Преэклампсия в настоящее время продолжает оставаться одним из наиболее распространенных осложнений беременности, приводящим к серьезным нарушениям в организмах матери и плода. В структуре материнской и перинатальной заболеваемости и смертности преэклампсия занимает третье место и ее частота от общего числа родов, по данным разных авторов, составляет от 11 до 16% [1—3].

Патохимические и патофизиологические механизмы развития преэклампсии закладываются уже на ранних этапах беременности и обусловлены прежде всего неполноценной инвазией трофобласта с последующим формированием глубоких метаболических повреждений в системе мать—плацента—плод. В сложной цепи этих нарушений большое значение может иметь модификация баланса между анаболизмом и катаболизмом белков, реализующих информационную программу клеток и выполняющих регуляторные, трофические, рецепторные, транспортные и другие функции [4]. Сдвиг данного баланса сопровождается значительными биохимическими изменениями в материнском организме, а также в фетоплацентарной системе [5]. В то же время, если белоксинтезирующие реакции в этой системе в определенной степени изучены [5, 6], то информация о процессах деструкции белков весьма недостаточна. Существенное место в указанных процессах занимают протеиназы (пептидгидролазы), которым принадлежит центральная роль в процессах биологического распада и обновления белковых молекул.

Цель настоящей работы — изучение активности кислых и нейтральных пептидгидролаз и окислительной модификации белков в сыворотке крови, плаценте и околоплодных водах при физиологической беременности и осложненной преэклампсией.

Настоящее исследование проведено на базе клинических и научных подразделений ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» (РНИИАП) М.З. России (консультативная поликлиника, отделение патологии беременных, родильное отделение, отдел медико-биологических проблем). В проспективное исследование методом случайной выборки были включены 62 женщины в возрасте от 22 до 29 лет (в среднем 25,1±0,4 года), у 34 из которых беременность в конце II триместра осложнилась преэклампсией (основная группа), у 28 беременность и роды протекали без осложнений (контрольная группа). Степень преэклампсии согласно международной классификации МКБ-10 соответствовала коду 014.0—преэклампсия (нефропатия) средней тяжести. По возрасту, индексу массы тела, регулярности цикла, паритету беременности и родов, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу пациентки обследуемых групп были сопоставимы. В обеих группах преобладали первородящие женщины: в основной группе они составили 58,9%, в контрольной — 62,2%. Прерывания беременности по желанию женщины имелись в 23,5 и 21,4% соответственно в основной и контрольной группах. Самопроизвольные выкидыши у женщин обследованных групп отсутствовали. Кесарево сечение по показаниям к оперативному родоразрешению у плода было произведено у 3 женщин с преэклампсией. Критериями исключения из исследования были декомпенсированные формы соматических заболеваний, тяжелые формы преэклампсии, аутоиммунная патология. Исследование было одобрено Локальным этическим комитетом ФГБУ РНИИАП.

Материалом исследования служили сыворотка крови, околоплодные воды, полученные при вскрытии плодного пузыря в I периоде родов (беременность 39—40 нед) и плаценты, взятые сразу после родов при соблюдении холодового режима. В работе использованы 10% гомогенаты плаценты, из которых в 0,2-молярном растворе сахарозы методом дифференциального центрифугирования (рефрижераторная ультрацентрифуга) последовательно выделяли фракцию ядер (осадок, 1000 g, 15 мин), митохондрий (осадок, 12 тыс. g, 20 мин) и цитоплазму (супернатант после центрифугирования при 105 тыс. g, 60 мин). Мембранную фракцию получали методом дифференциального центрифугирования, описанным для плацентарной ткани (N. Smith, M. Brush, 1978).

Активность пептидгидролаз (КФ 3.4.4) определяли по степени нарастания растворимых в трихлоруксусной кислоте фолинположительных соединений после инкубации проб исследуемого объекта с буферными растворами (рН 3,6 и 7,1) и экзогенными белками-субстратами: 1% растворами гемоглобина и альбумина соответственно для кислых и нейтральных пептидгидролаз. Для построения калибровочной кривой использовали стандартные растворы тирозина.

