Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Краснопольская К.В.

Московский областной НИИ акушерства и гинекологии;
кафедра акушерства и гинекологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского

Бекетова А.Н.

ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Минздрава Московской области, Москва, Россия;
ООО «Международная клиника «Семья», Москва, Россия

Сесина Н.И.

ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Минздрава Московской области, Москва, Россия;
ООО «Международная клиника «Семья», Москва, Россия

Чинченко Н.К.

ООО «Международная клиника «Семья», Москва, Россия

Бадалян Г.В.

ООО «Международная клиника «Семья», Москва, Россия

Сударикова Н.М.

ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Минздрава Московской области, Москва, Россия;
ООО «Международная клиника «Семья», Москва, Россия

Бочарова Т.В.

ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Минздрава Московской области, Москва, Россия;
«ПРИОР-клиника», Москва, Россия

Захарченко Е.О.

«ПРИОР-клиника», Москва, Россия

Влияние кратковременного нарушения условий культивирования эмбрионов трех суток на их развитие и потенциал к имплантации

Авторы:

Краснопольская К.В., Бекетова А.Н., Сесина Н.И., Чинченко Н.К., Бадалян Г.В., Сударикова Н.М., Бочарова Т.В., Захарченко Е.О.

Подробнее об авторах

Журнал: Российский вестник акушера-гинеколога. 2019;19(3): 57‑62

Просмотров: 710

Загрузок: 13

Как цитировать:

Краснопольская К.В., Бекетова А.Н., Сесина Н.И., Чинченко Н.К., Бадалян Г.В., Сударикова Н.М., Бочарова Т.В., Захарченко Е.О. Влияние кратковременного нарушения условий культивирования эмбрионов трех суток на их развитие и потенциал к имплантации. Российский вестник акушера-гинеколога. 2019;19(3):57‑62.
Krasnopol'skaia KV, Beketova AN, Sesina NI, Chinchenko NK, Badalyan GV, Sudarikova NM, Bocharova TV, Zakharchenko EO. Influence of short-term disturbance of embryo cultivation conditions on the embryo’s developmentand potential for implantation. Russian Bulletin of Obstetrician-Gynecologist. 2019;19(3):57‑62. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/rosakush20191903157

?>

Культивирование эмбрионов, полученных в программах ЭКО, является важнейшим этапом на пути к наступлению беременности и рождению здорового ребенка. В настоящее время уделяется большое внимание контролю качества этого этапа, что включает контроль условий культивирования: температуры, рН среды культивирования, осмолярности и т. д. [1]. Одним из важных критериев оценки качества культивирования является частота имплантации эмбрионов.

В настоящее время общепринятым является культивирование эмбрионов до 5-х суток развития. Показано, что частота наступления беременности, а также рождения ребенка статистически выше при переносе эмбрионов на 5-е сутки развития, чем при переносе эмбрионов 3-х суток развития, что обусловлено возможностью отбора эмбрионов наивысшего качества, достигших стадии бластоцисты [2—4]. Наилучшей стратегией культивирования эмбрионов является их непрерывное пребывание в оптимальных условиях. Современные инкубаторы и усовершенствованные культуральные среды позволяют контролировать большинство параметров без вмешательства. Существует две причины нарушения «идеальных условий культивирования»: необходимость получения информации об оплодотворении и развитии эмбриона, а также использование многоступенчатых сред для культивирования, что однозначно приводит к переносу эмбрионов из одной среды культивирования в среду следующей ступени. При этом происходит кратковременное изменение нескольких параметров: рН среды, температуры, условий освещенности. Такие нарушения являются факторами риска, влияющими на качество эмбрионов и их потенциал к имплантации.

Влияние каждого из этих факторов описано в литературе. Для сред культивирования общепринятым является карбонатный буфер, регулирующий pH среды. Оптимальное культивирование осуществляется в газовом инкубаторе с 5,5—6% содержанием СО2, которое поддерживает рН 7,2—7,3. Даже незначительное повышение pH во время манипуляций вне инкубатора существенно влияет на гомеостаз (ферментативная активность, клеточное дробление, дифференцировка, транспорт через мембраны, элементы цитоскелета) и уровни экспрессии генов [5—7].

Один из важнейших факторов культивирования — поддержание температуры. Ооцит является наиболее чувствительным к изменениям температуры in vitro. Изменение температуры даже на 1 °C приводит к разборке веретена деления, восстановление которого происходит не всегда [6, 8]. Данные нарушения веретена деления приводят к анеуплоидиям, нарушениям развития эмбрионов и снижению их потенциала к имплантации. Эмбрион на стадии дробления также весьма чувствителен к изменениям температуры. Толерантность к изменениям температуры несколько увеличивается после стадии компактизации (стадия морулы).

