Введение
Известно, что ноттингемский прогностический индекс (NPI) учитывает основные клинические характеристики опухоли — размер, степень дифференцировки клеток и наличие или отсутствие метастазов в лимфатических узлах [1, 2], но в то же время NPI не учитывает молекулярную структуру рака молочной железы (РМЖ), от которой также зависит лечение пациентов [3]. Известно, что содержащиеся в опухолевой интерстициальной жидкости цитокины, влияющие на ангиогенез, рост и метастазирование [4], подвержены динамическим изменениям, и их концентрации могут варьировать в зависимости от клинических и молекулярных параметров опухоли [5].
Несмотря на то что исследование опухолевой интерстициальной жидкости является инвазивным в отличие от определения уровня цитокинов в периферической крови, такое исследование более точно отражает локальные процессы как в самой опухоли, так и в опухолевом микроокружении и предоставляет более специфичную информацию о взаимодействии опухоли с иммунной системой, включая клеточные взаимодействия и сигнальные пути вблизи опухолевых клеток [6, 7]. Кроме того, концентрации цитокинов в опухолевой интерстициальной жидкости выше, чем в периферической крови, что облегчает их детекцию и анализ.
Цель исследования — оценить продукцию цитокинов РМЖ в зависимости от NPI и молекулярных подтипов опухоли.
Материалы и методы
Исследование проводилось на биоптатах молочной железы 95 женщин, больных РМЖ, средний возраст 57 лет (23—77 лет), находившихся на лечении в маммологическом отделении ГБУЗ НСО «Городская клиническая больница №1» (г. Новосибирск). Подробная характеристика пациенток представлена в табл. 1.
Таблица 1. Клинико-морфологическая характеристика опухолей у больных раком молочной железы
| Показатель | Абсолютное значение, n | Относительное значение, % |
| Размер опухоли (T): | ||
| T1: <2 см | 39 | 41,1 |
| T2: 2—5 см | 55 | 57,9 |
| T3: >5 см | 1 | 1,0 |
| Вовлеченность лимфатических узлов (N): | ||
| N0 | 60 | 63,2 |
| N1 | 26 | 27,4 |
| N2 | 6 | 6,2 |
| N3 | 3 | 3,2 |
| Степень дифференцировки опухоли (G): | ||
| G 1 | 5 | 5,3 |
| G 2 | 89 | 93,7 |
| G 3 | 1 | 1,0 |
| Эстрогеновые рецепторы (ER): | ||
| ER+ | 68 | 71,6 |
| ER– | 27 | 28,4 |
| Прогестероновые рецепторы (PR): | ||
| PR+ | 61 | 64,2 |
| PR– | 34 | 35,5 |
| Рецептор эпидермального фактора роста 2 (HER2): | ||
| HER2+ | 13 | 13,7 |
| HER2– | 82 | 86,3 |
| Уровень Ki-67: | ||
| <20 | 38 | 40,0 |
| ≥20 | 57 | 60,0 |
Критерии включения: инвазивная протоковая карцинома неспецифицированная (согласно международной гистологической классификации), отсутствие острых и обострения хронических инфекционно-воспалительных заболеваний, отсутствие неоадъювантной терапии до взятия материала на исследование и онкологических заболеваний другой локализации, а также очагов отдаленного метастазирования.
Все исследования проводили до лечения и в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации. Все пациентки прочитали и подписали информированное добровольное согласие на проведение исследований, одобренное этическим комитетом научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики ФГБНУ «ФИЦ ФТМ» (протокол №28 от 27.09.2023).
Биоптаты молочной железы 8 мм3 инкубировали в 1 мл среды DMEM-F12 в течение 72 ч при температуре 37 ºC. После инкубации проводили центрифугирование в течение 15 мин при 900 g. В отобранной надосадочной жидкости (супернатантах) определяли концентрации IL-1β, IL-1Ra, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, VEGF, используя наборы для иммуноферментного анализа российского производства. Для проведения иммуноферментного анализа использовали спектрофотометр Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific Oy, Финляндия); микропланшетный промыватель, работающий в автоматическом режиме, Wellwash 4 Mk 2 (Thermo Fisher Scientific Oy, Финляндия); термошейкер PST-60 HL plus (SIA Biosan, Латвия).
