В настоящее время стоматологи ставят диагноз пародонтита только на основании клинико-рентгенологической картины — наличие пародонтальных карманов (ПК), степени резорбции межальвеолярных перегородок, — что зачастую не дает полного представления об этиологии и патогенезе заболевания и не позволяет точно определить течение и прогноз пародонтита. Потребности практики диктуют необходимость в разработке высокоточного и надежного метода выявления воспалительных заболеваний пародонта. Быстрая и объективная диагностика поможет значительно снизить частоту ошибок при постановке диагноза, даст возможность в реальном времени следить за результативностью лечения, немедленно вносить необходимые корректировки. В связи c этим крайне актуальна задача поиска прогностически значимых мРНК-маркеров развития различных форм пародонтита, а также разработки диагностических тест-систем для определения соответствующих транскриптов на фоне конкретного бактериального биоценоза. Решение этой задачи может внести определяющий вклад в создание концепции развития пародонтита, облегчит разработку новых методов дифференциальной диагностики его форм, создаст основу для создания этиотропных средств его лечения.

Пародонтит представляет собой хроническое прогрессирующее воспалительное заболевание, приводящее к разрушению пародонтального комплекса и последующей потере зуба. Обычно этиологию пародонтита традиционно связывают с генетической предрасположенностью [1], влиянием факторов среды (уровень гигиены полости рта, характер питания, курение, наличие ортодонтических или ортопедических конструкций и др.), однако наиболее актуальной местной причиной является микробный фактор. Именно инфицирование пародонта патогенными бактериями рассматривается в качестве основной причины возникновения хронического пародонтита большинством авторов [12, 15]. Бактериальная инфекция играет ключевую роль в запуске как агрессивного, так и хронического пародонтита [9].

Известно, что в полости рта (ПР) может быть выявлено до 700 видов микроорганизмов [1], однако в качестве основных пародонтопатогенов большинство авторов называют виды Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythensis и Treponema denticola [2, 4, 5, 10]. Немаловажным фактором являются симбиотические и антагонистические отношения между бактериями, которые необходимо учитывать при рассмотрении бактериальных инфекций пародонта. Так, некоторые авторы выделяют красный комплекс, обладающий устойчивостью in vivo и in vitro, состоящий из видов P. gingivalis, T. forsythensis и T. denticola [8]. Формирование этого комплекса на поверхности пародонта приводит к развитию наиболее тяжелых форм пародонтита [6].

Основным видом микроорганизмов, специфически ответственных за развитие пародонтита, большинство авторов называют P. gingivalis — грамотрицательную палочковидную анаэробную патогенную бактерию. Главными факторами патогенности этой бактерии считаются секреторные цистеиновые протеиназы Rgp и Kgp, которые оказывают множество воздействий на компоненты иммунной системы и способны дерегулировать ее ответ, в том числе расщепляя некоторые рецепторы Т-клеток [16]. Сведения о конкретной роли других пародонтопатогенов, включая компоненты красного комплекса, ограниченны, что вызвано, по-видимому, относительной легкостью культивирования P. gingivalis и, как следствие, — ее лучшей доступностью для экспериментального исследования на животных моделях и in vitro. Однако такой подход порождает риск предвзятой оценки относительной важности пародонтопатогенов.

Эксперименты по моделированию коинфекции пародонта компонентами красного комплекса выполнены на животных моделях [14]. Показано, что T. forsythensis наиболее склонна прикрепляться к поверхности клеток эпителия щеки по сравнению с другими пародонтопатогенами. Патогенные штаммы T. forsythensis секретируют активные протеазы, способные деградировать широкий набор белков организма человека, что, вероятно, представляет собой критическое патогенное свойство этой бактерии [7]. Потенциальными факторами патогенности T. forsythensis могут выступать трипсиноподобные секреторные протеазы, сиалидаза, гемагглютинин, белки S-слоя и поверхностная протеаза клеточной стенки BspA. Показано влияние BspA на скорость разрушения альвеолярной кости у мышей: белок BspA определяет также способность T. forsythensis прикрепляться к эпителию и вызывать абсцедирование [11]. Штамм P. gingivalis FDC 381 или суспензия микросом из культуры этого штамма стимулирует прикрепление T. forsythensis ATCC 43037 к эпителиальным клеткам [14].

T. forsythensis представляет собой строго анаэробную грамотрицательную палочку семейства Cytophaga-Bacteroidetes. Род Tannerella является сестринским в пределах семейства по отношению к роду Porphyromonas [12].

