Введение
Неудачи использования программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в 70% наблюдений связаны с патологией эндометрия при имплантации, и лидирующим фактором считается хронический эндометрит (ХЭ) [1—4].
Значительную роль в патогенезе ХЭ играет хроническая активация клеточных и гуморальных воспалительных реакций в результате первичного патогенного микробного воздействия, сопровождающаяся повышенной выработкой цитокинов, иммунорегуляторных и острофазовых белков, а также других биологически активных веществ, обусловливающих нарушение микроциркуляции, экссудацию и отложение фибрина в строме эндометрия [3, 5—7]. Высокая частота абортов, «агрессивных» диагностических и лечебных манипуляций в гинекологии, а также увеличение заболеваемости бессимптомными инфекциями, передающимися половым путем, привели к увеличению частоты развития ХЭ [1, 4, 8—10]. Отсутствие стандартизированных подходов к оценке морфофункциональных характеристик эндометрия, а также методов прогнозирования вероятности наступления беременности после применения программ ЭКО затрудняет клиническое ведение пациенток с повторными неудачами имплантации [2, 7, 11—14], частота которых колеблется от 10 до 50%.
Кроме того, несмотря на успехи вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), вероятность родов при расчете на перенос одного эмбриона даже в идеальных условиях не превышает 31—38% [1, 2, 15]. Важность проблемы инфертильности при ХЭ определяет поиск дополнительных методов прогноза результативности программ ЭКО с использованием как клинических, так и различных иммунологических показателей.
Материал и методы
В исследование включены 63 пациентки с трубным фактором бесплодия в сочетании с ХЭ, которым была проведена процедура ЭКО на базе отделения ВРТ ООО «Медика-2» ГК «Мать и Дитя» Новокузнецка. У 25 пациенток беременность наступила, а у 38 исход был отрицательным.
Диагноз «хронический эндометрит» был установлен на основании результатов трансвагинальной эхографии, допплерографического исследования, гистероскопии, морфологического исследования аспиратов эндометрия на 19—21-й день менструального цикла. Всем пациенткам проводилось комплексное обследование в соответствии с приказом МЗ №107н от 30.08.12 «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению».
Критерии включения в программу исследования: возраст от 26 до 35 лет, овуляторный менструальный цикл, отсутствие противопоказаний к проведению ЭКО, морфологически верифицированный ХЭ, толщина эндометрия не менее 8 мм по данным УЗИ, нормальные показатели спермограммы у партнера (двукратное исследование). Группы были сопоставимы по количеству оплодотворившихся ооцитов, бластуляции и количеству переносимых эмбрионов. Использовались зрелые ооциты в стадии MII.
Иммунологическое исследование выполнено в условиях научно-исследовательской лаборатории иммунологии Новокузнецкого государственного института усовершенствования врачей.
Забор внутриматочных смывов осуществляли перед вступлением в программу ЭКО на 19—21-й день менструального цикла. Смывы из полости матки пациенток получали через пластмассовый катетер диаметром 2 мм, в полость матки вводили 3 мл изотонического раствора хлорида натрия, экспозиция составляла около 1 мин, затем содержимое аспирировали. Получаемые образцы биожидкостей маркировали, замораживали и хранили при температуре –20 °C.
В составе эндометриальных смывов определяли альфа2-макроглобулин (α2-МГ), альбумин, лактоферрин и цитокины (ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8).
После индукции суперовуляции у всех участниц ЭКО исследовали сыворотку крови и фолликулярную жидкость (ФЖ) в день трансвагинальной пункции (TVP) фолликула на наличие содержания перечисленных белков и цитокинов.
Концентрацию α2-МГ в сыворотке крови и ФЖ определяли с помощью низковольтного ракетного иммуноэлектрофореза и моноспецифической антисыворотки к данному белку. Для определения уровня α2-МГ в эндометриальных смывах использовали сконструированную de novo иммуноферментную тест-систему.
