помощью ИФА с использованием отечественного тест-набора реагентов для иммуноферментного определения IgG_общ человека «IgG-общий-ИФА-БЕСТ», который применяется в клинической практике для диагностики иммунитета. Указанный тест-набор предназначен для определения 4 изотипических подкласса IgG_общ, кодируемых последовательными цифрами и обозначаемых как IgG1—4. Подклассы IgG_общ различаются по способности связывать комплемент и активировать его по альтернативному пути, связываться с рецептором к Fc-фрагменту IgG на разных типах клеток и проникать через плаценту. Тест-набор позволяет измерить суммарно в сыворотке крови человека подклассы IgG.

Принцип метода заключается в том, что в результате количественного твердофазного ИФА образуется специфический иммунный комплекс с использованием иммобилизованных IgG-антител и моноклональных IgG-антител, меченных пероксидазой. Исследуемые IgG в результате анализа оказываются как бы «зажатыми» между молекулами иммобилизованных и меченых антител. Данный комплекс выявляется посредством окраски с помощью раствора тетраметилбензидина, после чего в него вносят стоп-реагент. Регистрация результатов реакции осуществляется фотометрически при длине волны 450 нм.

Измерения проводили в соответствии с инструкцией производителя по стандартной схеме (см. рисунок на цв. вклейке). Результаты исследований регистрировали на медицинском микропланшетном ридере Sinrise (Tecan Austria GmbH, Австрия) с программным обеспечением Magellan (регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/829 от 22.05.2003).

Схема проведения количественного твердофазного иммуноферментного анализа по установлению видовой принадлежности крови.

Результаты и обсуждение

Методику ВЛКК при установлении видовой принадлежности крови по IgG_общ методом количественного ИФА осуществляли по определенному алгоритму. Из экстрактов проб, взятых с вещественных доказательств, было выполнено 22 измерения IgG_общ в дубликатах установочной серии, после чего проводили ежедневный оперативный контроль качества этих измерений в течение 26 рабочих дней календарного месяца по 1 серии измерений в день. Всего выполнили 44 измерения проб для установочной серии и 52 измерения для ежедневного оперативного ВЛКК (всего 96 измерений), результаты измерения IgG_общ установочной серии представлены в табл. 1.

Таблица 1. Результаты измерения установочной серии IgG_общ

По результатам установочной серии определяли показатели сходимости с помощью вычисления стандартного отклонения (SD) и коэффициента аналитической вариации (%CVa), после чего рассчитывали показатель приемлемости результатов в виде минимальной разницы (MD). Стандартное отклонение для 22 дубликатов составило 0,73 мг/мл, коэффициент аналитической вариации — 6,03%.

С учетом полученного показателя сходимости установочной серии, определенного через коэффициент аналитической вариации, как параметра стандартной неопределенности, величина MD для результатов IgG_общ. была определена по следующей формуле:

В установочной серии величина MD как критерий приемлемости разницы результатов измерения проб IgG_общ составила 16,9%.

После получения величины MD из результатов установочной серии проводили ежедневный ВЛКК по 1 серии измерений в день (в течение 26 дней), с вычислением показателей относительной разницы для каждой серии измерения. Результаты измерений с показателями относительной разницы (RelDiff%) представлены в табл. 2.

Таблица 2. Результаты ежедневного измерения концентрации IgG_общ с показателями относительной разницы

Заключение

Произведен ВЛКК измерения концентрации IgG_общ в пробах крови, полученных из вытяжек со следов на вещественных доказательствах методом количественного ИФА. На 1-м этапе были выполнены измерения в дубликатах установочной серии IgG_общ с определением показателей сходимости: стандартного отклонения, коэффициента аналитической вариации величины приемлемости полученных результатов в виде минимальной разницы. На 2-м этапе — проведены ежедневные измерения концентрации IgG_общ по 1 серии в дубликате на протяжении 26 дней с вычислением показателей относительной разницы. На 3-м — осуществлено повторное определение концентрации активности IgG_общ в пробах с вычислением значения минимальной разницы между первыми и вторыми результатами, которые в большинстве проб оказались существенно выше, чем в установочной серии. Примечательно, что результаты в 3 сериях измерений (№7, №13, №14), находившихся в диапазоне низких концентраций IgG_общ, были измерены повторно. После проведения корректирующих действий минимальная разница составила 16,83%, что свидетельствовало о приемлемости и надежности полученных результатов.

Таким образом, предложенная методика проведения ВЛКК измерений концентраций IgG_общ при установлении видовой принадлежности пятен крови с помощью количественного ИФА позволяет контролировать точность выполняемых исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.