T. forsythensis хорошо растет на кровяном агаре, причем кокультивирование ее с P. gingivalis или F. nucleatum существенно ускоряет рост. При попытках выделить T. forsythensis в чистую культуру она, как правило, с трудом выделяется из комплекса с P. gingivalis, особенно при высеве смывов от больных тяжелыми формами пародонтита. Гомогенат T. forsythensis ATCC 43037, в свою очередь, стимулирует рост P. gingivalis ATCC 33277 на бедных средах, причем наблюдается дозовая зависимость этого эффекта [14]. Удивительно, что T. forsythensis не стимулирует рост мутантных вариантов P. gingivalis ATCC 33277, лишенных генов гингивопаинов rgpA и rgpB, хотя коинфекция P. gingivalis и T. forsythia существенно усиливает способность этих бактерий вызывать абсцесс [13].

В современной методологии исследования микробиома пародонта в норме и при патологии превалируют молекулярные методы диагностики в отличие от классических микробиологических подходов, встречающихся редко. В то же время, несмотря на наличие в литературе существенного числа работ по характеристике микробиоценоза пародонта с помощью методов глубокого секвенирования (NGS), публикации об исследованиях, проведенных на больших выборках пациентов методами количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), практически отсутствуют [3]. Методы NGS не подходят для рутинной диагностики заболевания. В результате оказывается утерянным важный массив данных о динамике количества патогенной и нормальной микрофлоры пародонта и влиянии на нее методов лечения пародонтита и гигиены ротовой полости. Использование простого и недорогого метода, позволяющего помочь в постановке диагноза и в динамике оценить изменения микрофлоры ПР, внесло бы существенный вклад как в диагностику, так и в прогнозирование развития заболевания.

Для выявления воспалительных заболеваний пародонта необходима разработка высокоточного и надежного метода обследования пациентов. Учитывая недостаточность клинических данных о конкретной роли P. gingivalis и T. forsythensis в развитии ХГП при наличии явных доказательств вовлеченности этих бактерий в разрушение пародонта, в рамках настоящей работы мы поставили перед собой цель исследовать количественную представленность T. forsythensis и P. gingivalis в микробиоме пациентов с ХГП в норме и при патологии, сопоставить роль T. forsythensis и P. gingivalis в развитии пародонтита у мужчин и женщин, исследовать взаимоотношения T. forsythensis с другими пародонтопатогенами в норме и при патологии, в том числе — в зависимости от пола пациента. Мы исследовали штаммы представленных пародонтопатогенов методом ПЦР в реальном времени и теперь предлагаем этот метод для диагностики воспалительных заболеваний пародонта.

Клинический материал был собран на базе ЦНИИС и ЧЛХ. Было обследовано 130 пациентов в возрасте от 21 года до 63 лет без тяжелой соматической патологии. В исследуемую выборку вошли 92 пациента с ХГП и 38 пациентов без патологии пародонта.

При составлении выборок для исследования раздельно анализировались выборки всех мужчин (53 человека), всех женщин (77), здоровых мужчин (18), мужчин с ХГП (35), здоровых женщин (23) и женщин с ХГП (53).

Диагноз ХГП устанавливали на основании совокупности жалоб пациентов (кровоточивость десен, неприятный запах изо рта, подвижность зубов и др.) и данных клинического обследования. Основным клиническим критерием для постановки диагноза ХГП являлось поражение зубодесневого прикрепления. Степень тяжести ХГП устанавливали на основании глубины ПК и степени деструкции костной ткани. Так, при легкой степени ХГП глубина ПК составляла до 3 мм, а рентгенологическая картина подтверждала признаки начальной деструкции межзубных перегородок. При средней степени ХГП глубина ПК варьировала от 3 до 6 мм. Деструкция кортикальной пластинки и костной ткани межзубных перегородок при рентгенологическом исследовании составляла до ½ длины корня. Тяжелая степень ХГП характеризовалась наличием ПК более 6 мм, патологической подвижностью зубов II—III степени, деструкцией кортикальной пластинки и костной ткани на протяжении более ½ длины корня.

Клинические данные о состоянии пародонта выражали в баллах: степень выраженности заболевания — от 1 до 5; глубина ПК — от 0 до 4, гноетечение — от 0 до 2, подвижность зубов — 0 до 3, кровоточивость десен — от 0 до 3 [1].

Для выполнения микробиологического исследования осуществляли забор содержимого ПК с помощью стерильных бумажных эндодонтических штифтов № 25, которые затем помещали в пробирку с реактивом Проба-Рапид объемом 0,5 мл. Далее образцы именовали пародонтальным смывом. Забор материала от каждого пациента проводили в 2 пробирки; на стадии выделения ДНК и проведения ПЦР содержимое каждой пробирки анализировали отдельно.

Суммарную ДНК микробов пародонтального смыва пациентов выделяли с помощью набора реагентов Проба-ГС в соответствии с инструкцией к набору реагентов. Препарат ДНК, соответствующий ¹/10 объема 1 смыва (50 мкл), растворяли в 50 мкл элюгирующего раствора. В качестве матрицы для проведения 1 ПЦР-реакции использовали 5 мкл полученного препарата.