Статистический анализ. Результаты исследования обработаны в SPSS 22. Использованы критерии Краскела—Уоллиса при сравнении нескольких групп и Манна—Уитни при попарном сравнении групп. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Коэффициент корреляции Спирмена (r) использовали для определения взаимосвязей между показателями при построении матрицы корреляций. Значения коэффициента корреляции Спирмена (r) меньше 0,400 считали признаком слабой тесноты связи; значение 0,400 или более, но менее 0,699 — признаком умеренной тесноты связи, а значение 0,700 и более — признаком высокой тесноты связи. Данные представлены в таблицах в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q1—Q3).
Результаты и обсуждение
Для всех пациенток рассчитывали NPI по следующей формуле:
NPI=[0,2·S]+N+G,
где S — размер очага поражения (см); N — состояние лимфатических узлов, отсутствие поражения лимфатических узлов соответствует 1 баллу, поражение от 1 до 3 узлов — 2 баллам, а поражение 4 узлов и более — 3 баллам; G — степень дифференцировки опухоли: I степень — 1 балл, II степень — 2 балла, III степень — 3 балла.
Согласно величине NPI в баллах все пациентки распределены на 4 прогностические группы [1, 2], что представлено в табл. 2. Проведено также разделение пациенток на прогностические группы в зависимости от молекулярного подтипа опухоли (табл. 3).
Таблица 2. Распределение больных раком молочной железы в зависимости от NPI
| Прогностическая группа | NPI, баллов | Прогноз | Абсолютное значение, n | Относительное значение, % |
| NPI I | <2,40 | отличный | 4 | 4,2 |
| NPI II | 2,40—3,40 | хороший | 25 | 26,3 |
| NPI III | 3,41—5,40 | умеренный | 57 | 60,0 |
| NPI IV | >5,40 | плохой | 9 | 9,5 |
Таблица 3. Распределение больных раком молочной железы в зависимости от молекулярных подтипов
| Молекулярный подтип | ER | PR | HER2 | Ki-67, % | Прогноз | Абсолютное значение, n | Относительное значение, % |
| Люминальный A | + | +/– | – | <20 | отличный | 38 | 40,0 |
| Люминальный B | + | +/– | +/– | ≥20 | хороший | 29 | 30,5 |
| HER2-положительный | – | – | + | любое | умеренный | 9 | 9,5 |
| Тройной негативный | – | – | – | любое | плохой | 19 | 20,0 |
Наше исследование выявило значительные различия в прогнозах у пациенток, классифицированных согласно NPI и молекулярным подтипам. Большинство пациенток (n=57) по NPI имели умеренный прогноз (60%), в то время как анализ молекулярных маркеров показал, что у 38 пациенток выявлен подтип люминальный A, соответствующий отличному прогнозу (40%), что сопоставимо с данными других исследователей [8]. В нашем исследовании не обнаружены корреляционные связи между NPI и экспрессией рецепторов гормонов (рисунок на цв. вклейке), что может указывать на сохранение положительной экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона у пациенток, несмотря на больший размер опухоли и вовлеченность лимфатических узлов.
Матрица корреляций клинико-морфологических параметров опухоли с концентрацией цитокинов в супернатанте биоптатов больных раком молочной железы.
Размер круга отражает силу корреляционной связи; X — отсутствие статистически значимой корреляционной связи; LVI — лимфоваскулярная инвазия; Size — размер опухоли; G — степень дифференцировки опухоли; ER — уровень экспрессии рецептора эстрогена; PR — уровень экспрессии рецептора прогестерона; Her — уровень экспрессии 2-го рецептора эпидермального фактора роста человека; Ki-67 — уровень экспрессии Ki-67; NPI — ноттингемский прогностический индекс.
В ходе анализа прогностических групп NPI определены уникальные особенности цитокинового профиля супернатантов биоптатов, характерные для каждой из групп (табл. 4). Отмечено повышение концентраций IL-8, IL-18, IL-1β и GM-CSF у пациенток с высоким NPI по сравнению с пациентками с низким NPI. Это, вероятно, связано с тем, что указанные цитокины посредством онкогенных сигнальных путей способствуют пролиферации злокачественных клеток и их миграции в лимфатические сосуды [9—11].
