Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным раком среди женщин: ежегодно во всем мире диагностируется 1,7 млн новых случаев [1]. По данным мировой статистики, от этого заболевания умирают более 500 тыс. женщин ежегодно [2]. Несмотря на немалый арсенал методов лечения, имеющихся в настоящее время, включающий хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химио- и гормонотерапию, а также таргетную терапию, прогноз больных РМЖ по-прежнему неудовлетворительный. При этом существует несколько причин, одна из которых гетерогенность опухоли, что придает ей разнообразную клиническую картину и вариабельность ответа на лекарственную терапию [3, 4]. В этом контексте широко изучаются стволовые, адгезионные, эпигенетические факторы, рецепторы роста и ангиогенеза и др. [5—7].

На основании изучения фенотипа клеток рака стало ясно, что им присуще аберрантно экспрессировать различные маркеры, которые играют существенную роль в жизнеобеспечении опухолевой клетки. Трансферриновые рецепторы 1, известные как кластер дифференцировки 71 (CD71), являются основным белком, который обеспечивает транспорт железа через клеточную мембрану [8]. CD71 представляет собой трансмембранный гликопротеин, который после связывания железа с трансферрином, сывороточным белком-переносчиком железа, эндоцитозируется из клеточной мембраны. Железо незаменимо для многих биологических внутриклеточных процессов, включая митохондриальные и иммунные реакции, эритропоэз, синтез ДНК [9, 10]. Злокачественным клеткам ввиду высокой пролиферативной активности требуется повышенная концентрация железа для обеспечения их активного деления и роста [10, 11]. Установлено, что при различных видах злокачественных опухолей (рак почки, легких, печени, холангиокарцинома и др.) экспрессия трансферриновых рецепторов повышена, и это имеет важное клиническое значение [12—15]. Вместе с тем некоторые работы [16] сообщают о наличии клеток рака, слабо экспрессирующих рецепторы трансферрина, но при этом обладающих потенциалом к инвазии и миграции. Утверждается, что трансферриновые рецепторы вовлечены в процессы пролиферации, миграции, инвазии, апоптоза и метастазирования клеток рака [17]. Аберрантная экспрессия рецепторов трансферрина наблюдается также при РМЖ [18]. Показано, что гиперэкспрессия трансферринового рецептора клетками рака связана с ухудшением прогноза заболевания [12, 13].

β1-интегрины — это общая β-субъединица белкового семейства очень поздних антигенов (VLA), известная как кластер дифференцировки CD29. Интегрины принимают участие в регуляции биохимических и механических сигналов, что обеспечивает контроль фенотипа клеток организма. Аберрантная экспрессия β1-интегринов клетками рака установлена при многих видах злокачественных опухолей. Некоторые из них могут характеризоваться сниженной экспрессией CD29, а другие — высоким ее уровнем [19].

Есть данные [20, 21], что опухоли с выраженным уровнем экспрессии β1-интегринов демонстрируют лекарственную резистентность к различным видам лечения: химио- и таргетной терапии. О вкладе β1-интегринов в развитие злокачественного новообразования сообщается в ряде экспериментальных работ. Так, перестройка окружающей опухолевые клетки микросреды с увеличением жесткости фибриллярных коллагенов под действием лизилоксидазы, а также экспрессия β1-интегринов были ассоциированы с процессом злокачественной трансформации нормальной ткани молочной железы в инвазивный рак [22]. В работах [23] по комбинированной делеции β1-интегринов демонстрируется, что снижение экспрессии этих молекул приводило к уменьшению клеточной адгезии к фибронектину и диссеминации клеток рака за счет сокращения образования фокальных адгезионных комплексов. Также отмечалось уменьшение количества пролиферирующих клеток. Исследования демонстрируют потребность в β1-интегрине при процессе метастазирования РМЖ, указывая на наличие связи с прогнозом заболевания [19, 24].