С целью нормировки сигнала (учета разброса в количестве взятого биоматериала и эффективности экстракции ДНК) для каждого образца определяли величину «относительного Ct». Для этого из величины «абсолютного Ct» для специфического набора праймеров и зонда, усредненного по 2 образцам 1 серии, вычитали усредненную величину Ct общей бактериальной массы для тех же 2 образцов серии. Статистической обработке подвергали данные, выраженные в форме «относительного Ct».

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 8.0 для Windows по стандартным методикам вариационной статистики для непараметрических данных; сравнение полученных величин осуществляли путем анализа значений критерия Манна—Уитни: уровень статистической значимости принимали за 95% (p≤0,05). При анализе взаимосвязей внутри пары количественных или порядковых качественных признаков использовали корреляционный анализ по Спирману.

Содержание в пародонтальных смывах специфических последовательностей пародонтопатогенов A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis и T. denticola количественно анализировали с помощью ПЦР в реальном времени, используя набор Дентофлор. Результаты сравнительного анализа выборок результатов, нормированных на содержание общей 16S рДНК в образце, в виде параметра Ct были проанализированы с помощью программы Статистика. Для оценки степени различия параметров в выборках использовали критерий Манна—Уитни. При описании результата вычислялись медиана признака, квантили и значение критерия Фишера (р) (табл. 1).

Прежде всего были исследованы вовлеченность конкретных патогенов в развитие ХГП у пациентов исследуемой выборки, а также связь между гиперколонизацией пародонта тем или иным патогеном и отдельными клиническими симптомами пародонтита: кровоточивостью, патологической подвижностью и потерей зубов. Для этого с помощью критерия Манна—Уитни проверяли гипотезу о существовании статистически значимых различий между выборками контроля и выборками пациентов с выраженным комплексом симптомов (без разделения по полу) по представленности в консорциуме пародонта каждого из исследуемых патогенов (см. табл. 1).

Статистический анализ позволил сделать заключение, что колонизация пародонта 4 из 5 пародонтопатогенов по Сокранскому — P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis и T. denticola — в рамках исследованной выборки тесно коррелировала с наличием ХГП. Наиболее высокой эта корреляция была для P. gingivalis. В рамках исследованной выборки A. actinomycetemcomitans не является существенным фактором патогенеза, в равной мере встречаясь в выборке контроля и случая.

При анализе выборок с кровоточивостью десен выявлена положительная корреляция этого симптоматического признака с гиперколонизацией пародонта P. gingivalis, P. intermedia и T. denticola. Гиперколонизация пародонта T. forsythensis с этим признаком не ассоциирована. При анализе выборок с патологической подвижностью зубов выявляется положительная корреляция этого симптоматического признака с гиперколонизацией пародонта P. intermedia и T. forsythensis. Это наблюдение позволяет предполагать, что в размножении P. intermedia и T. forsythensis существенную роль играет механический фактор, обеспечивающий достаточное пространство для размножения в поддесневом слое пародонта. Анализ выборки пациентов с потерей зубов и контрольной выборки (без потери зубов) также обнаруживает корреляции с T. forsythensis, однако эти корреляции достаточно слабы: самые жесткие из них обнаружены для P. gingivalis и T. denticola.

Затем было проведено исследование парных корреляций между гиперколонизацией пародонта T. forsythensis и другими патогенами. Исследование отдельно проведено для всей исследуемой группы пациентов, группы ХГП и для группы контроля. Данные сравнительного анализа достоверности различий выборок с применением непараметрической статистики по Спирману представлены в табл. 2.

Удалось установить, что при исследовании всей совокупности пациентов вне зависимости от пола и диагноза наблюдается выраженная положительная зависимость гиперколонизации пародонта T. forsythensis и другими патогенами красного комплекса: P. gingivalis, P. intermedia и T. denticola (p — в диапазоне 10³—10⁴). При этом виды T. forsythensis и T. denticola образуют четко оформленный комплекс (p=6·10^–8). При анализе корреляций в представленности молекулярных маркеров в выборке ХГП обнаружено, что взаимная корреляция между представленностью пародонтопатогенов сохраняется только в отношении пары T. forsythensis — T. denticola (p=5,4·10^–4). В выборке контроля взаимных корреляций обсемененности пародонта патогенами не зафиксировано.

Далее аналогичный корреляционный анализ был выполнен для пар выборок ХГП/контроль отдельно для групп мужчин и женщин. В результате были установлены различия влияния T. forsythensis на развитие ХГП у мужчин и женщин. Статистическую обработку осуществляли как применением непараметрической статистики (по Манну—Уитни) (табл. 3), так и с использованием критерия Спирмана (табл. 4).