Таблица 4. Концентрация цитокинов в супернатанте биоптатов у больных раком молочной железы в зависимости от NPI
| Цитокин | NPI I | NPI II | NPI III | NPI IV | p | p* |
| IL-8, пг/мл | 283,8 (79,0—637,0) | 314,0 (157,9—451,6) | 325,5 (238,2—511,0) | 477,4 (389,6—665,0) | p2—4=0,008 p3—4=0,036 | 0,040 |
| IL-18, пг/мл | 15,0 (4,6—20,1) | 29,0 (9,6—62,2) | 103,2 (28,0—477,1) | 155,0 (56,3—227,9) | p1—3=0,015 p1—4=0,005 p2—3=0,005 p2—4=0,002 | 0,001 |
| IL-1β, пг/мл | 19,4 (3,8—40,4) | 15,5 (9,6—31,2) | 45,3 (16,7—89,5) | 40,2 (26,1—86,0) | p2—3=0,002 p2—4=0,030 | 0,008 |
| IFN-γ, пг/мл | 43,4 (16,6—58,1) | 5,2 (3,5—10,9) | 8,3 (3,3—15,1) | 6,6 (3,5—23,7) | p1—2=0,007 p1—3=0,029 | 0,077 |
| GM-CSF, пг/мл | 3,2 (2,0—4,9) | 14,5 (4,2—50,2) | 10,9 (3,7—29,1) | 10,5 (5,4—18,3) | p1—2=0,031 p1—3=0,033 | 0,134 |
Примечание. Здесь и в табл. 5: данные представлены в виде Me (Q1—Q3); указаны цитокины, в концентрациях которых имелись статистически значимые различия; p — критерий Манна—Уитни; p* — критерий Краскела—Уоллиса.
Определены особенности цитокинового профиля супернатантов биоптатов, характерные для четырех молекулярных подтипов (табл. 5), отмечено значительное повышение продукции целого ряда цитокинов у пациенток с тройным негативным подтипом.
Таблица 5. Концентрация цитокинов в супернатанте биоптатов у больных раком молочной железы в зависимости от молекулярного подтипа опухоли
| Цитокин | Люминальные подтипы | Нелюминальные подтипы | p | p* | ||
| A | B | HER2+ | ТН | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| IL-8 | 287,2 (176,9—399,8) | 325,5 (258,7—469,3) | 541,5 (229,9—717,6) | 441,7 (318,7—740,2) | p1—4=0,001 p2—4=0,041 | 0,005 |
| IL-18 | 29,1 (8,4—74,5) | 74,5 (30,8—245,6) | 55,2 (29,9—255,7) | 188,3 (90,2—1165,2) | p1—2=0,002 p1—4=0,0006 p2—4=0,022 | 0,001 |
| IL-1β | 17,5 (10,7—31,8) | 40,2 (16,2—75,4) | 42,0 (12,0—140,6) | 87,0 (22,7—208,5) | p1—2=0,029 p1—4=0,0002 | 0,002 |
| TNF-α | 2,4 (1,3—4,3) | 5,2 (2,0—7,6) | 2,8 (1,6—6,6) | 4,2 (2,5—8,0) | p1—2=0,003 p1—4=0,028 | 0,006 |
| IFN-γ | 5,0 (3,2—12,6) | 5,2 (2,9—10,8) | 7,4 (5,1—12,3) | 13,6 (8,1—41,1) | p1—4=0,020 p2—4=0,004 | 0,036 |
| G-CSF | 79,8 (7,9—634,6) | 614,5 (109,1—664,6) | 149,9 (20,4—362,2) | 273,8 (22,8—641,1) | p1—2=0,037 p2—3=0,027 | 0,096 |
| GM-CSF | 5,0 (2,0—14,8) | 14,5 (7,7—31,3) | 8,7 (3,0—15,8) | 36,1 (14,0—55,8) | p1—2=0,006 p1—4=0,0002 p2—4=0,031 p3—4=0,004 | 0,001 |
| VEGF | 1227,5 (214,3—2127,3) | 1635,1 (513,7—2170,1) | 1903,2 (262,7—2491,3) | 2190,0 (1902,6—2596,9) | p1—4=0,001 p2—4=0,016 | 0,015 |
Примечание. 1 — Люминальный A; 2 — Люминальный B; 3 — HER2-положительный ; 4 — Тройной негативный.
W. Marini и соавт. показали, что активация сигнального пути Notch является отличительным признаком тройного негативного подтипа [12]. Активация Notch, в свою очередь, приводит к увеличению секреции IL-1β, IL-8, CCL2 и мобилизации опухоль-ассоциированных макрофагов и фибробластов [13], что в совокупности способствует высвобождению воспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IL-1, IL-6, IL-18, и факторов роста G-CSF, GM-CSF и VEGF, тем самым способствуя распространению РМЖ [12, 14].
