Взаимосвязь ноттингемского прогностического индекса и молекулярных подтипов опухоли с продукцией цитокинов при раке молочной железы

Известно, что ноттингемский прогностический индекс (NPI) учитывает основные клинические характеристики опухоли — размер, степень дифференцировки клеток и наличие или отсутствие метастазов в лимфатических узлах [1, 2], но в то же время NPI не учитывает молекулярную структуру рака молочной железы (РМЖ), от которой также зависит лечение пациентов [3]. Известно, что содержащиеся в опухолевой интерстициальной жидкости цитокины, влияющие на ангиогенез, рост и метастазирование [4], подвержены динамическим изменениям, и их концентрации могут варьировать в зависимости от клинических и молекулярных параметров опухоли [5].

Несмотря на то что исследование опухолевой интерстициальной жидкости является инвазивным в отличие от определения уровня цитокинов в периферической крови, такое исследование более точно отражает локальные процессы как в самой опухоли, так и в опухолевом микроокружении и предоставляет более специфичную информацию о взаимодействии опухоли с иммунной системой, включая клеточные взаимодействия и сигнальные пути вблизи опухолевых клеток [6, 7]. Кроме того, концентрации цитокинов в опухолевой интерстициальной жидкости выше, чем в периферической крови, что облегчает их детекцию и анализ.

Цель исследования — оценить продукцию цитокинов РМЖ в зависимости от NPI и молекулярных подтипов опухоли.

Исследование проводилось на биоптатах молочной железы 95 женщин, больных РМЖ, средний возраст 57 лет (23—77 лет), находившихся на лечении в маммологическом отделении ГБУЗ НСО «Городская клиническая больница №1» (г. Новосибирск). Подробная характеристика пациенток представлена в табл. 1.

Таблица 1. Клинико-морфологическая характеристика опухолей у больных раком молочной железы

Критерии включения: инвазивная протоковая карцинома неспецифицированная (согласно международной гистологической классификации), отсутствие острых и обострения хронических инфекционно-воспалительных заболеваний, отсутствие неоадъювантной терапии до взятия материала на исследование и онкологических заболеваний другой локализации, а также очагов отдаленного метастазирования.

Все исследования проводили до лечения и в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации. Все пациентки прочитали и подписали информированное добровольное согласие на проведение исследований, одобренное этическим комитетом научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики ФГБНУ «ФИЦ ФТМ» (протокол №28 от 27.09.2023).

Биоптаты молочной железы 8 мм³ инкубировали в 1 мл среды DMEM-F12 в течение 72 ч при температуре 37 ºC. После инкубации проводили центрифугирование в течение 15 мин при 900 g. В отобранной надосадочной жидкости (супернатантах) определяли концентрации IL-1β, IL-1Ra, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, VEGF, используя наборы для иммуноферментного анализа российского производства. Для проведения иммуноферментного анализа использовали спектрофотометр Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific Oy, Финляндия); микропланшетный промыватель, работающий в автоматическом режиме, Wellwash 4 Mk 2 (Thermo Fisher Scientific Oy, Финляндия); термошейкер PST-60 HL plus (SIA Biosan, Латвия).

Статистический анализ. Результаты исследования обработаны в SPSS 22. Использованы критерии Краскела—Уоллиса при сравнении нескольких групп и Манна—Уитни при попарном сравнении групп. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Коэффициент корреляции Спирмена (r) использовали для определения взаимосвязей между показателями при построении матрицы корреляций. Значения коэффициента корреляции Спирмена (r) меньше 0,400 считали признаком слабой тесноты связи; значение 0,400 или более, но менее 0,699 — признаком умеренной тесноты связи, а значение 0,700 и более — признаком высокой тесноты связи. Данные представлены в таблицах в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q₁—Q₃).

Для всех пациенток рассчитывали NPI по следующей формуле:

NPI=[0,2·S]+N+G,

где S — размер очага поражения (см); N — состояние лимфатических узлов, отсутствие поражения лимфатических узлов соответствует 1 баллу, поражение от 1 до 3 узлов — 2 баллам, а поражение 4 узлов и более — 3 баллам; G — степень дифференцировки опухоли: I степень — 1 балл, II степень — 2 балла, III степень — 3 балла.