Содержание лактоферрина и цитокинов во всех биожидкостях исследовали с помощью сертифицированных коммерческих тест-систем НПО «Вектор-Бест», Новосибирск.
Для определения уровня альбумина в крови и ФЖ использовали биохимический метод с бромкрезоловым зеленым, общего белка — стандартный биохимический метод. Уровни альбумина в эндометриальных смывах изучали методом ракетного иммуноэлектрофореза и моноспецифической антисыворотки.
Для статистической обработки полученных данных использовали сертифицированную программу INSTAT II. В качестве метода моделирования выбран метод штрафной логистической регрессии (penalized logistic regression). Выбор метода объясняется необходимостью оценки вклада каждого фактора в прогнозируемый эффект и использования дихотомической шкалы измерения выходной величины. Оценку параметров модели проводили на обучающем множестве, оценку качества модели — на тестовом. Результаты моделирования представлены оценками коэффициентов (b), статистической значимостью входных переменных (p), оцененной с помощью теста Вальда (W), отношением шансов (ОШ) и его 95% доверительным интервалом.
Результаты и обсуждение
В эндометриальных смывах при ХЭ и отрицательном исходе выявлена повышенная концентрация α2-МГ: при наступлении беременности (Бер+) — 2,49,0±0,33 мг/л, в отсутствие беременности (Бер–) — 7,28±1,49 мг/л; p=0,007) и тенденция к повышению уровня альбумина (Бер+ 0,3±0,07 г/л, Бер– 0,37±0,06 г/л). Известно, что данные белки — высокомолекулярный α2-МГ (725 kd) и низкомолекулярный альбумин (56 kd) синтезируются преимущественно гепатоцитами печени, и увеличение их концентрации в матке является следствием экссудации, что свидетельствует о неселективном нарушении сосудистой проницаемости в эндометрии и остаточных явлениях воспалительных процессов. Показатели лактоферрина, синтезируемого клетками эндометрия, не зависели от исхода (Бер+ 0,81±0,17 мг/л, Бер– 0,59±0,08 мг/л). Однако уровень этого белка у пациенток с ХЭ был существенно ниже чем в эндометриальных смывах здоровых женщин (1,45±0,2 мг/л; p<0,0001), что было показано нами ранее [16]. Установлено, что данный белок синтезируется локально эпителиальными клетками, обладает не только выраженными противовирусными и антибактериальными свойствами, но и модулирует синтез цитокинов, включая факторы роста. Соответственно, его дефицит указывает на сниженный потенциал местного иммунитета слизистых оболочек у женщин с ХЭ и во многом обусловливает повышенный риск инфицирования у некоторых женщин [2, 12, 17]. Уровни цитокинов (ИЛ-6, ФНО-α и ИЛ-8) в составе эндометриальных смывов не зависели от исхода программы: ИЛ-6 — Бер+ 89,9±33 пг/мл; Бер– 67,7±15,7 пг/мл; ФНО-α — Бер+ 2,0±0,4 пг/мл; Бер– 3,4±0,9 пг/мл; ИЛ-8 — Бер+ 260,2±38,7 пг/мл; Бер– 238,4±30,5 пг/мл).
Концентации α2-МГ, лактоферрина и общего белка в сыворотке крови пациенток программы ЭКО не зависели от исхода ее применения: α2-МГ — Бер+ 2,57±0,08 г/л; Бер– 2,45±0,1 г/л); ЛФ (Бер+ 1,11±0,09 мг/л; Бер– 1,21±0,09 мг/л). При этом уровни альбумина в крови пациенток программы ЭКО перед TVP при неудачных исходах были статисически значимо снижены — Бер+ 45,42±0,43 г/л; Бер– 43,23±0,73 г/л; p=0,009). Снижение концентрации альбумина в крови при негативных исходах программы, по всей вероятности, ассоциировано с остаточными явлениями воспалительного процесса в эндометрии.
