В процессе длительной изоляции и гипокинезии у обследуемых лиц происходило ухудшение гигиены полости рта. Микробиоценоз изменяется за счет активации роста пародонтопатогенов — превотелл, фузобактерий, актиномицетов, трепонем и т. д., что происходит синергично с ростом микробов, вызывающих тонзиллиты и фарингиты, например стрептококков и коринебактерий [1, 2]. С учетом возможного развития антибиотикорезистентности, представляется, что наиболее результативным является использование пробиотических препаратов на основе, например, термофильного и саливарного стрептококка [3—7]. Колонизация ротовой полости лиц опасных профессий протективными видами стрептококка может снизить риски возникновения воспаления в ротовой полости, в частности, — деструкции тканей пародонта [8—10].

Целью исследования являлась оценка изменений микробиоценоза рта участников моделирования микрогравитации с использованием средств профилактики в виде биологически активной добавки с пробиотиком и кисломолочного продукта, а также без таковых.

Материалы и методы

Моделирование микрогравитации проводилось в наземном стенде сухой иммерсии ГНЦ РФ ИМБП РАН. Сухая иммерсия — это воспроизведение условий микрогравитации в водной среде, куда испытуемый на гидроизолирующей пленке погружается горизонтально по шею. 15 здоровых мужчин в возрасте 25—40 лет участвовали в двух сериях модельного эксперимента «Сухая иммерсия-2018» (весна и осень) с целью апробации профилактики воспаления ротовой полости с помощью биологически активной добавки на основе пробиотического штамма Streptococcus salivarius K12 в количестве 1×10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 таблетке для рассасывания и продукта питания в виде кисломолочного продукта, содержащего пробиотический штамм Streptococcus salivarius subsp. thermophilus в количестве не менее 1×10⁷ КОЕ на 1 грамм продукта.

Согласно International Clinical Trials Registry Platform Всемирной организации здравоохранения, данный эксперимент относится к рандомизированным контролируемым наблюдениям без маскировки, IV фазы клинических исследований. Программы обоих экспериментов утверждены комитетом по биомедицинской этике ГНЦ РФ ИМБП РАН с кодовым обозначением «Пародонт» в рамках эксперимента ГНЦ РФ ИМБП РАН «Сухая иммерсия, весна-2018» (Immersion-5D), Протокол № 471 от 15.03.2018, и «Сухая иммерсия, осень-2018» (Immersion-21D), Протокол № 483 от 03.08.2018. Согласно Нюрнбергскому кодексу и Хельсинкской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации 1975 года, с изменениями от 2000 года, Федеральному закону «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» № 323-ФЗ от 21.11.2011 и Положению об организации клинической апробации методов профилактики, диагностики, лечения и реабилитации и оказания медицинской помощи в рамках клинической апробации методов профилактики, диагностики, лечения и реабилитации (в том числе порядка направления пациентов для оказания такой медицинской помощи), утвержденному Приказом Министерства здравоохранения РФ от 10.07.2015 № 433н, создана форма информированного согласия, включавшая описание методики исследования, которая были подписана всеми участниками после ознакомления.

Для обеспечения мер профилактического характера врачом-исследователем была выбрана биологически активная добавка с пробиотическим штаммом саливарного стрептококка. Для сравнительного исследования эффективности пробиотика и проверки саливарного и термофильного стрептококков на синергизм был использован кисломолочный продукт питания с пищевым штаммом термофильного стрептококка.

Критерии включения: исследование проводилось на 15 лицах мужского пола, участниках эксперимента «Сухая иммерсия-2018». 5 участников эксперимента «Осень-2018» входили в контрольную группу. 10 участников эксперимента «Весна-2018» были разделены на 3 группы: первая группа состояла из 3 человек, которые выпивали 1 стакан кисломолочного продукта перед сном после чистки зубов и 1 стакан кисломолочного продукта после завтрака и чистки зубов. Вторая группа из 3 человек рассасывала по 1 таблетке пробиотика перед сном после чистки зубов и по 1 таблетке пробиотика после завтрака и чистки зубов. Третья группа была наибольшей и состояла из 4 человек. В ней проверялся синергизм протективных штаммов стрептококка по схеме: 1 стакан кисломолочного продукта перед сном после чистки зубов и 2 таблетки пробиотика под язык в течение дня.

Критерием исключения являлись личные предпочтения участников эксперимента к приему таблеток или кисломолочного продукта. Критерии успеха: положительная динамика эубиотического индекса или пародонтального индекса.