Согласно величине NPI в баллах все пациентки распределены на 4 прогностические группы [1, 2], что представлено в табл. 2. Проведено также разделение пациенток на прогностические группы в зависимости от молекулярного подтипа опухоли (табл. 3).

Таблица 2. Распределение больных раком молочной железы в зависимости от NPI

Таблица 3. Распределение больных раком молочной железы в зависимости от молекулярных подтипов

Наше исследование выявило значительные различия в прогнозах у пациенток, классифицированных согласно NPI и молекулярным подтипам. Большинство пациенток (n=57) по NPI имели умеренный прогноз (60%), в то время как анализ молекулярных маркеров показал, что у 38 пациенток выявлен подтип люминальный A, соответствующий отличному прогнозу (40%), что сопоставимо с данными других исследователей [8]. В нашем исследовании не обнаружены корреляционные связи между NPI и экспрессией рецепторов гормонов (рисунок на цв. вклейке), что может указывать на сохранение положительной экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона у пациенток, несмотря на больший размер опухоли и вовлеченность лимфатических узлов.

Матрица корреляций клинико-морфологических параметров опухоли с концентрацией цитокинов в супернатанте биоптатов больных раком молочной железы.

Размер круга отражает силу корреляционной связи; X — отсутствие статистически значимой корреляционной связи; LVI — лимфоваскулярная инвазия; Size — размер опухоли; G — степень дифференцировки опухоли; ER — уровень экспрессии рецептора эстрогена; PR — уровень экспрессии рецептора прогестерона; Her — уровень экспрессии 2-го рецептора эпидермального фактора роста человека; Ki-67 — уровень экспрессии Ki-67; NPI — ноттингемский прогностический индекс.

В ходе анализа прогностических групп NPI определены уникальные особенности цитокинового профиля супернатантов биоптатов, характерные для каждой из групп (табл. 4). Отмечено повышение концентраций IL-8, IL-18, IL-1β и GM-CSF у пациенток с высоким NPI по сравнению с пациентками с низким NPI. Это, вероятно, связано с тем, что указанные цитокины посредством онкогенных сигнальных путей способствуют пролиферации злокачественных клеток и их миграции в лимфатические сосуды [9—11].

Таблица 4. Концентрация цитокинов в супернатанте биоптатов у больных раком молочной железы в зависимости от NPI

Примечание. Здесь и в табл. 5: данные представлены в виде Me (Q₁—Q₃); указаны цитокины, в концентрациях которых имелись статистически значимые различия; p — критерий Манна—Уитни; p* — критерий Краскела—Уоллиса.

Определены особенности цитокинового профиля супернатантов биоптатов, характерные для четырех молекулярных подтипов (табл. 5), отмечено значительное повышение продукции целого ряда цитокинов у пациенток с тройным негативным подтипом.

Таблица 5. Концентрация цитокинов в супернатанте биоптатов у больных раком молочной железы в зависимости от молекулярного подтипа опухоли

Примечание. 1 — Люминальный A; 2 — Люминальный B; 3 — HER2-положительный ; 4 — Тройной негативный.

W. Marini и соавт. показали, что активация сигнального пути Notch является отличительным признаком тройного негативного подтипа [12]. Активация Notch, в свою очередь, приводит к увеличению секреции IL-1β, IL-8, CCL2 и мобилизации опухоль-ассоциированных макрофагов и фибробластов [13], что в совокупности способствует высвобождению воспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IL-1, IL-6, IL-18, и факторов роста G-CSF, GM-CSF и VEGF, тем самым способствуя распространению РМЖ [12, 14].