Аналогичные данные получены и при исследовании фолликулярной жидкости. Показатели α2-МГ и лактоферрина не зависели от исхода программы: Бер+ α2-МГ — 0,14±0,02 г/л, ЛФ — 0,2±0,02 мг/л); Бер– α2-МГ — 0,14±0,02 г/л, ЛФ — 0,23±0,03 мг/л). Уровни альбумина и общего белка при этом были значительно снижены в ФЖ при отрицательных исходах: альбумин — Бер– 37,19±1,3 г/л против 41,54±0,62 г/л при Бер+; p=0,009; общий белок — 52,0±2,15 г/л при Бер– против 60,96±1,26 г/л при Бер+; p=0,002. Мы полагаем, что установленный нами дефицит альбумина и общего белка в ФЖ при ХЭ влияет на развитие ооцитов и способствует негативному исходу программы.
Содержание изученных нами цитокинов (ИЛ-6, ФНО-α и ИЛ-8) в составе сыворотки крови, эндометриальных смывов и ФЖ соответствовало описанному в литературе [5, 12, 16, 18, 19] и не влияло на результативность программ ЭКО, за исключением уровня ФНО-α в сыворотке крови перед TVP (статистически значимое повышение в нерезультативных программах: Бер+ 1,2±0,2 пг/мл; Бер– 2,2±0,3 пг/мл; p=0,008). Несмотря на невысокие среднестатистические показатели ФНО-α наше исследование выявило, что у 70% участниц ЭКО в результативных программах данный цитокин в крови не определялся, в то время как при отрицательных исходах обнаруживался в 100% случаев. Полученные результаты служат косвенным подтверждением наличия остаточных воспалительных процессов в эндометрии у женщин при отрицательном исходе программ ЭКО [7, 9, 12, 16].
В результате математического моделирования с использованием клинико-иммунологических показателей в крови, эндометриальных смывах и ФЖ у пациенток программы ЭКО с ХЭ, полученных с помощью логистической регрессии, установлено, что отрицательный прогноз программ ЭКО чаще встречался у пациенток с выкидышами и неудачными исходами программ ЭКО в анамнезе, а также в возрасте старше 30 лет.
Для всех анализируемых количественных показателей, по которым были выявлены статистически значимые различия в зависимости от исхода беременности, была рассчитана критическая точка (точка, определяющая интервалы диапазона изменения переменной, между которыми различия распространенности зависимого признака максимальны), для расчета применялся метод весовых категорий (WOE).
На следующем этапе проводилось построение прогнозирующей модели отрицательного исхода программы ЭКО. Входными переменными были клинические и иммунологические показатели. Поскольку набор входных переменных различается по значимости в зависимости от диагноза, для моделирования были сформированы бинарные переменные, отражающие сочетание диагноза и одного из факторов риска.
Общая оценка согласия модели и реальных данных анализировалась с использованием теста Хосмера—Лемешова χ2HL=3,5, df=7, p=0,835. Результаты теста свидетельствуют, что модель и реальные данные статистически значимо не различаются. В качестве критерия, определяющего возможность классификации с помощью построенной модели, использовался критерий Колмогорова—Смирнова для двух выборок. Полученные значения (D=0,77; df=10; p<0,001) свидетельствуют, что модель обладает статистически значимой классифицирующей способностью.
Качество модели оценивалось с помощью ROC-кривой, оценка проводилась на обучающем и тестовом множестве. Показатель AUC (площадь под ROC-кривыми) на обучающем множестве равен 0,90, на тестовом — 0,94, что интерпретируется как отличное качество прогноза.
Точность модели (общая доля верно выявленных случаев) проверялась на тестовой выборке и составила 90% (18/20). Чувствительность модели (способность прогнозировать отрицательный результат программы) составляет 92% (11/12). Специфичность модели (способность прогнозировать положительный исход программы) составляет 88% (7/8). Прогностическая ценность отрицательного результата прогноза (вероятность того, что беременность не наступит, если модель прогнозировала отрицательный результат) составляет 88% (7/8). Прогностическая ценность положительного результата прогноза (вероятность того, что беременность наступит, если модель прогнозировала положительный результат) составляет 92% (11/12).