О посттрансляционной (происходящей после синтеза белка на рибосоме) окислительной модификации белков судили по реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков (карбонильных производных) с 2,4-динитрофенилгидразином, конечные продукты которой регистрировали спектрофотометрически. Анализировали спонтанное и металлкатализируемое окисление белков, в последнем случае для инициации процессов окисления белков пробы инкубировали в присутствии металлов переменной валентности (солей двухвалентного железа) и перекиси водорода [7].

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 5.1. фирмы «StatSoft. Inc.»). Достоверность различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) и его аналогу для непараметрических распределений по критерию Манна—Уитни. Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.

Проведенные нами исследования свидетельствуют о том, что преэклампсия развивается на фоне значительных изменений активности протеолитических процессов в различных биологических объектах (табл. 1). Для обоих видов изученных ферментов (кислые и нейтральные пептидгидролазы) характерно повышение активности, степень которого зависит от оптимума их действия, причем нарушение активности имеет место и на локальном, и на системном уровне. Так, в сыворотке крови активность кислых и нейтральных пептидгидролаз при преэклампсии выше, чем при физиологической беременности на 31 и 24,3% соответственно. Следует отметить, что во всех случаях увеличение активности кислых пептидгидролаз более выражено, чем нейтральных. В околоплодных водах, во многом отражающих состояние плода, повышение активности ферментов при преэклампсии составляет 25,2% для кислых пептидгидролаз и 21% — для нейтральных. Для плацентарных пептидгидролаз, действующих в кислой среде, характерно увеличение активности на 35,1%, для нейтральных — на 26,4%.

Важную информацию для уточнения возможных последствий изменения активности пептидгидролаз в плацентарной ткани дает анализ распределения этих ферментов в ее субклеточных фракциях (табл. 2). Обращает внимание, что максимальная активность протеолитических ферментов имеет место в цитоплазме, затем в убывающем порядке следуют мембраны, митохондрии и ядра. При беременности, осложненной преэклампсией, активность кислых пептидгидролаз в наибольшей степени повышена в митохондриях (на 34,5%). В цитоплазме увеличение активности ферментов, действующих при рН 3,6, составляет 29,7%, в мембранах — 24,5%, в ядерной фракции — 18,5%. Максимальное увеличение активности нейтральных пептидгидролаз наблюдается в цитоплазме (на 35,2%), минимальные изменения (как и для кислых пептидгидролаз) обнаружены в ядрах (на 16,7%). В митохондриях и клеточных мембранах активность нейтральных протеолитических ферментов повышена на 28,5 и 20,4% соответственно.

Усиление интенсивности деструктивных повреждений белков при преэклампсии вряд ли остается без существенных последствий для их структуры и биологической активности. Причем, наряду с определенными общими функциями различных белковых молекул имеется специфика в механизмах клеточной регуляции, осуществляемой белками различных субклеточных фракций. Учитывая функции митохондрий, можно полагать, что значительное повышение гидролиза их белков под действием пептидгидролаз, активных как в кислой, так и в нейтральной среде, будет нарушать процесс клеточного дыхания и снижать энергетический потенциал плацентарной ткани в целом.

К развитию глубоких нарушений способна также привести существенная активация ферментов, особенно нейтральных протеиназ, в цитоплазме. В состав цитоплазмы входит большая часть всего спектра белков плаценты, выполняющих многочисленные функции, в том числе связанные с пластическими, иммунологическими процессами, обеспечением апоптоза. Эта фракция включает также специфические белки беременности. Многообразие функций цитоплазматических белков подтверждает возможность развития существенных молекулярно-клеточных отклонений при преэклампсии в результате их структурного повреждения.

