Исследование атромбогенных и тромбогенных факторов эндотелия у женщин с неожиданным бедным и субоптимальным ответом яичников при лечении бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий

Проблема репродуктивного здоровья населения носит глобальный характер. Примерно у каждого 6-го человека в мире, т.е. у 17,5% взрослого населения, согласно данным Всемирной организации здравоохранения, выявлено бесплодие. В России частота бесплодия колеблется от 17,2 до 24% в разных регионах и не имеет тенденции к снижению [1].

Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) — это группа методов лечения бесплодия, при которых один или несколько этапов зачатия, включая оплодотворение и раннее развитие эмбриона, происходят вне организма. На сегодняшний день показания к применению ВРТ значительно расширились. Эти методы используются не только при бесплодии разного генеза, но и при некоторых формах невынашивания беременности, при наличии медицинских показаний к выбору пола плода, а также в других клинических ситуациях, при которых требуется вмешательство в процесс зачатия.

По данным отчета Общероссийской общественной организации «Российская Ассоциация Репродукции Человека» (РАРЧ), частота наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в 2021 г. составила в расчете на цикл 28,6% (в 2020 г. 28,9%), на пункцию 29,9% (в 2020 г. 30,0%), на перенос эмбрионов 34,8% (в 2020 г. 34,8%) [2]. Следует отметить, что эффективность ВРТ зависит от многих факторов, например от возраста женщины, качества переносимых эмбрионов, состояния эндометрия [3].

Одним из ключевых моментов, определяющих исход лечения бесплодия методами ВРТ, является количество получаемых ооцитов. По данным литературы, низкий шанс наступления беременности наблюдается в случае слабого ответа яичников на стимуляцию при получении от 4 ооцитов и менее. Получение 5—9 ооцитов является субоптимальным ответом, 10—15 — оптимальным ответом яичников на стимуляцию [4, 5].

Согласно Болонским критериям, чтобы говорить о «бедном ответе», необходимо присутствие не менее двух из трех следующих факторов: возраст более 40 лет, слабый ответ на предыдущую стимуляцию и низкий овариальный резерв, который определяется количеством антральных фолликулов <5—7 и уровнем антимюллерова гормона (АМГ) <0,5—1,1 нг/мл [6].

С проблемой «бедного ответа» и субоптимального ответа на стимуляцию яичников в протоколах ВРТ сталкиваются не менее 15% женщин с нормальным овариальным резервом. Эти женщины составляют особую группу пациентов с неожиданным «бедным» ответом и субоптимальным ответом. Помимо оценки овариального резерва и количества антральных фолликулов, визуализируемых в начале стимуляции, по-видимому, есть дополнительные механизмы, определяющие чувствительность яичников к воздействию экзогенных гонадотропинов в конкретном цикле. Среди них молекулярно-генетические особенности рецепторов фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), а также влияние различных факторов роста внутри ооцита и в его окружении. Представляет интерес феномен «неожиданного бедного ответа» яичников у женщин с нормальным овариальным резервом, а также вариабельность овариального ответа у одной и той же пациентки в разных менструальных циклах — так называемые межменструальные колебания ответа яичников от цикла к циклу.

На количество и качество получаемых ооцитов влияет их микроокружение, которое связано с функционированием эндотелия. Эндотелиальные клетки синтезируют большое количество биологически активных веществ, регулирующих работу женской репродуктивной системы и отвечающих за пролиферацию, поддержание гемостаза, тонуса сосудов, подавление локального воспаления (фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), тромбомодулин, фактор Виллебранда, эндотелин-1, оксид азота и др.).

Эндотелиальная дисфункция сопряжена со смещением равновесия в сторону образования прокоагулянтных факторов, что может быть ассоциировано как с нарушением созревания ооцитов, так и с развитием тромботических осложнений у женщин, проходящих лечение бесплодия методами ВРТ.

По данным литературы, маркерами нарушения тромборезистентности эндотелия являются фактор Виллебранда и тромбомодулин. Фактор Виллебранда — крупный гликопротеид плазмы крови, который синтезируется в эндотелии и мегакариоцитах. Он принимает участие в реализации сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза. Увеличение уровня фактора Виллебранда в крови наблюдается при массивном повреждении эндотелия и свидетельствует о повышенной склонности к тромбообразованию.

Тромбомодулин является интегральным мембранным гликопротеидом, продуцируемым эндотелием сосудов. Когда он взаимодействует с тромбином, активируется естественный антикоагулянт — протеин C. В норме тромбомодулин связан с мембраной эндотелиальных клеток, поэтому увеличение его концентрации в крови рассматривается в качестве маркера эндотелиальной дисфункции [7].