Примечательно, что высокая продукция IFN-γ одновременно обнаруживалась как у пациенток с низким NPI, так и у пациенток с тройным негативным типом. Это может быть обусловлено тем, что Notch увеличивает экспрессию IFN-γ, и это способствует привлечению противоопухолевых CD8+ T-клеток [14, 15]. Такое явление может быть выражено особенно сильно у пациенток с низким NPI в силу того, что IFN-γ активирует сигнальные пути, приводящие к ингибированию роста опухоли [4].
Анализ взаимосвязей цитокинового профиля биоптата больных РМЖ и клинических параметров опухоли показал наличие умеренных положительных корреляций (r>0,400, p≤0,002) между цитокинами, размером опухоли, уровнем Ki-67 и NPI (табл. 6).
Таблица 6. Коэффициенты корреляции концентраций цитокинов в супернатанте биоптатов с размером опухоли, уровнем Ki-67 и NPI
| Показатель | r | p |
| Размер опухоли: | ||
| IL-18 | 0,409 | 0,00008 |
| Уровень Ki-67: | ||
| IL-18 | 0,487 | 0,00001 |
| TNF-α | 0,403 | 0,00009 |
| GM-CSF | 0,454 | 0,00001 |
| VEGF | 0,401 | 0,002 |
| NPI: | ||
| IL-18 | 0,402 | 0,0003 |
Другие статистически значимые корреляционные взаимосвязи показателей цитокинового профиля и клинико-морфологических параметров опухоли (r<0,400) представлены на рисунке на цв. вклейке. Наиболее сильная корреляция получена между концентрацией IL-18, размером, степенью дифференцировки, уровнем экспрессии Ki-67 и NPI, а также между IL-18 и экспрессией рецепторов эстрогена и прогестерона (см. табл. 6, см. рисунок на цв. вклейке).
В силу динамического характера секреции цитокинов они могут более точно отражать изменения в опухоли и выступать связующим звеном между клиническими и молекулярными параметрами опухоли. Это особенно относится к IL-18, который связан как с клиническими (размер опухоли, степень дифференцировки, уровень Ki-67 и NPI), так и с молекулярными (экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона) параметрами опухоли, что сопровождалось повышением его концентраций у пациенток с неблагоприятным прогнозом по NPI и с тройным негативным подтипом.
В нашем исследовании мы не оценивали выживаемость пациенток, так как исследование ограничено во времени. Тем не менее мы полагаем, что надо продолжить исследование для долгосрочного мониторинга и определения прогностической значимости концентраций цитокинов, NPI и молекулярных маркеров, измеренных в нашем исследовании.
Помимо определения уровня цитокинов в опухолевой интерстициальной жидкости в настоящее время активно обсуждается возможность оценки уровней цитокинов в сыворотке крови, поскольку и определение реализуется с помощью простого анализа крови, что минимизирует дискомфорт и риск для пациентов по сравнению с инвазивными методами [16, 17]. Однако отмечен ряд нюансов, затрудняющих интерпретацию данных, полученных при определении цитокинов в сыворотке крови. В первую очередь, в крови концентрации цитокинов могут быть разведены и перемешаны с цитокинами и из других источников, что может не отражать тонкие изменения в цитокиновом профиле, которые происходят непосредственно в опухоли и ее микроокружении. Анализ опухолевой интерстициальной жидкости позволяет исследовать взаимодействие между опухолевыми клетками и стромальными клетками, что важно для понимания механизмов опухолевого роста и метастазирования [6, 7].
Заключение
Выявленные значительные различия в прогнозах у пациенток в зависимости от NPI и молекулярных подтипов указывают на необходимость индивидуализированного подхода к лечению больных раком молочной железы с учетом не только морфологических, но и молекулярных особенностей опухоли. Дополнительно результаты исследования указывают на потенциальное значение цитокинового профиля в прогнозировании и индивидуализации лечения рака молочной железы, поскольку динамические изменения концентраций цитокинов могут отражать состояние опухоли и предсказывать ее поведение в ответ на терапию. Дальнейшие исследования могут способствовать разработке более точных и эффективных стратегий лечения этого заболевания.
Вклад авторов: концепция и дизайн исследования — Студеникина А.А., Аутеншлюс А.И.; сбор и обработка материала — Студеникина А.А., Проскура А.В.; статистический анализ данных — Студеникина А.А.; написание текста — Студеникина А.А.; научное редактирование — Аутеншлюс А.И.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Authors contribution: study design and concept — Studenikina A.A., Autenshlyus A.I.; data collection and processing — Studenikina A.A., Proskura A.V.; statistical analysis — Studenikina A.A.; text writing — Studenikina A.A.; scientific editing — Autenshlyus A.I.