Деструкция мембранных белков плаценты в результате активации пептидгидролаз не может не повлиять на состояние физико-химических свойств плазматических и других мембран плаценты и, следовательно, на основные функции этих клеточных структур: транспорт, рецепцию, каналообразование, пространственное разобщение (компартментализацию). Кроме того, повреждение лизосомальных мембран способствует дополнительному выходу кислых пептидгидролаз в цитоплазму и усилению их повреждающего действия на цитоплазматические белки.

Наиболее негативное влияние на обменные процессы в плаценте при преэклампсии может оказывать повышение активности пептидгидролаз в ядерных белках: гистонах и негистоновых белках хроматина, участвующих в формировании его структуры и регуляции экспрессии генов, а также являющихся модуляторами биологической активности ДНК. Последнее, как следствие, нарушает пролиферативные процессы, высокая активность которых характерна для плацентарной ткани [8, 9].

К числу важных причин повышения деструкции белков относятся их предварительные физико-химические изменения, в том числе окислительная модификация, сопровождающаяся повышением чувствительности белков к действию пептидгидролаз. При преэклампсии, формирующейся на фоне внутриутробной гипоксии, накопления активных форм кислорода и, в конечном итоге, развития окислительного стресса [10—12], свободнорадикальное повреждение основных клеточных компонентов, включая белки, является весьма вероятным. Как показали наши исследования, при беременности, осложненной преэклампсией, происходит усиление обоих вариантов окислительной модификации белков, в плаценте и сыворотке крови (табл. 3). Содержание карбонильных производных, образующихся при спонтанном и металлкатализируемом окислении белков, повышается в плаценте при осложненной беременности на 29 и 35,4% соответственно. Для сыворотки крови повышение составляет 36,1 и 38,5%.

Выявленное усиление окислительной модификации белков сопровождается нарушением различных уровней их структуры. Под действием свободных радикалов возможно разрушение не только боковых цепей аминокислотных остатков, но и окисление более глубоких участков белковой молекулы и, как следствие, повреждение ее функциональной нагрузки [13]. Особенно негативным представляется то, что поврежденный окисленный белок будет продолжать участвовать в межклеточной коммуникации, передаче сигнализации и получении информации из внешней среды в искаженном виде, нарушая тем самым многочисленные регуляторные процессы. Посттрансляционная окислительная модификация белков, очевидно, отражается на протеомном спектре плаценты, дисбаланс которого при преэклампсии установлен нами ранее [14].

Между степенью окислительной модификации белков и интенсивностью протеолитических процессов в плаценте и сыворотке крови при преэклампсии обнаружена положительная корреляция (r=0,72 и r=0,81; p<0,05), свидетельствующая о наличии взаимосвязи и взаимозависимости данных реакций, что позволяет оценивать модификацию белковых молекул как важный фактор их деструктивных нарушений.

Таким образом, можно заключить, что при беременности, осложненной преэклампсией, имеются значительные структурные повреждения белковых молекул, которые, изменяя гомеостаз в системе мать—плацента—плод, несомненно, существенно влияют на вклад в развитие этой акушерской патологии, раскрывают на клеточном уровне особенности патогенеза преэклампсии.

1. Беременность, осложненная преэклампсией, развивается на фоне достоверного повышения в сыворотке крови, околоплодных водах и плаценте активности кислых и нейтральных пептидгидролаз, вызывающих деструктивные повреждения белков.

2. Различные субклеточные фракции плаценты (ядра, митохондрии, мембраны, цитоплазма) характеризуются разной степенью изменения интенсивности протеолитических процессов. Максимальная активность ферментов при преэклампсии имеется в митохондриях — для кислых пептидгидролаз и цитоплазме — для нейтральных пептидгидролаз.

3. При преэклампсии усиливается посттрансляционная окислительная модификация белков плаценты и сыворотки крови, проявляющаяся повышением содержания окисленных аминокислотных остатков белков (карбонильных производных) и увеличением чувствительности к протеолитическим процессам.