Показано, что у пациенток с ожирением при синдроме поликистозных яичников (СПКЯ), который ассоциирован с развитием эндотелиальной дисфункции, количество прокоагулянтных белков, в том числе фактора Виллебранда, значительно выше по сравнению с контрольной группой [8]. Кроме того, выявлено, что уровень фактора Виллебранда — маркера дисфункции эндотелия — в плазме крови женщин с тяжелым синдромом гиперстимуляции яичников (СГЯ) увеличивается еще до клинических проявлений заболевания [9].

Поэтому исследование роли тромбогенных и антитромбогенных факторов эндотелия в созревании ооцитов у женщин, проходящих лечение по поводу бесплодия методами ВРТ, необходимо для увеличения эффективности терапии, а также для повышения количества полученных ооцитов в протоколах стимуляции.

Цель исследования — оценить уровни маркеров повреждения эндотелия тромбомодулина и фактора Виллебранда у женщин с разными исходами гормональной стимуляции яичников при лечении бесплодия методами ВРТ.

Проведено простое открытое сравнительное рандомизированное исследование в параллельных группах. На основании информированного добровольного согласия обследованы 53 женщины Волгоградской области, проходящие лечение бесплодия методами ВРТ. Критерии включения: возраст до 42 лет включительно (средний — 34,57±4,61 года) и уровень АМГ >1,2 нг/мл. Критерии исключения: возраст менее 18 и более 42 лет, «мягкие» протоколы стимуляции яичников (ежедневная доза гонадотропинов менее чем 100 МЕ в сутки), болезнь Виллебранда, отказ от участия в клиническом исследовании.

Перед стимуляцией проведена оценка овариального резерва, включающая определение уровня АМГ и ФСГ, а также количества антральных фолликулов в ранней фолликулярной фазе.

Уровень ФСГ определяли не позднее, чем за 6 мес до проведения стимуляции на 2—5-й день менструального цикла.

Гормональная стимуляция яичников назначалась врачами Клиники №1 ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России в соответствии с клиническими рекомендациями, учетом индивидуальных особенностей и интересов пациента.

В исследование включены случаи со стимуляцией по протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона с использованием гонадотропинов (Фоллитропин альфа или бета) в ежедневной дозе не менее 100 МЕ (средняя стартовая доза ФСГ составляла 125 МЕ, суммарная доза — 1700 МЕ) до достижения преовуляторными фолликулами диаметра от 17 мм. В последующем вводили триггер финального созревания ооцитов в стандартных дозах (хориогонадотропин альфа 250 мкг/0,5 мл или агонист гонадотропин-рилизинг-гормона 0,2 мг в случае, если врач прогнозировал высокий риск возникновения синдрома СГЯ, т.е. рост более 15 фолликулов, низкий индекс массы тела, синдром поликистозных яичников в анамнезе), за исключением «мягких» стимуляций (менее чем 100 МЕ в сутки), при лечении бесплодия методами ВРТ с высоким и нормальным, субоптимальным и «бедным ответом» яичников.

Применения двойного триггера не было. Пункции выполняли через 36 ч после введения триггера.

Оценка результатов стимуляции яичников проведена методом микроскопии: произведен подсчет комплексов ооцит—кумулюс, определено количество зрелых ооцитов.

Исходя из результатов стимуляции яичников, женщины были разделены на группы:

1-я — женщины с высоким и нормальным ответом, получено 10 ооцитов и более (группа сравнения);

2-я — женщины с субоптимальным ответом, получено 5—9 ооцитов;

3-я — женщины с «бедным овариальным ответом», получено 4 ооцита и менее.

Однократный забор крови для оценки уровней тромбомодулина и фактора Виллебранда производили с 8:00 до 11:00 утра после венепункции, которую выполняли в рамках подготовки к стандартному анестезиологическому пособию в день трансвагинальной пункции яичников. Кровь помещали в вакуумные пробирки BD Vacutainer («Becton Dickinson and Company», США) с цитратом натрия для коагулогических исследований (соотношение цитрата натрия к крови составляло 1:9). Далее пробы центрифугировали 15 мин при 1000 g и температуре 2—8 °C. Собранную после центрифугирования плазму помещали в пробирки типа эппендорф и замораживали при –20 °C до момента проведения иммуноферментного анализа.