Цель исследования — изучение экспрессии трансферринового рецептора 1 (CD71) клетками первичного РМЖ во взаимосвязи с фенотипом клеток опухоли, что является необходимым этапом для понимания клинического поведения опухоли и совершенствования стратегий лекарственного лечения.

Материал и методы

Материалом для исследования служила опухолевая ткань молочной железы, образцы которой получены от больных первичным РМЖ, диагноз которого устанавливался с учетом клинических, рентгенологических и морфологических результатов обследования. Изучение опухолевой ткани выполнено в лаборатории иммунологии гемопоэза ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. После гистологического исследования опухоли для фенотипирования отобрано 120 образцов. Ткань опухоли получена в ходе хирургического вмешательства, а также путем трепанобиопсии в случаях неоадъювантного лечения. Всем пациенткам предлагалось ознакомиться с информацией об исследовании и подписать информированное добровольное согласие. Исследование одобрено локальным Этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Средний возраст пациенток составил 54,5±0,9 года.

Опухоли были классифицированы согласно критериям TNM Международного противоракового союза (Union for International Cancer Control’s — UICC). В соответствии с классификацией TNM установлено следующее: T1 — 18,3%, n=22; T2 — 63,3%, n=76; T3 — 3,3%, n=4; T4 — 15,0%, n=18; N1 — 55,0%, n=66; N2 — 18,3%, n=22; N3 — 6,7%, n=8. В исследовании преобладали опухоли стадии T2N+. Опухоли были преимущественно умеренной дифференцировки (67,5%, n=81). Распространенность по клиническим стадиям представлена в табл. 1.

Таблица 1. Распределение больных в зависимости от стадии рака молочной железы

Гистологическое исследование показало, что в 71% (n=85) случаев опухоль была представлена инвазивной протоковой аденокарциномой. В 18% (n=22) образцов опухоль имела строение инвазивной дольковой аденокарциномы. Редкие виды наблюдались в 11% (n=13) случаев. По данным иммуногистохимического исследования установлена экспрессия эстрогеновых рецепторов в 47% (n=57) наблюдений, прогестероновых в 45%. Экспрессия трансферриновых рецепторов выявлена в 76,6% случаев (n=85). Экспрессия β1-интегринов определялась в 30 наблюдениях: наличие антигена установлено в 93% (28/30).

Определение экспрессии рецепторов трансферрина, β1-интегринов

Экспрессия трансферриновых рецепторов и β1-интегринов оценивалась среди KL-1-позитивных опухолей иммуногистохимическим методом (иммунофлюресцентное окрашивание). С этой целью приготовляли срезы опухоли на криостате, которые после фиксации (ацетон, 10 мин, температура 4°C) подвергали окрашиванию моноклональными антителами. Инкубация продолжалась 30 мин. После отмывания первых антител наносили ФИТЦ-меченные F(ab)2 — фрагменты антивидовых антител. По окончании инкубации препараты отмывали, консервировали 50% раствором глицерина. Учет реакции выполняли на люминесцентном микроскопе ZEISS (AXIOSKOP; Германия). Оценивали экспрессию рецепторных детерминант по методу G.J. Hammerling и соавт. полуколичественным методом. Антигенпозитивными клетками считались клетки с мембранным свечением разной степени интенсивности (от слабой до выраженной), а также клетки с цитоплазматическим свечением.

Выделяли три типа реакции:

— негативная — в срезе менее 10% антигенположительных клеток;

— мозаичная — антиген экспрессируется 10—80% опухолевых клеток в срезе;

— мономорфная — в срезе имеется более чем 80% антигенположительных опухолевых клеток.

Иммунная инфильтрация опухоли

Изучение инфильтрации опухоли иммунными клетками выполнено иммуногистохимическим методом (иммунофлюоресцентное окрашивание). Для этой цели на криосрезы опухоли наносили моноклональные антитела к лимфоцитарным антигенам, инкубировали, а затем докрашивали ФИТЦ-меченными F(ab)2 — фрагментами антивидовых IgG1. Выделяли слабый характер реакции, умеренный и выраженный:

— слабая реакция — единичные антигенположительные клетки в поле зрения;

— умеренная — отдельные группы антигенположительных клеток;

— выраженная — скопления (очаги) антигенположительных клеток, крупные группы и инфильтраты из этих клеток.

