Значение преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии в программах вспомогательных репродуктивных технологий

В настоящее время в России одним из способов профилактики наследственных заболеваний считают медико-генетическое консультирование и скрининг, которые проводят в два этапа: пренатальный — во время беременности и неонатальный — в течение 28 дней после рождения ребенка. Пренатальный и неонатальный скрининги позволяют проводить мероприятия по вторичной профилактике различных наследственных заболеваний у плода или новорожденного. Развитие вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с использованием преимплантационного генетического тестирования (ПГТ) с высокой степенью вероятности предоставляет возможность выбора наиболее перспективного/здорового эмбриона и может гарантировать супружеской паре благоприятный исход беременности. Это приводит к значительному прогрессу в лечении различных форм бесплодия, повышает востребованность ВРТ и способствует первичной профилактике различных генетически обусловленных заболеваний [1].

В зависимости от целей определения генетических нарушений у эмбриона выполняют следующие тесты: ПГТ-А, ПГТ-М и ПГТ-СП. Проведение ПГТ-А эмбриона позволяет определить анеуплоидию или нарушения в количественном наборе хромосом, ПГТ-М — нарушения и мутации в последовательности ДНК одного гена и ПГТ-СП — структурные аномалии одной или нескольких хромосом [2]. Учитывая, что анеуплоидии являются самыми распространенными вариантами хромосомных аномалий у эмбриона и основной причиной потери плода во время беременности, во многих центрах медико-генетического тестирования в подавляющем большинстве случаев проводят исследование ПГТ-А [3].

Согласно данным прогностической математической модели проведение ПГТ-А эмбриона в рамках программ ВРТ может предотвратить до 45% рождений детей с хромосомными нарушениями [4]. В то же время результаты проводимых среди женщин циклов экстракорпорального оплодотворения/интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ЭКО/ИКСИ) и ПГТ-А у эмбриона могут варьировать и зависеть от возраста, причин бесплодия и данных анамнеза супружеской пары, проходящей лечение бесплодия методом ЭКО [5]. В утвержденных клинических рекомендациях по диагностике и лечению бесплодия, опубликованных в 2019 г., проведение ПГТ-А у эмбриона рекомендовано в следующих клинических ситуациях [6]:

— женщинам старшего репродуктивного возраста (37 лет и старше);

— наличие двух и более самопроизвольных прерываний беременности в анамнезе;

— повторные неудачные попытки переноса «свежих» или размороженных эмбрионов;

— тяжелые нарушения сперматогенеза у мужчин.

Несмотря на повышение стоимости программы ВРТ с применением ПГТ-А, опубликованы данные, которые свидетельствуют, что проведение биопсии трофэктодермы эмбриона с целью определения его хромосомного статуса может быть экономически выгодным [7—9]. Так, проведение ПГТ-А эмбриона у женщин старше 35 лет увеличивает частоту живорождения в 3 раза, при этом наибольшая эффективность теста отмечается в возрастной группе 36—39 лет [7]. Расчеты показывают, что 1% дополнительного живорождения позволяет сэкономить до 45% средств, затраченных на проведение всего протокола ЭКО/ИКСИ [8]. Имеются данные, что у женщин с привычными выкидышами в анамнезе проведение ПГТ-А повышает частоту живорождения в 2,4 раза, а у пациенток 30—39 лет с нормальным индексом массы тела (ИМТ не более 24 кг/м²) — до 5 раз [9]. Если бесплодием страдает мужчина, то при патозооспермии проведение ПГТ-А эмбриона супружеских пар по программе ВРТ повышает частоту наступления беременности в 5,7 раза и частоту живорождения в 3,8 раза [10]. Таким образом, для повышения эффективности программы ВРТ с использованием ПГТ-А эмбриона необходимо иметь детальное описание клинических данных супружеских пар, обращающихся для лечения бесплодия.

Цель исследования — оценить значение и возможности применения ПГТ-А у супружеских пар разных возрастных групп при лечении бесплодия методом ВРТ.