Для оценки уровней тромбомодулина и фактора Виллебранда использовали наборы ELISA Kit for Thrombomodulin («Cloud-Clone Corporation», США) и ELISA Kit for Von Willebrand Factor («Cloud-Clone Corporation», США) соответственно. Перед проведением анализа пробы были разбавлены в 10 раз для тромбомодулина и в 100 раз для фактора Виллебранда 0,01 моль/л фосфатно-солевым буферным раствором (pH=7,0—7,2) (ООО НПО «Иммунотэкс», Россия) согласно методическим рекомендациям к наборам реагентов.

Оптическую плотность образцов определяли на планшетном спектрофотометре SPECTROstar Nano («BMG Labtech», Германия) при длине волны 450 нм.

Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России: протокол №049 от 13 февраля 2023 г.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ GraphPad Prism 8 («GraphPad Software Inc.», США). Нормальность распределения проверяли по критерию Шапиро—Уилка. При нормальном распределении изучаемых параметров использовали критерий Тьюки. При ненормальном распределении применяли тест Краскела—Уоллиса с пост-хок тестом Данна. Кроме того, проведена оценка равенства дисперсий (equal SDs) — при различии дисперсий использовали тесты Брауна—Форсайта и Уэлча. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Данные представлены в виде M±SD, где M — среднее арифметическое значение, SD — стандартное отклонение.

Показатели овариального резерва у пациенток, проходящих лечение бесплодия ВРТ, представлены в табл. 1. У всех женщин количество антральных фолликулов в среднем составляло >7, а уровень АМГ был >1,2 нг/мл, что свидетельствует о нормальном овариальном резерве. Несмотря на это, в ответ на стимуляцию яичников гонадотропинами (средняя стартовая доза ФСГ составляла 125 МЕ, суммарная доза — 1700 МЕ) у пациенток наблюдались «неожиданные» «бедный ответ» и субоптимальный ответ. Нужно отметить, что женщины с субоптимальным ответом и «бедным ответом» были в 1,12 (p_1—2=0,0022) и 1,10 (p_1—3=0,0083) раза старше, чем женщины группы сравнения (32,71±4,3, 36,65±3,05 и 36,15±3,98 соответственно). При этом статистически значимой разницы в возрасте между 2-й и 3-й группами не наблюдалось, поэтому корректно будет сравнивать данные женщин с субоптимальным ответом и «бедным ответом».

Таблица 1. Показатели овариального резерва и ответа на стимуляцию яичников

Примечание. Данные представлены в виде M±SD. АМГ — антимюллеров гормон; ФСГ — фолликулостимулирующий гормон.

Количество пунктированных фолликулов у женщин 3-й группы было меньше в 2,14 раза (p_2—3=0,0001) относительно показателей у женщин с субоптимальным ответом (6,87±3,36 и 14,67±4,29). В отношении количества комплексов ооцит—кумулюс тенденция сохранялась: у женщин с «бедным ответом» их было меньше в 2,71 раза (p_2—3<0,0001) (3,53±0,99 и 9,58±2,78).

Количество антральных фолликулов, полученных зрелых ооцитов и уровень ФСГ статистически значимо не различались у женщин 2-й и 3-й групп, вместе с тем имелась тенденция к снижению исследуемых показателей у женщин с «бедным ответом».

При исследовании уровней тромбомодулина не было статистически значимых различий между группами. Однако имелась тенденция к снижению данного показателя у женщин с «бедным ответом» относительно группы сравнения и группы женщин с субоптимальным ответом. Количество фактора Виллебранда в плазме пациенток с субоптимальным ответом и «бедным ответом» было больше в 1,47 (p_1—2=0,0030) и 1,45 (p_1—3=0,0022) раза по сравнению с показателями у женщин 1-й группы (0,85±0,19, 0,84±0,25 и 0,58±0,21 нг/мл соответственно) (табл. 2), что свидетельствует о повреждении эндотелия и смещении равновесия в сторону тромбообразования.

Таблица 2. Уровни тромбомодулина и фактора Виллебранда в плазме у женщин с разным ответом на стимуляцию яичников

Примечание. Данные представлены в виде M±SD.

Эндотелий вырабатывает вазоактивные вещества, синтезирует факторы роста сосудов и тканей, противовоспалительные цитокины, регулирующие специфические иммунные реакции и ограничивающие развитие воспаления, участвует в контроле активности свертывающей системы крови, что необходимо для регуляции работы всех органов и систем.