На основе построенной модели риска отрицательного исхода ЭКО при использовании рассчитанных значений коэффициентов логистической регрессии была разработана скрининговая шкала. Баллы, соответствующие каждому фактору риска, представлены в таблице.
Прогностическая шкала отрицательного результата программы ЭКО при трубно-перитонеальном бесплодии, осложненном хроническим эндометритом
| Фактор риска | Предикторы исхода ЭКО | Баллы |
| Гинекологический анамнез | Повторная попытка ЭКО при предыдущих неудачах | +6 |
| Наличие одного и более выкидышей | +9 | |
| Хронический эндометрит | Возраст старше 30 лет (включительно) | +2 |
| В сыворотке крови: альбумин менее 42,4 г/л | +7 | |
| В сыворотке крови: ФНО-α более 3,0 пг/мл | +6 | |
| В фолликулярной жидкости: альбумин менее 36,0 г/л | +5 | |
| В фолликулярной жидкости: общий белок менее 59,2 г/л | +4 | |
| В маточных смывах: α2-МГ более 4,1 мг/л | +10 |
Пороговая сумма баллов (сумма баллов, после которой вероятность отрицательного исхода программы статистически значимо выше, чем положительного) определялась с помощью индекса Юдена и составила 20.
По результатам исследования разработан прогнозирующий алгоритм отрицательного исхода программы: определены факторы риска, и каждому фактору начислен соответствующий балл.
При трубной причине бесплодия, ассоциированной с ХЭ, определяются факторы риска и соответствующие этим факторам баллы. После этого все баллы суммируются и если итоговая сумма баллов выше 20, то прогнозируется высокий риск отрицательного исхода программы ЭКО. В этом случае рекомендуется криоконсервация эмбрионов с отсроченным их переносом в полость матки.
Заключение
Предикторами отрицательного исхода программы ЭКО при трубно-перитонеальном бесплодии, ассоциированном с хроническим эндометритом, являются возраст старше 30 лет, неудачи ЭКО, потери беременности в анамнезе, повышенная концентрация α2-МГ (>4,1 мг/л) в эндометриальных смывах на 19—21-й день менструального цикла, сниженный уровень общего белка (<59,2 г/л) и альбумина (<36,0 г/л) в фолликулярной жидкости во время трансвагинальной пункции фолликула, сниженное содержание альбумина в крови (<42,4 г/л) на фоне повышенного уровня сывороточного ФНО-α (>3,0 пг/мл) в день TVP.
Внедрение в практику скрининговой шкалы отрицательного исхода программ ЭКО и алгоритма действий позволит персонализировать ведение женщин с ХЭ при трубно-перитонеальном бесплодии. При сумме баллов более 20 прогнозируется высокая вероятность отрицательного исхода программы ЭКО, что диктует необходимость криоконсервациии и отсроченного переноса эмбриона в полость матки.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Я.Н. Сорокина, В.В. Лихачева, Т.В. Третьякова, А.Е. Власенко, Л.В. Ренге
Сбор и обработка материала — Я.Н. Сорокина, Т.В. Третьякова, А.Е. Власенко
Статистическая обработка данных — Я.Н. Сорокина, А.Е. Власенко
Написание текста — Я.Н. Сорокина, Т.В. Третьякова, А.Е. Власенко
Редактирование — В.В. Лихачева, С.В. Шрамко, Л.В. Ренге
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of authors:
Concept and design of the study — Ya.N. Sorokina,V.V. Likhacheva, T.V. Tret’yakova, A.E. Vlasenko, L.V. Renge
Data collection and processing — Ya.N. Sorokina, T.V. Tret’yakova, A.E. Vlasenko
Statistical processing of the data — Ya.N. Sorokina, A.E. Vlasenko
Text writing — Ya.N. Sorokina, T.V. Tret’yakova, A.E. Vlasenko
Editing — V.V. Likhacheva, S.V. Shramko, L.V. Renge
Authors declare lack of the conflicts of interests.