Примечательно, что высокая продукция IFN-γ одновременно обнаруживалась как у пациенток с низким NPI, так и у пациенток с тройным негативным типом. Это может быть обусловлено тем, что Notch увеличивает экспрессию IFN-γ, и это способствует привлечению противоопухолевых CD8+ T-клеток [14, 15]. Такое явление может быть выражено особенно сильно у пациенток с низким NPI в силу того, что IFN-γ активирует сигнальные пути, приводящие к ингибированию роста опухоли [4].

Анализ взаимосвязей цитокинового профиля биоптата больных РМЖ и клинических параметров опухоли показал наличие умеренных положительных корреляций (r>0,400, p≤0,002) между цитокинами, размером опухоли, уровнем Ki-67 и NPI (табл. 6).

Таблица 6. Коэффициенты корреляции концентраций цитокинов в супернатанте биоптатов с размером опухоли, уровнем Ki-67 и NPI

Другие статистически значимые корреляционные взаимосвязи показателей цитокинового профиля и клинико-морфологических параметров опухоли (r<0,400) представлены на рисунке на цв. вклейке. Наиболее сильная корреляция получена между концентрацией IL-18, размером, степенью дифференцировки, уровнем экспрессии Ki-67 и NPI, а также между IL-18 и экспрессией рецепторов эстрогена и прогестерона (см. табл. 6, см. рисунок на цв. вклейке).

В силу динамического характера секреции цитокинов они могут более точно отражать изменения в опухоли и выступать связующим звеном между клиническими и молекулярными параметрами опухоли. Это особенно относится к IL-18, который связан как с клиническими (размер опухоли, степень дифференцировки, уровень Ki-67 и NPI), так и с молекулярными (экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона) параметрами опухоли, что сопровождалось повышением его концентраций у пациенток с неблагоприятным прогнозом по NPI и с тройным негативным подтипом.

В нашем исследовании мы не оценивали выживаемость пациенток, так как исследование ограничено во времени. Тем не менее мы полагаем, что надо продолжить исследование для долгосрочного мониторинга и определения прогностической значимости концентраций цитокинов, NPI и молекулярных маркеров, измеренных в нашем исследовании.

Помимо определения уровня цитокинов в опухолевой интерстициальной жидкости в настоящее время активно обсуждается возможность оценки уровней цитокинов в сыворотке крови, поскольку и определение реализуется с помощью простого анализа крови, что минимизирует дискомфорт и риск для пациентов по сравнению с инвазивными методами [16, 17]. Однако отмечен ряд нюансов, затрудняющих интерпретацию данных, полученных при определении цитокинов в сыворотке крови. В первую очередь, в крови концентрации цитокинов могут быть разведены и перемешаны с цитокинами и из других источников, что может не отражать тонкие изменения в цитокиновом профиле, которые происходят непосредственно в опухоли и ее микроокружении. Анализ опухолевой интерстициальной жидкости позволяет исследовать взаимодействие между опухолевыми клетками и стромальными клетками, что важно для понимания механизмов опухолевого роста и метастазирования [6, 7].

Выявленные значительные различия в прогнозах у пациенток в зависимости от NPI и молекулярных подтипов указывают на необходимость индивидуализированного подхода к лечению больных раком молочной железы с учетом не только морфологических, но и молекулярных особенностей опухоли. Дополнительно результаты исследования указывают на потенциальное значение цитокинового профиля в прогнозировании и индивидуализации лечения рака молочной железы, поскольку динамические изменения концентраций цитокинов могут отражать состояние опухоли и предсказывать ее поведение в ответ на терапию. Дальнейшие исследования могут способствовать разработке более точных и эффективных стратегий лечения этого заболевания.

Вклад авторов: концепция и дизайн исследования — Студеникина А.А., Аутеншлюс А.И.; сбор и обработка материала — Студеникина А.А., Проскура А.В.; статистический анализ данных — Студеникина А.А.; написание текста — Студеникина А.А.; научное редактирование — Аутеншлюс А.И.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors contribution: study design and concept — Studenikina A.A., Autenshlyus A.I.; data collection and processing — Studenikina A.A., Proskura A.V.; statistical analysis — Studenikina A.A.; text writing — Studenikina A.A.; scientific editing — Autenshlyus A.I.