A. Kedem и соавт. (2017) обнаружили, что совместное культивирование в 48-луночных планшетах активированных эндотелиальных клеток яичников (АЭКЯ) с первичными и вторичными фолликулами приводило к увеличению роста последних в среднем на 33 и 15 мкм соответственно, а также к повышению выживаемости первичных и вторичных фолликулов по сравнению с фолликулами, для которых использовали только культуральные системы Matrigel и Gel. Кроме того, АЭКЯ способствовали росту ооцитов, однако преимущественно в первичных фолликулах [10].

В экспериментальном исследовании G. Kim и соавт. (2018) показано, что внутривенное введение эндотелиальных клеток-предшественников человека (ЭКПЧ) в хвостовую вену мышей способствовало замедлению репродуктивного старения ооцитов. Авторы обнаружили, что у животных, получавших ЭКПЧ, наблюдалось увеличение скорости образования бластоцисты и количества клеток бластоцисты, уменьшение в яичниках экспрессии генов Ifn-γ, Il-1β и Tnfα, отвечающих за воспаление, а также генов PERK, IRE1α, связанных со стрессом эндоплазматического ретикулума, по сравнению с контрольной группой. Кроме того, у мышей, которым вводили ЭКПЧ, в яичниках увеличивалась экспрессия антиапоптотического гена Bcl2 [11].

При эндотелиальной дисфункции наблюдается преобладание протромбогенных факторов над атромбогенными. Маркером нарушения тромборезистентности эндотелия является фактор Виллебранда — крупный гликопротеин плазмы крови, который участвует в сосудисто-тромбоцитарном и коагуляционном гемостазе [7]. Повышение уровня данного фактора наблюдается при многих патологических состояниях, которые ассоциированы с острым и хроническим повреждением эндотелия: сердечной недостаточности [12], артериальной гипертензии [13], почечной дисфункции [14] и др.

В нашем исследовании показано, что у женщин, имевших субоптимальный или «бедный ответ» на стимуляцию яичников гонадотропинами при лечении бесплодия методами ВРТ, наблюдается статистически значимое увеличение уровня фактора Виллебранда в плазме крови по сравнению с пациентками группы сравнения. Болезнь Виллебранда у пациенток исключена на основании клинического обследования.

Согласно данным литературы, уровень этого маркера дисфункции эндотелия повышается у женщин с СГЯ [9]. Количество фактора Виллебранда также увеличивалось у пациенток с диагнозом СПКЯ, который основывался, по крайней мере, на двух из трех диагностических критериев Роттердамского консенсуса: клинические и биохимические доказательства гиперандрогении, олигоменорея или аменорея, поликистоз яичников по данным трансвагинального ультразвукового исследования [8]. Кроме того, фенотип СПКЯ также влияет на уровень исследуемого показателя — у женщин с классическим фенотипом A и фенотипом B (с ановуляцией и гиперандрогенемией, но без поликистоза яичников) количество антигенов к фактору Виллебранда было статистически больше относительно контрольной группы [15]. Нужно отметить, что в I триместре беременности у женщин с СПКЯ, который сопровождается выраженным андроген-ассоциированным повреждением эндотелия, фактор Виллебранда превышает значения у здоровых беременных пациенток с самостоятельно наступившей беременностью [16]. Это приводит к повышению тромбообразования и может сопровождаться неудачами имплантации, замершей беременностью, выкидышами.

В исследовании Ю.П. Вдовиченко и соавт. (2019) показано, что у женщин с метаболическим синдромом и неоднократными неудачами при проведении программ ВРТ наблюдается повышенная активность фактора Виллебранда относительно показателей группы сравнения. Эндотелиальная дисфункция и микротромбозы ассоциированы с нарушением процессов имплантации, инвазии трофобласта и плацентации, что приводит к последующим гестационным осложнениям [17].

У женщин с «бедным ответом» и субоптимальным ответом на стимуляцию яичников при лечении бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий повышен уровень фактора Виллебранда в плазме крови по сравнению с пациентками с высоким и нормальным ответами, что может свидетельствовать об эндотелиальной дисфункции у первых.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Перфилова В.Н.

Сбор и обработка материала — Музыко Е.А., Кустова М.В., Мухина А.В., Фокина А.Ю., Журавлева Е.И.

Статистический анализ данных — Музыко Е.А.

Написание текста — Музыко Е.А.

Редактирование — Перфилова В.Н., Тихаева К.Ю.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда в рамках проекта №23-25-00067 «Роль эндотелия в регуляции созревания ооцита при лечении бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.