Анализ динамики микробиоценоза выполнен с помощью динамики эубиотического индекса (ЭИ) ротовой жидкости (РЖ) и десневой жидкости (ДЖ), а также клинического мониторинга и оценки его результатов с помощью шкалы индекса CPI/CPITN. Статистический анализ выполнялся в программе Microsoft Excel v. 16.41.

CPI/CPITN — индекс нуждаемости пародонта в лечении [11—14]. Он фиксирует динамику процесса и эффективность проводимых лечебных мероприятий. За счет индекса CPITN можно оценивать состояние пародонта не только у отдельных пациентов, но и у целых групп. Шкала оценки (CPI): 4 — карман более 6 мм; 3 — карман 3,5 — 5,5 мм; 2 — пародонтального кармана нет, но присутствует явление воспаления десны, зубной камень, дефекты пломб или коронок; 1 — кровоточивость сразу после окончания зондирования, наблюдаемая непосредственно глазом или с помощью зеркала, зубного камня нет, карманов нет; 0 — пародонт интактен. Оценка нуждаемости в лечении (<CPI>TN): 0 — лечения не нужно; 1 — гигиена полости рта; 2 — удаление зубных отложений+гигиена; 3 — удаление отложений + консервативная терапия + кюретаж + гигиена; 4 — удаление отложений + консервативная терапия + лоскутные операции + ортопедическое лечение + гигиена [12].

Эубиотический индекс — это авторский индекс оценки качества микробиоценоза в биотопах. Высчитывается отношение суммы положительных изменений протективных и условно-патогенных групп организмов к сумме отрицательных таких сдвигов. К положительным свойствам препаратов, способных обеспечить позитивные сдвиги в составе микрофлоры, отнесены: 1) количественный рост микроорганизмов, представителей видов, относящихся к протективным группам; 2) стабилизация количества микроорганизмов, представителей видов, относящихся к протективным группам, на определенных приемлемых величинах; 3) снижение количества микроорганизмов, представителей видов, относящихся к условно-патогенным группам; 4) стабилизация количества микроорганизмов, представителей видов, относящихся к условно-патогенным группам, на определенных приемлемых величинах. К отрицательным показателям препаратов отнесены: 1) количественный рост микроорганизмов, представителей видов, относящихся к условно-патогенным группам; 2) стабилизация количества микроорганизмов, представителей видов, относящихся к условно-патогенным группам, на высоких количественных уровнях; 3) снижение количества микроорганизмов, представителей видов, относящихся к протективным группам; 4) стабилизация количества микроорганизмов, представителей видов, относящихся к протективным группам, на низких количественных уровнях [14]. За высокий титр КОЕ в результатах бактериологического посева взят титр выше N×10⁴ [15].

Образцы РЖ с мягких тканей ротовой полости для бактериологического метода собирались утром до гигиенических процедур и приема пищи или воды с помощью стерильного ватного тампона, который далее помещался в транспортную систему со средой Эймса без угля и доставлялся в лабораторию в течение часа. Посев биоматериала проводился на плотные питательные среды — основа агара с добавлением стерильной дефибринированной крови барана (до 5%); агар Сабуро, с дополнительной идентификацией с использованием хромогенной среды для грибов рода Candida; стафилококковый агар №110, с последующей оценкой видового и количественного соотношения микробов в динамике. Предварительная бактериологическая идентификация проводилась в ходе осмотра колоний квалифицированным врачом-микробиологом. Идентификация до вида проводилась с помощью стандартизированных колориметрических биохимических идентификационных тестов HIMEDIA (HiMedia Laboratories GmbH, Индия).

Образцы ДЖ отбирались по методу Рамфьорда в десневых бороздах зубов 1.6. 2.1, 3.6, 4.1 с помощью стерильного пинцета и стерильных одноразовых бумажных эндодонтических штифтов в течение 5 мин, пробоотборники с биологическим материалом помещались в одноразовые стерильные пробирки «Эппендорф» с физиологическим раствором и немедленно замораживались до температуры –20 ^oC. Для последующей диагностики с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовалось диагностическое оборудование «Мультидент-5» с комплектом реагентов для проведения амплификации ДНК пародонтопатогенов I порядка на четырехканальном ДНК-амплификаторе «Терцик» производства ООО НПФ «Генлаб» с визуализацией результата с помощью электрофоретического разделения в 1% агарозном геле с бромистым этидием в денатурирующих условиях. Все процедуры проводились четко по инструкции производителя.