Кратковременное нарушение условий культивирования, возникающее из-за необходимости визуальной оценки эмбриона, также может быть связано с воздействием источника света. В условиях in vivo эмбрион не подвергается воздействию источников света. При культивировании in vitro основное время эмбрион также находится в темноте. Показано, что воздействие света может оказывать как прямое влияние на эмбрионы (повреждение ДНК, митохондриальная дегенерация, образование активных форм кислорода в цитоплазме) [9], так и опосредованное через фотоокисление компонентов среды (например, рибофлавин, распадающийся до триптофана, замедляет дробление эмбрионов) [6]. Показано также, что воздействие света на парафиновое масло может приводить к каскадной реакции пероксидов, результатом которой является перенос водорастворимых контаминантов в культуральную среду [10].

Для минимизации воздействия этих факторов перевод из одной среды в другую стараются сочетать с оценкой развития эмбриона, что позволяет избежать многократного нарушения условий культивирования, однако это приводит к увеличению времени нахождения эмбрионов вне оптимальных условий. Актуальным вопросом является поиск равновесия между стабильностью условий культивирования и практической необходимостью получения информации о развитии эмбрионов.

Цель исследования — оценить влияние кратковременного нарушения условий культивирования эмбрионов 3-х суток, неизбежно возникающего при световой микроскопии во время оценки морфологических параметров, на их дальнейшее развитие и потенциал к имплантации.

Материал и методы

Стимуляцию яичников в контролируемых циклах ЭКО выполняли с использованием либо длинного протокола down-регуляции с назначением агониста ГнРГ, либо короткого протокола с антагонистом ГнРГ. Контроль за индуцируемым фолликулогенезом проводили с помощью УЗИ. Фолликул расценивали как функционально зрелый при достижении размера 17—18 мм и уровня эстрадиола в сыворотке крови не менее 300 пмоль/л в расчете на каждый фолликул диаметром более 15 мм. День введения триггера финального созревания фолликулов определяли на основании среднего диаметра доминантного фолликула (не менее 17 мм) и толщины эндометрия (не менее 8 мм).

Трансвагинальная пункция (ТВП) фолликулов проводилась через 35—36 ч после введения триггера овуляции. Оплодотворение осуществлялось не позднее чем через 40 ч после введения триггера (гонадотропин хорионический). Оценка оплодотворения происходила спустя 16—20 ч. Эмбрионы культивировали группами не более 5 эмбрионов в каплях среды под минеральным маслом в трехступенчатой системе культивирования. На 1-е и 3-и сутки развития эмбрионов осуществлялась смена сред с учетом рекомендаций производителя. Оценка эмбрионов на 3-и и 5-е сутки производилась с использованием классификации по Гарднеру [11], одновременно с переводом в среду следующего этапа культивирования. При этом у 730 (58%) пациенток на 3-и сутки эмбрионы максимально быстро переводили в среду следующей стадии культивирования под контролем бинокуляра, без подробного морфологического описания эмбрионов, тогда как у 523 (42%) пациенток на 3-и сутки происходила оценка качества эмбрионов под инвертированным микроскопом NIKON Ti с последующим протоколированием, что увеличивало время нахождения вне инкубатора на 30 с (на каждые 5 оцененных эмбрионов).

В соответствии с поставленной целью были проанализированы результаты программ ЭКО у 1744 больных с бесплодием в возрасте от 23 до 46 лет по числу эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, и по показателям частоты наступления беременности (ЧНБ) на перенос эмбрионов 5-х суток развития (выявление с помощью УЗИ плодного яйца на 21-е сутки после ПЭ). Кроме того, была оценена результативность программ ЭКО при переносе эмбрионов 3-х суток (491 пациентка) и 5-х суток (1253 пациентки).

Полученные результаты обрабатывали с использованием методов вариационной статистики, представленных в программе R 3.3.2 с использованием точного критерия Фишера. Для учета эффекта множественных сравнений при анализе разных возрастных групп применяли поправку Бонферрони, в связи с чем критический уровень значимости р=0,01.

Результаты

На основании анализируемых данных можно видеть, что перенос эмбрионов в основном осуществлялся на 5-е сутки развития — 72% (табл. 1),

Таблица 1. Частота наступления беременности при переносе эмбрионов на 3-и сутки и на 5-е сутки развития
при этом ЧНБ по полученным нами данным при переносе эмбрионов на 3-и или 5-е сутки развития статистически не различается.

Можно увидеть, что при оценке эмбрионов на 3-и сутки развития у пациенток старшего репродуктивного возраста имеет тенденцию к снижению ЧНБ (табл. 2)

Таблица 2. Частота наступления беременности в разных возрастных группах пациенток при переносе эмбрионов на 5-е сутки развития с учетом оценки качества эмбрионов на 3-и сутки развития или без таковой
(в среднем на 10% ниже по сравнению с таковой в группе пациенток, в которой не осуществлялась оценка развития эмбрионов), однако эта разница статистически недостоверна (рис. 1).
Рис. 1. Частота наступления беременности в разных возрастных группах пациенток в зависимости от наличия или отсутствия оценки качества эмбрионов на 3-и сутки.