При отсутствии антигенположительных клеток считали реакцию негативной.

В табл. 2 представлены моноклональные антитела, использованные в работе.

Таблица 2. Панель антител для окрашивания криосрезов опухоли

Статистическую обработку данных выполняли с использованием пакета IBM-SPSS Statistics v.21. Осуществляли анализ корреляций по Пирсону или Спирмену, подсчет распределения частот по категориям с непрерывными и дискретными переменными (критерий Фишера и c² по Пирсону). Различия считали значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

По результатам оценки экспрессии рецепторов трансферрина CD71 отмечено, что большинство образцов характеризовалось положительной реакцией, составившей 76,6% (n=85) (рис. 1). Характер экспрессии CD71 был преимущественно мономорфный. В 63% опухолей CD71-положительными было более 80% опухолевых клеток в изучаемом препарате. Мозаично CD71-экспрессирующие опухоли наблюдались значительно реже, лишь в 14,4% (n=16) случаев.

Рис. 1. Экспрессия опухолевыми клетками молекул CD71.

Зеленый цвет — экспрессия CD71. Ииммунофлюоресцентное окрашивание, ×400.

Аберрантная экспрессия рецепторов трансферрина описана при различных видах рака, в том числе и при РМЖ [9, 10, 12, 15]. Наши результаты не противоречат данным литературы и совокупно с ними указывают на то, что клетки РМЖ характеризуются гиперэкспрессией CD71, преимущественно мономорфной.

Оценка экспрессии β1-интегринов CD29 клетками РМЖ установила, что большинство опухолей были антигенпозитивными. При этом отмечены и мономорфная, и мозаичная экспрессия CD29 в ткани опухоли. Мозаичная реакция CD29 наблюдалась в 38,7% случаев, а мономорфная — в 51,6% образцов.

Дальнейший анализ установил наличие связи анализируемых рецепторных детерминант со статусом экспрессии рецепторов эстрогена. Данные представлены в табл. 3.

Таблица 3. Взаимосвязь экспрессии CD71 с экспрессией рецепторов эстрогенов клетками рака молочной железы

Как можно видеть из табл. 3, экспрессия CD71 достоверно коррелировала с экспрессией опухолью рецепторов эстрогенов. ER-позитивные опухоли почти в 85% случаев характеризовались наличием трансферриновых рецепторов. При этом подавляющее большинство ER- позитивных образцов имело мономорфный тип экспрессии CD71. Реакции мозаичного типа наблюдались лишь в 7,8%. При анализе ER-негативных опухолей обращало внимание, что доля CD71-негативных реакций в них возрастала вдвое, а частота мономорфного типа реакции снижалась. Эти данные указывают, что опухоли с положительным рецепторным статусом обладают выраженной пролиферативной активностью ввиду гиперэкспрессии гликопротеина CD71, обеспечивающего транспорт клеточного железа. Последнее подтверждает высокую потребность в железе клеток РМЖ, особенно популяции гормонозависимых клеток. Это обстоятельство, учитывая, что рецепторы трансферрина вовлечены во многие процессы онкогенеза (пролиферация, миграция, инвазия и диссеминация опухолевых клеток), может указывать на более высокую вероятность прогрессирования злокачественной опухоли [17]. И действительно, имеются данные, что популяции CD71-позитивных клеток обладают более высокой способностью к метастазированию [17]. Дополнительно, по данным H.O. Habashy и соавт. [25], CD71-позитивная популяция клеток ассоциируется с выраженной пролиферативной активностью опухоли, характеризуется экспрессией рецепторов эпидермального фактора роста Her-2neu. Хорошо известно, что гиперэкспрессия этих рецепторов связана с усилением деления клеток, неоангиогенезом и снижением апоптоза. Авторы также отметили развитие устойчивости опухоли к гормонотерапии. Учитывая эти данные, можно предположить, что пул клеток РМЖ с гиперэкспрессией CD71 в пределах эстрогенпозитивной популяции, по-видимому, обладает выраженным метастатическим потенциалом и устойчивостью к гормонотерапии. Последнее обстоятельство позволяет акцентировать внимание на рецепторах трансферрина как потенциальном маркере более агрессивного подтипа РМЖ.

На следующем этапе анализа выявлена связь экспрессии молекул β1- интегринов CD29 с экспрессией клетками опухоли рецепторов эстрогенов. Данные представлены в табл. 4.

Таблица 4. Взаимосвязь экспрессии молекул β1-интегринов с экспрессией рецепторов эстрогенов клетками рака молочной железы

Как можно видеть из табл. 4, экспрессия CD29 достоверно коррелировала с более низкой частотой экспрессии опухолью рецепторов эстрогенов. ER-позитивные опухоли характеризовались наличием экспрессии CD29 почти в 73% случаев. При этом 45,5% ER-позитивных образцов имели мономорфный тип экспрессии CD29. Реакции мозаичного характера наблюдались лишь в 27,3% случаев. При анализе ER-негативных опухолей обращало внимание, что CD29-негативных реакций не наблюдалось вовсе, а частота мономорфного типа реакции достигала 55%. Эти данные указывают, что опухоли с положительным рецепторным статусом, а именно пул клеток с мономорфной экспрессией молекул β1-интегринов, обладают довольно выраженным метастатическим потенциалом. Функции β1-интегринов широко связаны с регуляцией клеточного деления и адгезии, дифференцировки и миграционным потенциалом клеток молочной железы. Так, например, делеция гена β1-субъединицы интегринов в базальных или люминальных клетках ставит под угрозу регенераторный потенциал эпителия железы. В инвазивных карциномах повышение экспрессии β1-интегринов сопровождается увеличением адгезивного потенциала клеток к фибронектину с формированием фокальных адгезионных комплексов, при этом увеличивается инвазивность, а кроме того, снижается способность клеток к апоптозу [24]. Эти обстоятельства вкупе с результатами нашего исследования демонстрируют следующее: несмотря на то, что гормонозависимые опухоли характеризуются в большей степени благоприятным течением, среди них можно вычленить фенотипически отличные виды, которые ввиду гиперэкспрессии β-интегринов будут иметь иное течение. Так, указывается, что опухоли с выраженным уровнем экспрессии β1-интегринов отличались лекарственной резистентностью [20, 21, 26]. Обращает внимание, что это касалось как химиотерапии, так и таргетной терапии [21, 26]. Принимая во внимание эти факты, по-видимому, следует полагать, что позитивные по ER опухоли, аберрантно экспрессирующие β1-интегрины CD29, могут рассматриваться как пул клеток, не только потенциально метастатически активный, но и устойчивый к лекарственному воздействию. Не менее важным этот аспект становится при рассмотрении гормононегативного РМЖ, поскольку опциями в лечении таких опухолей являются именно таргетная и химиотерапия.

Дальнейший анализ был посвящен оценке степени выраженности иммунной инфильтрации опухоли в зависимости от статуса экспрессии опухолевыми клетками трансферриновых рецепторов и молекул β1-интегринов. Установлено, что статус экспрессии CD71 клетками РМЖ достоверно связан преимущественно с T-клеточной инфильтрацией опухоли (табл. 5). Выраженный характер инфильтрации CD3+ преобладал в опухолях, экспрессирующих рецепторы трансферрина, тогда как при отсутствии таковых чаще наблюдалась умеренная инфильтрация клетками CD3+; p=0,016. В опухолях CD71-негативных умеренная инфильтрация отмечена в 30,8% случаев, а при позитивных — в 6,9%. Следует отметить, что имела место положительная корреляция экспрессии CD71 с инфильтрацией клетками CD8+; R=0,226, p=0,063, n=68. На рис. 2 представлен пример иммунной реакции CD3+ в опухоли.