За период 2016—2021 гг. на базе отделения вспомогательных репродуктивных технологий в лечении бесплодия им. профессора Б.В. Леонова ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России женщинам в возрасте 22—46 лет выполнено 13 595 процедур ЭКО/ИКСИ и проведено 3092 ПГТ-А эмбрионов. Женщины были распределены на 3 возрастные группы: в 1-ю группу включены женщины в возрасте от 22 до 30 лет, во 2-ю — от 31 до 36 лет, в 3-ю — от 37 до 46 лет. Всего было выполнено 1 108 протоколов, включавших полный комплекс процедур ЭКО/ИКСИ+ПГТ-А. До проведения комплекса процедур, предусмотренных протоколом, все супружеские пары прошли опрос и медицинское обследование согласно положениям приказов Минздрава России от 30.08.12 №107н и от 31.07.20 №803н [11, 12].

Для получения ооцитов женщинам проводили гормональную стимуляцию функции яичников. В одних случаях, начиная со 2—4-го дня менструального цикла, использовали протокол, позволяющий проводить стимуляцию антагонистом гонадотропин-рилизинг-гормона (антГнРГ) и использованием рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (р-ФСГ) или человеческого менопаузального гонадотропина (ЧМГ). В других случаях, при необходимости, использовали протокол с введением агониста гонадотропин-рилизинг-гормона (аГнРГ) на 21—22-й день цикла с последующим назначением р-ФСГ или ЧМГ на 2—4-й день последующего менструального цикла. Выбор протокола и препарата для овариальной стимуляции осуществлял лечащий врач индивидуально в каждом конкретном случае. Продолжительность стимуляция функции яичников составляла от 8 до 12 дней. На фоне гормональной стимуляции при достижении диаметра фолликулов 18 мм в качестве триггера финального созревания ооцитов использован хорионический гонадотропин (ХГ) в дозе от 5000 до 10 000 ЕД. При симптомах гиперстимуляции яичников, включающих жалобы, соответствующие показатели овариального резерва и данные ультразвукового исследования органов малого таза, пациенткам с мультифолликулярными яичниками проводили замену триггера финального созревания ооцитов на введение аГнРГ в дозе 0,2 мг подкожно (комментарий авторов: аГнРГ может быть использован как триггер финального созревания ооцитов у пациенток с риском гиперстимуляции яичников). Через 35—36 ч после введения триггера проводили трансвагинальную пункцию фолликулов. Из 1 108 проведенных комплексных процедур ВРТ по стандартным протоколам с ПГТ-А в 953 случаях оплодотворение полученных ооцитов было выполнено только методом ИКСИ, а в остальных 155 случаях — методом ИКСИ с селекцией сперматозоидов по их физиологическим особенностям (physiological ICSI, ПИКСИ), представляющим собой дополнительную эмбриологическую методику отбора зрелых и качественных сперматозоидов для оплодотворения яйцеклетки. Оценку наступления стадии двух пронуклеусов для формирования зиготы проводили через 14—16 часов после оплодотворения ооцита.

Проведение ПГТ-А эмбриона осуществляли после оплодотворения яйцеклетки на 5—6-е сутки. Для этого произведена биопсия клеток трофэктодермы эмбриона хорошего/отличного качества соответственно морфологическим критериям оценки (3-6 АВ, 3-6 ВА, 1-2 АА, 3-6 АА) с последующей его криоконсервацией [13]. При проведении молекулярно-генетической диагностики исследуемых образцов биопсии полученные клетки трофэктодермы переносили в пробирки типа Эппендорф, содержащие лизирующий буфер. Все этапы культивирования эмбриона в индивидуальных каплях по 25 мкл проходили в мультигазовых инкубаторах. Следует отметить, что в период 2016—2017 гг. в отделении для проведения ПГТ-А использован хромосомный микроматричный анализ (CGH, comparative genomic hybridization), а с 2018 г. — метод высокопроизводительного секвенирования ДНК нового поколения (NGS, next-generation sequencing).