Анализ количества полученных бластоцист показал наличие статистически достоверных различий при проведении оценки качества эмбрионов и без их оценки в возрастных группах пациенток до 39 лет (табл. 3, рис.

Таблица 3. Частота формирования бластоцист в разных возрастных группах пациенток в зависимости от наличия или отсутствия оценки качества эмбрионов на 3-и сутки развития
2).
Рис. 2. Частота формирования бластоцист в разных возрастных группах в зависимости от наличия или отсутствия оценки качества эмбрионов на 3-и сутки (* — различие количества бластоцист в группе в зависимости от наличия или отсутствия оценки качества эмбрионов достоверно — р<0,01).
В особенности эти различия высоки у пациенток старше 36 лет. Статистически достоверных различий по числу полученных бластоцист у пациенток старше 40 лет получить не удалось, что, по всей вероятности, связано с малым числом пациенток данной возрастной группы (56 пациенток из группы без оценки эмбрионов и 58 пациенток из группы с оценкой эмбрионов).

Обсуждение

Предымплантационный период развития эмбрионов — один из самых чувствительных периодов в развитии организма. Культивирование in vitro является наиболее важным фактором в изменениях эпигенетического перепрограммирования и развития эмбрионов в программах ЭКО. Все большее число исследований подтверждают влияние культуральной среды на эпигенетическое предымплантационное развитие. Одним из предполагаемых механизмов являются возможные ошибки метилирования, возникающие уже на 6—8-клеточной стадии развития эмбриона [12—14].

При этом существуют четкие различия в реакции эмбриона на стресс. Стадии ооцита и дробления гораздо более уязвимы, чем таковые после компактизации [13] (рис. 3).

Рис. 3. Восприимчивость эмбриона на разных стадиях развития к факторам внешней среды [13].

Однако с учетом необходимости оценки оплодотворения, а также с целью перехода на следующую ступень культивирования полностью отказаться от вторжений сложно.

По данным литературы, а также результатов этого исследования, пролонгированное культивирование эмбрионов до 5-х суток развития не оказывает негативного влияния на потенциал имплантации по сравнению с их культивированием и переносом на 3-и сутки развития. По мнению большинства авторов, результативность программ ЭКО значительно выше при переносе эмбрионов на 5-е сутки, что также свидетельствует об отсутствии неблагоприятного влияния длительного культивирования на эмбрионы.

Однако полученные нами данные показывают, что увеличение времени нахождения эмбрионов на 3-и сутки развития вне «идеальных» условий снижает процент бластуляции эмбрионов, а также влияет на ЧНБ, особенно у пациенток старшего репродуктивного возраста (статистическую достоверность данных осуществить не удалось в связи с малым числом пациенток). Эти результаты подтверждаются исследованиями, которые показывают увеличение толерантности эмбрионов к изменениям условий культивирования после стадии компактизации.

Существует несколько возможностей минимизации воздействия на эмбрионы — переход на одноступенчатые среды для культивирования, а также использование систем time-lapse микроскопии. Несмотря на все преимущества использования одноступенчатых культуральных сред, во-первых, они не имитируют изменения окружающей среды эмбриона при продвижении по маточным путям in vivo; во-вторых, в условиях непрерывного культивирования до 5-х суток развития происходит постепенное накопление продуктов распада протеинов при температуре 37 °C, включая аммоний [15—17], что приводит к изменениям экспрессии большого количества генов, вовлеченных в метаболизм клетки.

Безусловно, культивирование с использованием трехступенчатых сред является оптимальным вариантом, однако для минимизации нарушения «идеальных» условий стоит отказаться от дополнительной оценки эмбрионов на 3-и сутки развития.

Выводы

1. Установлено, что частота наступления беременности при переносе эмбрионов на 3-и и 5-е сутки развития не отличается.

2. Проведение оценки качества развития эмбрионов на 3-и сутки не оказывает значительного влияния на ЧНБ и потенциал к имплантации. Однако более длительное пребывание эмбрионов вне инкубаторов при дополнительном анализе качества их развития на 3-и сутки оказывает влияние на количество полученных бластоцист, т. е. на процесс бластуляции эмбриона, особенно у пациенток старшего репродуктивного возраста.

Сведения об авторах

Краснопольская К.В. — д.м.н., проф., член-корреспондент РАН; e-mail: Ksu0207@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-1275-9220

Бекетова А.Н. — к.м.н.; e-mail: nasti.b@hotmail.com; https://orcid.org/0000-0003-1415-7351

Сесина Н.И. — e-mail: sesina@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-7357-6682

Чинченко Н.К. — e-mail: nataliyachinchenko@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-5552-9302

Бадалян Г.В. — e-mail: bgohar@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6636-979X

Сударикова Н.М. — e-mail: icing6131@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-4584-8174

Бочарова Т.В. — e-mail: t.v.bocharova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-3747-6067

Захарченко Е.О. — e-mail: Katerina-bio@ya.ru; https://orcid.org/0000-0001-6570-4525

*e-mail: Ksu0207@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-1275-9220

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail