Введение
Рост и развитие основных структур головного мозга школьников подросткового возраста подвержены генетическим влияниям [1]. Гены кодируют функции белков, необходимых для реализации нервных процессов, и в том числе косвенно определяют различные траектории поведения [2]. Изучение связи генотипа с показателями функции мозга, развития поведенческой фенотипизации может дать основу для понимания психических процессов в критические моменты, когда формируются биологически опосредованные индивидуальные различия в сложном поведении школьников подросткового возраста [3]. Изучение влияния генетических полиморфизмов на функцию мозга, которое в научной литературе обозначено термином «генетика визуализации», уже дало значительное представление о воздействии генов на морфофункциональное развитие мозга [4, 5].
Особый научный интерес представляет собой полиморфизм гена COMT в 158 кодоне, характеризующийся заменой валина на метионин, с точки зрения неоднозначности преимуществ и недостатков такой замены [6]. Доказано, что у носителей генотипа val/val определяются более высокие интеллектуальные способности, в то время как у носителей генотипа met/met выше показатели функциональности прецентральной коры больших полушарий, определяющих уровень рабочей оперативной памяти и концентрации внимания [7]. Однако данные получены в результате применения сложных методов визуализации структур мозга и трудоемких психологических и клинических тестов, используемых в психиатрии, либо при обследовании пациентов с психическими расстройствами, а большая часть из них получена путем экспериментов на животных [8]. Особый научный и практический интерес представляет собой уточнение взаимосвязи полиморфизма гена и когнитивных и некогнитивных характеристик психического здоровья здоровых подростков, которые можно определить простыми скрининговыми методами в условиях образовательной организации. В этой связи становится актуальным исследование фенотипизации полиморфизма val158met гена COMT у здоровых школьников подросткового возраста, находящихся в критическом периоде активного роста и развития, а также во взаимосвязи с когнитивными и некогнитивными показателями психического здоровья, которые существенно могут определять уровень академической успеваемости.
Цель исследования — определить особенности ассоциированных с полиморфизмом val158met гена COMT когнитивных и некогнитивных показателей психического здоровья школьников подросткового возраста.
Материал и методы
Одномоментное исследование проведено с участием 198 подростков в возрасте 14—15 лет. Исследование выполнено с соблюдением этических принципов Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации в действующей редакции (Форталеза, 2013). Критерии включения в исследование: 1) постоянное проживание на территории Оренбургской области с момента рождения; 2) обучение в одной образовательной организации с момента поступления в нее и отсутствие переводов из класса в класс; 3) отсутствие социальных рисков, то есть должна быть социально благополучная семья, полная семья; 4) отсутствие психических заболеваний и неблагоприятного неврологического анамнеза. Критерии исключения: 1) наличие черепно-мозговых травм в анамнезе; 2) наличие в анамнезе острых заболеваний либо обострений хронических заболеваний в течение 2 недель, предшествующих обследованию.
Исследование полиморфизма генов COMT (rs 4680, Val158MET (C472A) COMT) у подростков проведено на базе бюро судебно-медицинской экспертизы ФГБОУ ВО «ОрГМУ» Минздрава России (лицензия ФС-56-01-000819 от 13.12.13). Для этого у подростков взяты образцы — соскобы буккального эпителия с внутренней стороны щеки с использованием стерильного зонда в пробирке без среды. Выделение геномной ДНК из буккального эпителия выполняли с использованием твердотельного термостата, настольной центрифуги с ротором для пробирок объемом 1,5 мл со скоростью вращения не менее 10 000 об/мин (×6700 g), микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл (2 пробирки для выделения ДНК из 1 образца); этанола 96% и натрий-фосфатного буфера для выделения ДНК из клеток млекопитающих. Предварительно концентрат промывочного раствора разбавляли в 5 раз этанолом 96%; добавляли буфер 600 мкл для растворения протеиназы в пробирку с лиофилизованной протеиназой и тщательно перемешивали с помощью центрифугирования при 10 000—13 000 об/мин (×6700—11000 g). Раствор протеиназы после приготовления хранили в морозильной камере при –20 °C. При наличии осадка в лизирующем растворе и промывочном растворе прогревали их в термостате до температуры не выше 50 °C до полного растворения осадка. Манипуляции по выделению ДНК выполняли при комнатной температуре. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК и дальнейшего исследования полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с последующим анализом размеров образующихся фрагментов (рестриктов). Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени (TaqMan) использовали амплификатор DTlite (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) для активизации и детекции флюоресценции, отражающей накопление ампликонов, на каждом цикле амплификации. В реакционную смесь добавляли ДНК-зонды, в состав которых входила флюоресцентная метка в 5’-положении и гаситель флюоресценции в 3’-положении, а также фосфатная группа в 3’-положении. В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходило присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезировала комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинала его расщеплять с помощью 5’-экзонуклеазной активности. Для получения корректных результатов дополнительно изучали полученные ампликоны с помощью построения «кривых плавления» (melting curves). Для этого после окончания ПЦР реакционную смесь нагревали и непрерывно измеряли флюоресценцию. Каждое резкое уменьшение флюоресценции на графике соответствовало числу полосок, получаемых при электрофорезе в полиакриламидном геле 7%, соответствующих числу разных типов ампликонов, и последующим автоматическим дифференциальным анализом кривой плавления.
После идентификации полиморфизмов гена 198 подростков распределены в три группы. Для формирования однородности групп определены следующие критерии отбора подростков: углубленная оценка социального статуса семьи, условий жизни подростков, психологического семейного климата; хорошая успеваемость в школе за последние 2 года; средний и высокий коммуникативный индекс в школьном коллективе среди сверстников. В итоге общее количество подростков, включенных в исследование, составило 106 человек. В 1-ю группу (val/val) включены носители полиморфизма val158val гена COMT (n=35); во 2-ю группу (val/met) — носители полиморфизма val158met гена COMT (n=38) и в 3-ю группу (met/met) — носители полиморфизма met158met гена COMT (n=33). В связи с тем, что первоначально из 198 подростков выявлено всего лишь 19 носителей полиморфизма met158met гена COMT, то есть сложилась количественная неравномерность данной группы для сравнения с другими группами, проведено дополнительное генетическое исследование для добора носителей в 3-ю группу с учетом указанных выше критериев включения и исключения.
В последние годы появилась тенденция изучения так называемых некогнитивных факторов академических достижений. Во многих случаях важным условием успешного обучения оказываются не только когнитивные способности и уровень интеллекта, но и личностные особенности, которые предопределяют их успешное использование [9]. Выбор оценки тревожности, эмоциональных переживаний, степени выраженности стресса в качестве «некогнитивных» показателей у школьников подросткового возраста обусловлен возможностью дать характеристику одного из важных компонентов «большой пятерки» пятифакторной модели личности — невротизма, отражающего эмоциональную стабильность индивида [10]. Этот собирательный критерий, согласно данным литературы, является сильной детерминантой индивидуальных различий в академических достижениях [11], что актуально для школьников подросткового возраста, когда имеется риск их снижения на фоне психофизиологических перестроек организма в этом возрастном периоде [12].
Уровень тревожности, негативных эмоциональных переживаний и познавательной активности у подростков исследуемых групп оценен анкетным методом с помощью опросника Ч.Д. Спилбергера в модификации А.Д. Андреевой (1988). Степень выраженности стресса также определена анкетным методом по методике «Шкала психологического стресса PSM-25» в адаптации Н.Е. Водопьяновой [13]. Вопросы, представленные в адаптированном опроснике, по формулировке, но не по сути содержания, переформатированы с учетом возраста респондентов. Выбор данного метода обусловлен тем фактом, что он лишен недостатков традиционных методов изучения стрессовых состояний у детей и подростков, которые направлены на выявление патологических процессов стресса. Использованная шкала позволяет измерить стресс как естественное состояние психической напряженности, а не патологический процесс. Кроме того, выбор данной методики обусловлен тем фактом, что результаты, полученные с помощью шкалы психологического стресса PSM-25, имеют сильную корреляционную связь со шкалой тревожности Спилбергера (r=0,73), которая в адаптации А.Д. Андреевой использована в настоящем исследовании для оценки уровня негативных эмоциональных переживаний и тревожности у подростков. Стрессоустойчивость у исследуемых подростков оценена по методике М.Ю. Рыбникова «Прогноз-2», которая в отличие от других методик позволяет оценить вероятность возникновения нервно-психических срывов, уточнить особенности поведения и состояния психической деятельности человека в различных ситуациях. Анкета В.Ю. Рыбникова «Прогноз-2» первоначально предназначена для определения уровня нервно-психической устойчивости у военнослужащих. Однако в настоящее время она активно используется и в исследованиях среди подростков и молодежи [14]. Кроме того, выбор этого опросника обусловлен возможностью оценить нервно-психическую неустойчивость как интегральную совокупность врожденных (биологически обусловленных) и приобретенных свойств личности, которые могут предопределять вероятность неоптимального типа реагирования на неблагоприятные воздействия профессиональной среды [15]. В нашем исследовании профессиональная среда — это образовательная среда школьников подросткового возраста, а также комплекс потенциальных стрессоров, действующих во внеучебное время. И то, и другое связаны со становлением межличностных взаимоотношений подростков, что особенно актуально для данного возраста. Это полностью соответствует смыслу, заложенному в термин «профессиональная среда» разработчиками методики, в котором подразумевается под профессиональной средой вся совокупность внешних условий, воздействующих на индивида в процессе его профессиональной деятельности, в том числе характер его взаимоотношений с окружающим микросоциумом [16, 17].
Оценка функционального состояния центральной нервной системы у подростков исследуемых групп проведена по показателям функционального уровня нервной системы (ФУС), устойчивости нервной реакции (УР), уровня функциональных возможностей сформированной функциональной системы (УФВ) и уровня работоспособности на аппаратно-программном комплексе «Способ диагностики работоспособности человека» по методике М.П. Мороз (2003) [18].
Статистические данные представлены в виде доли явления в общей совокупности изучаемых факторов (%), среднего значения (M), стандартного отклонения (σ) и средней ошибки (m). Количественные переменные анализировали с помощью t-критерия, качественные показатели — с помощью критерия χ2. Статистически значимыми считали данные при p≤0,05. Все полученные данные проанализированы с помощью прикладных программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2007.
Результаты
Генотипирование полиморфизма COMT val 158 met (1947 G/A; GenBank Z26491; dbSNP: rs4680) показало, что нормальная гомозигота val/val выявлена лишь у 30,9% обследованных учащихся; тогда как гетерозигота val/met — у 61,9% учащихся, патологическая гомозигота — met/met у 7,2% учащихся.
Установлено статистически значимое увеличение у носителей генотипа met/met по сравнению с гомозиготными носителями val/val уровня тревожности — 16,7±2,47 балла и 21,5±0,51 балла соответственно (p≤0,05); уровня стресса — 6,0±1,87 балла и 11,0±0,96 балла соответственно, p≤0,05. Установлена тенденция увеличения уровня негативных эмоциональных переживаний с 32,2±1,63 балла у гомозиготных носителей генотипа met/met до 33,9±1,25 балла при показателях у гомозиготных носителей генотипа val/val 23,0±3,01 балла, p≥0,05 (рис. 1). При этом балльная оценка стрессоустойчивости у носителей генотипа val/val была статистически значимо выше и составляла 19,8±1,15 балла, у носителей генотипа met/met — 15,0±1,09 балла (p≤0,05). Аналогичная картина выявлена и при сравнении гетерозиготных носителей генотипа val/met с гомозиготными носителями генотипа val/val.
Рис. 1. Некогнитивные показатели психического здоровья учащихся с учетом носительства генотипов полиморфизма val158met гена COMT.
В группе носителей генотипа val/val выявлено максимальное число учащихся с низким уровнем тревожности (50,0%), стресса (100,0%) и негативных эмоциональных переживаний (25,0%), тогда как в группе носителей генотипа met/met максимальное число учащихся выявлено с высоким уровнем тревожности (25,0%) и высоким уровнем стресса (70,0%) (табл. 1). Аналогичная картина обнаружена и при сравнении гетерозиготных носителей генотипа val/met с гомозиготоными носителями генотипа val/val.
Таблица 1. Распределение подростков по уровню некогнитивных показателей психического здоровья в зависимости от генотипа полиморфизма val158met гена COMT
| Показатель | Группы | ||
| 1-я группа (val/val) | 2-я группа (val/met) | 3-я группа (met/met) | |
| Тревожность, %: | |||
| низкий уровень | 50,0 | 45,0 | — |
| средний уровень | 50,0 | 50,0 | 75,0 |
| высокий уровень | — | 5,0 | 25,0 |
| Негативные эмоциональные переживания, %: | |||
| низкий уровень | 25,0 | 30,0 | 50,0 |
| средний уровень | 50,0 | 55,0 | 50,0 |
| высокий уровень | 25,0 | 15,0 | — |
| Стресс, %: | |||
| низкий уровень | 100,0 | 50,0 | 15,0 |
| средний уровень | — | 15,0 | 15,0 |
| высокий уровень | — | 35,0 | 70,0 |
| Стрессоустойчивость, %: | |||
| неудовлетворительный уровень | 20,0 | 30,0 | 25,0 |
| удовлетворительный уровень | 55,0 | 40,0 | 45,0 |
| высокий уровень | 25,0 | 30,0 | 30,0 |
У носителей генотипа met/met относительно данных носителей генотипа val/val установлено статистически значимое превышение ФУС на 21,9% (2,94±0,041 ед. по сравнению с 2,41±0,041 ед., p≤0,05); УР на 18,5% (1,92±0,424 ед. по сравнению с 1,62±0,322 ед., p≤0,05); УФВ на 28,3% (2,79±0,332 ед. по сравнению с 3,58±0,494 ед., p≤0,05) (табл. 2). Аналогичная картина выявлена и при сравнении гетерозиготных носителей генотипа val/met с гомозиготоными носителями генотипа val/val, но при этом различия были статистически незначимые. Совершенно иная картина выявлена при оценке познавательной активности учащихся носителей вариантов генотипов полиморфизма val158met гена COMT (рис. 2). Так, в учебной деятельности познавательная активность была статистически значимо выше на 23,7% у носителей генотипа, чем у носителей генотипа met/met и в среднем составила 19,0±0,95 балла и 14,5±0,88 балла соответственно (p≤0,05). В повседневной же деятельности познавательная активность вследствие ее высокой вариации в исследуемых группах статически значимо не различалась и в среднем составляла 9,7±2,9 балла у носителей генотипа val/val по сравнению с 11,0±3,4 балла (p≥0,05).
Таблица 2. Распределение подростков по уровню когнитивных показателей психического здоровья в зависимости от генотипа полиморфизма val158met гена COMT
| Показатель | Группы | ||
| 1-я группа (val/val) | 2-я группа (val/met) | 3-я группа (met/met) | |
| Среднее значение (M) | 323,3±8,90 | 316,0±6,65 | 227,5±6,67* |
| Стандартное отклонение (σ) | 69,0±4,52 | 67,2±4,10 | 57,0±4,04* |
| Медиана модального класса (Mo) | 0,288±0,0079 | 0,286±0,0058 | 0,180±0,0202* |
| Максимальная вероятность частоты, соответствующая пределам модального класса (Pmax) | 0,295±0,0299 | 0,271±0,0158 | 0,155±0,0252* |
| Диапазон времени реакции, соответствующий уровню вероятности от 0,5 Рмах (dT) | 0,065±0,0135 | 0,078±0,0065 | 0,075±0,0151 |
| Время простой зрительно-моторной реакции (T) | 0,311±0,0072 | 0,310±0,0054 | 0,210±0,0202* |
| Функциональный уровень нервной системы (ФУС) | 2,41±0,041 | 2,43±0,035 | 2,94±0,041* |
| Устойчивость нервной реакции (УР) | 1,62±0,322 | 1,34±0,1305 | 1,92±0,424* |
| Уровень функциональных возможностей сформированной функциональной системы (УФВ) | 2,79±0,332 | 2,51±0,1429 | 3,58±0,494* |
Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и средней ошибки (M±m). * — p≤0,05 при сравнении показателей группы носителей генотипа met/met и группы носителей генотипа val/val.
Рис. 2. Познавательная активность у учащихся с учетом носительства генотипов полиморфизма val158met гена COMT.
Обсуждение
Общий функциональный полиморфизм в гене COMT, выявленный у 61,9% учащихся, является результатом мутации G в A, определяет замену валина (val) на метионин (met) в кодоне 158 и объясняет наличие четырехкратного снижения активности фермента катехол-О-метилтрансферазы (COMT), метаболизирующего дофамин и определяя повышение его доступности [19].
Установленное статистически значимое увеличение у носителей генотипа met/met по сравнению с гомозиготными носителями генотипа val/val уровня тревожности и стресса, вероятно, можно объяснить тем фактом, что аллельная нагрузка в виде замены валина на метионин в 158 кодоне определяет эмоциональную реактивность [20—24].
Максимальная балльная оценка негативных эмоциональных переживаний у носителей генотипа met/met по сравнению с носителями варианта val/met, вероятно, может быть объяснена тем фактом, что высокое содержание дофамина у носителей генотипа met/met усиливает реакцию миндалевидного тела, ослабляя эффект подавляющего воздействия от префронтальной коры и увеличивая эффект возбуждающего воздействия от сенсорной коры. Более того, генотип COMT ассоциирован с активацией мозга (правый таламус и левый гиппокамп), вызванной неприятными стимулами. В итоге, у носителей аллеля met 158 лимбические сети могут быть более чувствительными к неприятным стимулам, и передача сигналов эмоциональной значимости может быть усилена [6].
При этом балльная оценка стрессоустойчивости у носителей генотипа val/val была статистически значимо выше, чем у носителей генотипа met/met, что согласуется с данными F. Papaleo и соавт. (2008), которые экспериментальным путем показали притупление стресс-реакций у носителей генотипа val/val [8].
В научной литературе имеются данные о преимуществах в когнитивной деятельности у носителей генотипа met/met на фоне когнитивной ригидности, тогда как показатели оперативной памяти лучше у носителей генотипа val/val [19]. Это объясняется тем, что чем ниже активность фермента COMT, разрушающего дофамин, тем выше концентрация последнего и тем выше активность прецентральной коры, которая функционально объединяет отдел коры больших полушарий головного мозга, представляющий собой переднюю часть лобных долей и включающий в себя 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 24, 25, 32, 44, 45, 46, 47-е поля по Бродману, которые отвечают за оперативную память и тормозящее действие, обеспечивающее концентрацию внимания [25]. Эти данные согласуются с полученными в настоящем исследовании результатами статистически значимого увеличения всех статистических показателей вариационной хронорефлексометрии у носителей генотипа met/met при сравнении с показателями носителей генотипа val/val. Это отразилось на интегральных показателях функционального состояния центральной нервной системы, которые оказались выше у носителей генотипа met/met, чем у носителей генотипа val/val, в среднем на 22,9%.
Статистически значимое увеличение познавательной активности в учебной деятельности на 23,7% у носителей генотипа val/val по сравнению с данными носителей генотипа met/met, вероятно, объясняется тем, что у носителей генотипа val/val более высокие когнитивные способности интеллектуального аспекта, чем у носителей варианта met/met [26].
Ограничения исследования
Применяемый в статье подход — исследование кандидатных генов — имеет свои ограничения, связанные с воспроизводимостью. В этой связи исследование может быть продолжено путем проведения более глубокого и сложного многоуровневого анализа взаимосвязи геномных ассоциаций (GWAS) и проявлений психических функций.
Заключение
Показано, что полиморфизм, заключающийся в замене в 158 кодоне гена COMT валина на метионин, снижает активность катехол-О-метилтрансферазы, разрушающей дофамин, что приводит к ухудшению некогнитивных эмоциональных на фоне повышенных когнитивных показателей психического здоровья школьников подросткового возраста. Это обусловливает внедрение более эффективных и персонализированных методов оптимизации работы дофаминергической системы в подростковом периоде.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.