Результаты и обсуждение

В ходе эксперимента «Сухая иммерсия, осень-2018» в контрольной группе участников было зафиксировано значительное ухудшение гигиены пародонта и клинического статуса слизистой ротовой полости, характеризующееся ростом наддесневого и поддесневого зубного камня, увеличением кровоточивости десен, неконтролируемым ростом патогенной микрофлоры. Изменения в микробиоценозе ротовой полости произошли за счет активации роста такой пародонтопатогенной микрофлоры, как Prevotella spp., Fusobacterium spp., Actinomyces spp., Porphyromonas gingivalis и т. д. Одновременно с ростом пародонтопатогенов сдвиг в биоценозе сопровождался ростом патогенной микробиоты ротовой полости, например Candida spp., Staphylococcus spp., Streptococcus pyogenes, Streptococcus mutans, Streptococcus anginosus, Neisseria sicca.

Во всех трех группах профилактики при изменениях микробиоценоза зафиксирован положительный сдвиг эубиотического индекса как ротовой, так и десневой жидкостей (рис. 1, 2). В группе II, принимавшей по 2 пастилки пробиотического препарата участники отметили, что утренний зубной налет изменил свою дисперсность и легко удалялся языком. Почти у всех участников эксперимента в ДЖ произошла эрадикация пародонтопатогена Prevotella intermedia, в группах II и III почти у всех участников произошла эрадикация пародонтопатогена Treponema denticola. В ходе эксперимента с применением профилактических мер в группах I и II не было выявлено изменений по шкале индексов CPI/CPITN, а в группе III произошло улучшение состояния пародонта (рис. 3).

Рис. 1. Изменения эубиотического индекса ДЖ в исследуемых группах.

ЭИ — эубиотический индекс; ДЖ — десневая жидкость; ДО — накануне исследования; ПОСЛЕ — после окончания исследования. По оси абсцисс — значения эубиотического индекса в группах I, II, III и контрольной группе до исследования и после. По оси ординат — абсолютные значения индекса.

Рис. 2. Изменения эубиотического индекса РЖ в исследуемых группах.

ЭИ — эубиотический индекс; РЖ — ротовая жидкость; ДО — накануне исследования; ПОСЛЕ — после окончания исследования; По оси ординат — абсолютные значения индекса. По оси абсцисс — значения эубиотического индекса в группах I, II, III и контрольной группе до исследования и после.

Рис. 3. Изменения пародонтальных индексов CPI/CPITN в исследуемых группах.

CPI/CPITN — Community Periodontal Index (of Treatment Need) — индекс нуждаемости пародонта в лечении. По оси абсцисс — средние значения отношений индексов CPI/CPITN в группах I, II, III и контрольной группе до исследования и после. По оси ординат — среднее абсолютное значение шкал индексов CPI и CPITN

Заключение

В результате бактериологического посева РЖ пародонтопатогены, выделенные с помощью ПЦР в ДЖ, обнаружены в ней не были. А в результате применения биологически активной добавки некоторые пародонтопатогены (Prevotella intermedia и Treponema denticola) больше не выделялись ни с помощью ПЦР, ни с помощью культурального метода. Во всех трех группах участников профилактики при изменениях микробиоценоза патогенные штаммы Streptococcus spp. были заменены протективными.

Одновременно с элиминацией патогенных Streptococcus spp. выявлена эрадикация Fusobacterium spp., при этом значимое изменение количества этих условных патогенов произошло в микробиоценозе участника III-1. Эрадикация же Enterococcus faecalis обнаружена в испытательных группах II и III, в которых использовались таблетки биологически активной добавки с протективным штаммом саливарного стрептококка.

Таким образом, биологически активная добавка на основе пробиотического штамма саливарного стрептококка, использованная в данном исследовании как отдельно, так и совместно с сертифицированным ферментированным молочным продуктом, проявила пробиотический эффект как сама по себе, так и обнаружила синергию с пищевым кисломолочным продуктом на основе штамма термофильного стрептококка в антагонизме против пародонтопатогенной микрофлоры человека, подтвердив свою безопасность и эффективность в профилактике воспаления пародонта, с соответствии с требованиями и критериями исследования.

Исследование выполнено в рамках базовой тематики РАН 64.2.

Благодарность: Трофимову С.А., Усановой Н.А., Морозовой Ю.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The research is executed within basic subject of Russian academy of sciences 64.2.

Acknowledgement: Trofimov S.A., Usanova N.A., Morozova Yu.A.