После получения положительного результата по хромосомному статусу эмбрионов с помощью циклической гормональной терапии препаратами эстрадиола была проведена подготовка эндометрия. Циклическая гормональная терапия не проводилась при естественном менструальном цикле и наличии доминантного фолликула в день осмотра пациентки. Всем пациенткам был выполнен перенос 1 эуплоидного эмбриона. Исключение составили 5 пациенток, которым, по настойчивому обоюдному желанию супружеской пары, выполнен перенос двух эуплоидных эмбрионов. Эмбрионы переносили в полость матки на 19—22-й день менструального цикла при толщине эндометрия более 8 мм. Ведение и поддержку лютеиновой фазы цикла, а также посттрансферного периода выполняли по стандартной методике [2]. На 14-й день после переноса эмбриона в полость матки для диагностики беременности определяли содержание в крови бета-субъединиц хорионического гонадотропина человека (β-ΧГЧ). Через 21 день после переноса эмбриона при положительном результате анализа крови на β-ХГЧ для диагностики клинической беременности выполняли трансвагинальное ультразвуковое исследование. Дальнейшее наблюдение и ведение беременности осуществлялось в индивидуальном порядке лечащим врачом.

Статистическая обработка данных выполнена с помощью таблиц Microsoft Excel и статистической программы SPSS Statistics 22 (США). Для сравнения полученных результатов исследований в разных возрастных группах супружеских пар проводили статистический анализ с помощью χ²-теста. Для описания категориальных бинарных данных использовали абсолютные величины (n) и процентные доли (%) от общего числа пациенток в группе. За величину порогового уровня статистически значимых различий показателей в исследуемых группах принимали значения p≤0,05.

За период 2016—2021 гг. проведено 1108 протоколов, включавших комплексные программы ЭКО/ИКСИ- ПИКСИ+ПГТ-А. В зависимости от возрастной группы лечение по соответствующему протоколу получили 190 женщин 1-й группы, 387 женщин 2-й группы, 531 женщина 3-й группы. Самыми частыми причинами лечения бесплодия с проведением процедуры ПГТ-А были: старший (37 лет и более) репродуктивный возраст — 531 (48%) женщина, нарушения сперматогенеза — 387 (35%) мужчин, множественные неудачные попытки ЭКО в анамнезе — 222 (20%) женщины, а также наличие наружного генитального эндометриоза у 80 (15%) женщин старшего репродуктивного возраста. В меньшем количестве случаев обнаружены несбалансированные хромосомные транслокации численностью 6, 1 и 2 в каждой возрастной группе соответственно, а также дополнительно 1 полисомия по Y хромосоме во 2-й группе и 1 носитель мозаичного кариотипа (46 ХХ/47ХХХ) — в 3-й группе. Использование процедуры ПГТ-А способствовало тому, что ВРТ с проведением программы ЭКО/ИКСИ стали более востребованными среди супружеских пар разного репродуктивного возраста. Так, в процентном соотношении относительное число таких программ, которые сопровождались и процедурой ПГТ-А, увеличивалось с каждым годом и составило 6% в 2016 г., по 8% в 2017 и 2018 гг., 14% в 2019 г. и по 13% в 2020 и 2021 гг.

При анализе эффективности лечения бесплодия методом ВРТ были изучены частота переноса в полость матки криоконсервированных эуплоидных эмбрионов и наступления беременности, число живорождений у пациенток разных возрастных групп (таблица). За период 2016—2021 гг. на фоне циклической гормональной терапии или при естественном менструальном цикле удалось выполнить 627 криопротоколов, которые включали перенос в полость матки криоконсервированного эуплоидного эмбриона, прошедшего процедуру ПГТ-А, что составило 56,6% от всего комплекса процедур ВРТ. Женщинам 1-й группы таких криопротоколов выполнено 117, 2-й группы — 282, 3-й группы — 228. При этом доля криопротоколов была наибольшей (72,9%) во 2-й группе.

Эффективность программ лечения бесплодия методом вспомогательных репродуктивных технологий

Примечание. Протокол ЭКО/ИКСИ-ПИКСИ+ПГТ-А: экстракорпоральное оплодотворение/интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит и преимплантационное генетическое тестирование эмбриона на определение анеуплоидий. Данные представлены в количественном выражении (n) и в виде относительных (%) частот от числа женщин, прошедших процедуру, представленную ранее в данной возрастной группе. Исследуемые показатели статистически значимо не различались, при их сравнении в разных возрастных группах, p>0,05.