Таблица 5. Взаимосвязь экспрессии CD71 с иммунной инфильтрацией опухоли

Рис. 2. Инфильтрация опухоли CD3+ клетками.

Зеленый цвет — экспрессия KL-1 клетками рака молочной железы, красный цвет — лимфоидная (CD3+) инфильтрация опухоли. Иммунофлюоресцентное окрашивание, × 400.

Установлена связь экспрессии молекул β1-интегринов с иммунной инфильтрацией РМЖ (табл. 6). При отсутствии экспрессии β1-интегринов на клетках РМЖ инфильтрации CD45+ практически не наблюдалось. Опухоли, экспрессирующие β1-интегрины, характеризовались умеренной и выраженной инфильтрацией. При CD29-мономорфном типе реакций частота инфильтрации CD45+ составила 31,3%, а при мозаичном — 67,1%. Это нашло отражение в характере T-клеточной инфильтрации, которая отмечена преимущественно при CD29-позитивных опухолях. При этом мономорфные по β1-интегринам опухоли характеризовались меньшей частотой выраженных реакций CD3+. Наши результаты не противоречат данным литературы [21], где сообщается, что при опухолях с CD29- мономорфным типом экспрессии чаще наблюдается слабый тип T-клеточной инфильтрации. Учитывая, что экспрессия β1-интегринов на опухолевых клетках сопровождается повышением их подвижности и миграционных свойств, можно полагать, что данная популяция клеток будет иметь преимущество в выживании [27]. Напомним, что немалая доля CD29-позитивных опухолей в нашем исследовании характеризуется положительным ER-статусом. В этом контексте интересными представляются данные F. Baltes и соавт. [28], которые сообщают, что β1-интегрины играли решающую роль в клеточных линиях РМЖ, формируя состояние устойчивости к цитостатическим препаратам, когда клетки связывались с компонентами экстрацеллюлярного матрикса. Предполагается, что активность связывания интегринов не только регулирует физическое встраивание клетки в экстрацеллюлярный матрикс, но также активирует специфические сигнальные пути. Внутриклеточная передача сигналов, инициируемая связыванием с экстрацеллюлярным матриксом, по всей вероятности, имеет основополагающее значение для лекарственной устойчивости, опосредованной клеточной адгезией. Принимая во внимание данные литературы и нашего исследования, нельзя исключить, что клетки РМЖ с мономорфной экспрессией β1-интегринов, экспрессирующие рецепторы эстрогенов и со слабой лимфоидной инфильтрацией, могут представлять собой особый клон опухолевых клеток, которые отличаются резистентным поведением к лекарственному воздействию и выраженным метастатическим потенциалом.

Таблица 6. Взаимосвязь экспрессии β1-интегринов с иммунной инфильтрацией опухоли

Заключение

По результатам исследования установлено, что экспрессия рецепторов трансферрина CD71 клетками рака молочной железы достоверно связана с экспрессией опухолью рецепторов эстрогенов. Гормонопозитивные опухоли в подавляющем большинстве случаев характеризовались наличием экспрессии трансферриновых рецепторов, при этом мономорфной. Отмечена высокая частота экспрессии β1-интегринов ER-позитивными клетками рака молочной железы.

Выраженный характер лимфоидной инфильтрации (CD3+) преобладал в опухолях, экспрессирующих рецепторы трансферрина. Мономорфная экспрессия β1-интегринов клетками рака молочной железы сопровождалась слабым типом лимфоидной инфильтрации.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.В. Поддубная, И.С. Стилиди

Сбор и обработка материала — Е.Н. Шолохова, С.В. Чулкова

Статистическая обработка — А.В. Егорова, И.А. Гладилина

Написание текста, перевод — С.В. Чулкова

Редактирование — И.В. Поддубная

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.