Анализ показывает бóльшую представленность T. forsythensis в пародонте больных мужчин, чем здоровых. Степень колонизации другими патогенами не коррелирует с наличием заболевания в исследуемой выборке. В выборке женщин анализ показывает достоверно бóльшую представленность бактериальных патогенов P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis и T. denticola в пародонте женщин с ХГП, чем в пародонте женщин без поражения пародонта.

Наиболее частой причиной возникновения ХГП у мужчин можно считать гиперколонизацию T. forsythensis. Возникновение пародонтита у женщин в первую очередь коррелирует с гиперколонизацией патогеном P. gingivalis, который совершенно не значим в этом качестве для мужчин. Гиперколонизация T. forsythensis и T. denticola в возникновении пародонтита у женщин играет существенно меньшую роль, чем P. gingivalis.

Анализ парных взаимосвязей между пародонтопатогенами с использованием непараметрического критерия Спирмана позволил проанализировать характер взаимосвязей между ними отдельно в группе мужчин и женщин (без разделения на контроль и случай) (см. табл. 4).

Анализируя выборку мужчин, мы установили наличие корреляции между гиперколонизацией пародонта 4 патогенами по Сокранскому: P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis и T. denticola (р — в диапазоне 0,03—0,001), а прочность комплекса T. forsythia и T. denticola характеризуется рекордной величиной р=10^–8.

Анализ выборки женщин показал, что корреляции между обсемененностью пародонтопатогенами значительно слабее или вообще не прослеживаются. Только гиперколонизация P. intermedia проявляет тенденцию к одновременной гиперколонизации T. forsythensis (р=0,02). При этом в группе женщин наблюдается распад стандартного комплекса T. forsythensis — T. denticola: вероятность совместной колонизации здесь характеризуется величиной p=0,1.

При сравнении выборок контроля и ХГП с применением критерия Манна—Уитни установлено, что T. forsythensis — самый распространенный патоген человека, вызывающий ХГП. При этом способность T. forsythensis вызывать развитие заболевания выражена меньше, чем у других патогенов.

Анализ парных взаимосвязей между клиническими критериями и молекулярными маркерами с использованием непараметрического критерия Спирмана позволил сделать вывод, что колонизация всеми патогенами, кроме A. actinomycetemcomitans, существенно коррелировала со степенью заболевания пародонта. При этом наиболее опасным патогеном оказался P. gingivalis (p=0,00004), за ним следуют участники комплекса T. forsythensis (p=0,00009) и T. denticola (p=0,0001), а замыкает ряд P. intermedia (p=0,004). Колонизация A. actinomycetemcomitans оказалась полностью независимой от степени заболевания, что отчасти может быть вызвано недостаточной разрешающей способностью использованной тест-системы Дентофлор в отношении вида A. actinomycetemcomitans: предполагается, что этот набор наряду с A. actinomycetemcomitans может выявлять другие бактерии этого рода, не являющиеся патогенами.

Для T. forsythensis характерно формирование комплекса с другими пародонтопатогенами; самые устойчивые связи характерны для пары T. forsythensis — T. denticola. Статистический анализ с применением метода вычисления коэффициента корреляции по Спирману показал, что 4 из 5 пародонтопатогенов по Сокранскому — P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis и T. denticola — показывают выраженную склонность к коинфекции (см. рисунок). Комплекс T. forsythensis — T. denticola наиболее стабилен, показывая R=6,5 (p=1,0·10^–8).

Сопоставление данных табл. 3 и 4 убедительно показывает наличие существенных различий в составе микробиома пародонта у мужчин и женщин, а также в механизме развития у них ХГП. Женщины, имея в среднем ту же степень обсемененности пародонта патогенами, что и мужчины, подвержены большему риску развития ХГП. При этом для женщин с ХГП (но не для здоровых женщин) характерно резкое доминирование одного какого-либо пародонтопатогена: заболевание, как правило, носит характер моноинфекции. При этом наиболее опасным возбудителем ХГП для женщин является P. gingivalis.

Напротив, для мужчин как в норме, так и при патологии характерно образование комплекса пародонтопатогенов, включающего в себя 4 из 5 пародонтопатогенов по Сокранскому: P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis и T. denticola. При этом для мужчин гиперколонизация T. forsythensis дает наиболее значимую ассоциацию с развитием ХГП.

В совокупности результаты исследования позволяют предположить, что T. forsythensis играет ключевую роль в формировании комплекса пародонтопатогенов, вероятно, выступая инициатором этого процесса. Принимая во внимание склонность мужчин к сочетанной инфекции пародонта, можно предполагать, что именно поэтому этот патоген играет более значимую роль в развитии заболевания у мужчин, чем у женщин. Не исключено, что процесс запуска формирования комплекса патогенов на пародонте зависит от способности T. forsythensis прочно прикрепляться к поверхности эпителиальных клеток, как описано в работе [14].