При переносе эуплоидного эмбриона в полость матки достигнутый положительный результат имплантации эмбриона практически не различался в группах и находился в пределах 40%: у 46 (39,3%) женщин 1-й группы, у 115 (40,8%) женщин 2-й группы и у 84 (36,8%) женщин 3-й группы. Вследствие положительной имплантации эмбриона разрешилась родами живым плодом 191 (78%) женщина, при этом количество женщин с живорождением было практически одинаковым в разных возрастных группах — в пределах 70—80%. У 11 из 33 женщин 1-й группы (22—30 лет) с живорождениями роды произведены путем операции кесарева сечения. У остальных 13 женщин 1-й группы диагностированы 8 неразвивающихся беременностей на раннем сроке, 4 биохимических беременности, выявленные методом определения бета-ХГ в сыворотке крови или в моче, и 1 внематочная беременность. У женщин 2-й группы было 94 родов живым плодом, из которых 46 — путем операции кесарева сечения, у 1 женщины — роды двойней. У остальных 21 женщины 2-й группы отмечены следующие исходы: беременность шеечной локализации (у 1 женщины), биохимическая беременность (у 12), неразвивающаяся беременность (у 8). Успешное разрешение беременности живым плодом зарегистрировано у 64 женщин 3-й группы, из которых у 30 — путем операции кесарева сечения, а у двоих — роды двойней. У оставшихся 20 женщин этой возрастной группы были следующие исходы: 13 неразвивающихся беременностей и 7 биохимических беременностей.

При сравнении показателей (%) наступления беременности и живорождения у женщин разных возрастных групп, получивших комплексное лечение бесплодия методом ВРТ по программе ЭКО/ИКСИ-ПИКСИ+ПГТ-А, статистически значимых различий выявлено не было (p>0,05).

Эффективность выполнения программ ЭКО/ИКСИ- ПИКСИ+ПГТ-А зависит от клинических данных супружеских пар, диагностических и терапевтических возможностей [2, 4, 5]. Современное развитие технологий, позволяющих проводить диагностику патологических изменений на хромосомном уровне доимплантационного этапа развития эмбриона, способствует повышению эффективности и востребованности ВРТ и является экономически выгодной стратегией лечения бесплодия [7—10]. В нескольких исследованиях показано, что максимальная эффективность программ ВРТ с применением ПГТ-А отмечена у пациенток в возрасте до 40 лет и составляет 36—45% [7, 10, 14]. Наиболее вероятно, что снижение эффективности программы ЭКО/ИКСИ с применением ПГТ-А у пациенток старшего репродуктивного возраста обусловлено малым числом получаемых в ходе стимуляции функции яичников ооцитов и, соответственно, эмбрионов, а также высокой частотой отмены переноса эмбриона в полость матки, в связи с выявлением у него анеуплоидий [14]. В настоящем исследовании сопоставимая частота живорождения у пациенток разных возрастных групп, вероятнее всего, связана с тем, что для анализа использованы протоколы супружеских пар, у которых в стимулированном цикле ЭКО/ИКСИ-ПИКСИ получен как минимум один эуплоидный качественный/здоровый эмбрион. Это может свидетельствовать о том, что наибольший вклад в эффективность программы ВРТ вносит наличие эуплоидного здорового эмбриона для переноса в полость матки и, в меньшей степени, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез. К отягощенному акушерско-гинекологическому анамнезу относили: изменения эндометрия вследствие многочисленных диагностических гистероскопий, выскабливаний полости матки после неудачных/нежелательных беременностей или другой внутриматочной патологии (полипов, гиперплазии эндометрия и т.д.).

Увеличение количества программ вспомогательных репродуктивных технологий с выполнением протоколов экстракорпорального оплодотворения/интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит с селекцией сперматозоидов по особенностям их физиологии, сопровождающихся определением хромосомного статуса эмбриона путем ПГТ-А, свидетельствует о повышении качества таких программ и, соответственно, их востребованности. Совершенствование диагностической точности проведения ПГТ-А на определение анеуплоидий эмбриона позволит расширить показания и будет способствовать увеличению частоты назначения данного исследования супружеским парам, нуждающимся в применении вспомогательных репродуктивных технологий.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — Н.П. Макарова, Е.В. Кулакова, Е.А. Калинина; сбор и обработка материала — Ю.С. Драпкина, Е.В. Кулакова, А.Н. Екимов; написание текста — Ю.С. Драпкина, Н.П. Макарова; редактирование — Е.В. Кулакова, А.Н. Екимов, Н.П. Макарова, Е.А. Калинина.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.