Введение

По сообщениям ряда авторов, занимающихся проблемами изменения морфологии женских половых клеток, частота выявления тех или иных дисморфизмов ооцитов может достигать 50% [1, 2]. При этом аномалии морфологии ооцитов принято подразделять следующим образом: 1) экстрацитоплазматические, к которым относят клетки с измененными размерами и формой, аномалиями zona pellucida, изменениями в перивителлиновом пространстве, аномалиями первого полярного тела (рис. 1); 2) интрацитоплазматические, к которым относят центральную и периферическую грануляцию цитоплазмы ооцита, вакуоли, SER-диски, наличие рефрактерных (липофусциновых) тел (рис. 2).

Рис. 1. Экстрацитоплазматические аномалии ооцита.

а — аномалия формы; б — гигантское первое полярное тело; в — фрагментация первого полярного тела; г — аномалия zona pellucida и перивителлиновый дебрис.

Рис. 2. Интрацитоплазматические аномалии ооцита.

а — ооцит с вакуолями; б — ооцит с центральной грануляцией; в — ооцит с периферической грануляцией; г — ооцит с рефрактерными тельцами.

Данные о влиянии дисморфизмов на оплодотворение и преимплантационное развитие эмбриона, а также на потенциал эмбриона к имплантации различаются. Так, сообщается, что интрацитоплазматические дисморфизмы определяют цитоплазматическую незрелость ооцита и, следовательно, влияют на способность к фертилизации и развитие эмбриона [3, 4]. Получены данные о том, что наличие вакуолей диаметром более 14 мкм и рефрактерных тел более 5 мкм снижает частоту нормального оплодотворения, в то же время дисморфизмы меньшего размера не оказывают влияния ни на один из параметров раннего эмбриогенеза [5—8]. Сообщения о влиянии грануляции цитоплазмы на частоту оплодотворения и дробления при культивировании эмбрионов имеют противоречивый характер [4, 9, 10].

Наличие некоторых экстрацитоплазматических дисморфизмов иногда считают вариантом нормы, связанным с культивированием in vitro либо характерным для определенной возрастной группы пациенток, однако не выявлена четкая корреляция возраста и наличия данных аномалий [11, 12]. Аномалии формы ооцита, по данным разных авторов, не оказывают влияния на частоту оплодотворения, дробления и формирования бластоцист [5]. Аномалии zona pellucida и перивителлинового пространства считают связанными со снижением частоты формирования бластоцист хорошего и отличного качества [10, 13—16]. К аномалиям первого полярного тельца относят его фрагментацию и увеличение размера (гигантское первое полярное тело). Данные о влиянии фрагментации на оплодотворение и ранний эмбриогенез также противоречивы: в ряде исследований показано, что наличие фрагментации первого полярного тела снижает частоту оплодотворения и частоту получения эмбрионов хорошего и отличного качества [17—20], в других же исследованиях данные закономерности не выявлены [21—23]. Наличие гигантского первого полярного тела, по данным ряда авторов, оказывает влияние на частоту нормального оплодотворения и дробления, увеличивает частоту фрагментации эмбриона при дроблении, а также коррелирует с частотой мультинуклеации бластомеров. Наличие данного дисморфизма приводит к остановке развития эмбрионов, а также увеличивает частоту анэуплоидии [21, 24]. Таким образом, в настоящее время однозначно не рекомендованы к оплодотворению только так называемые гигантские ооциты вследствие формирования из ооцитов с таким дисморфизмом эмбрионов с аномальным хромосомным набором [5, 25, 26].

Следует отметить, что на сегодняшний день нет четкого понимания причин формирования того или иного дисморфизма женских половых клеток. Сообщения о связи с возрастом пациенток либо со схемами овариальной стимуляции в последующем не получили подтверждения.

Цель исследования — оценить морфологические параметры ооцитов женщин разных возрастных групп и их влияние на эмбриологический этап программы ВРТ.

Материал и методы

Исследование проведено на базе эмбриологической лаборатории ООО «ЭкоКлиника» (г. Челябинск). Оценке подвергались 685 ооцитов от 53 пациенток. Женщины, получавшие лечение с применением ВРТ, разделены на группы по возрасту: 1-я группа включала пациенток до 29 лет (n=11, количество ооцитов 208), 2-я группа — от 30 до 34 лет (n=18, количество ооцитов 243), 3-я группа — от 35 до 39 лет (n=18, количество ооцитов 192), 4-я группа — от 40 лет и выше (n=6, количество ооцитов 42). Пациенткам проведена овариальная стимуляция с последующим введением триггера овуляции за 37 ч до трансвагинальной пункции фолликулов. Полученные комплексы «ооцит — кумулюс» подвергались денудации в среде ICSI Cumulase (Origio A/S, Дания), оценка морфологии ооцитов осуществлялась не позднее 40 ч после введения триггера овуляции с использованием инвертированного микроскопа Olympus IX73 (Olympus Corporation, Япония). Оплодотворение проводили методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) в среде Flushing Medium (Origio A/S, Дания), покрытой культуральным маслом Liquid Paraffin (Origio A/S, Дания). Среды предварительно были нагреты до 37°C. Дальнейшее культивирование осуществляли в среде Sage 1-step (Origio A/S, Дания), покрытой культуральным маслом Liquid Paraffin (Origio A/S, Дания). Среда для культивирования и масло предварительно эквилибрированы в условиях 37°C при 6% СО₂ и 5% О₂ в планшетных инкубаторах Labotect Labo C-Top (Labotect Labor-Technik-Göttingen GmbH, Германия). Культивирование осуществлялось в условиях 37°C при 6% CO₂ и 5% O₂. Оценка оплодотворения и дробления проводилась каждый день в одно и то же время до 6 сут развития эмбриона.

Оценивали такие морфологические параметры, как зрелость ооцита, форма (сферическая, несферическая), наличие гигантских ооцитов, вакуоли, грануляция (центральная и периферическая), наличие рефрактерных тел и SER-дисков, аномалии полярного тела (фрагментация, увеличение размера), аномалии zona pellucida, наличие перивителлинового дебриса, увеличение перивителлинового пространства. Данные параметры сопоставлялись с такими критериями эмбриологического этапа ВРТ, как частота нормального и аномального оплодотворения, частота дегенерации ооцитов после оплодотворения, частота дробления и количество эмбрионов хорошего качества, а также количество остановившихся эмбрионов на 2-й и 3-й день развития, частота образования морул на 4-й день развития, частота бластуляции и количество бластоцист хорошего и отличного качества на 5-е и 6-е сутки развития эмбриона.

Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием лицензированной программы SPSS Statistics v23 x64 (SPSS Inc., США). Применяли метод парных корреляций для непараметрических данных с использованием коэффициента корреляции Спирмена (rs). Силу корреляционной зависимости параметров определяли по шкале Чеддока, при этом учитывались значения коэффициента корреляции Спирмена от 0,3 (0,3—0,5 — умеренная корреляция, 0,5—0,7 — заметная корреляция, 0,7—0,9 — высокая корреляция и 0,9—1 — весьма высокая корреляция). Корреляция между параметрами считалась статистически значимой при p<0,05.

Результаты

В ходе проведенного исследования ооциты пациенток распределяли по группам в соответствии с возрастом женщин: в группе пациенток до 29 лет частота выделения зрелых ооцитов составила 80,9±4,6%, в группе пациенток от 30 до 34 лет — 77,5±3,5%, в группе пациенток от 35 до 39 лет — 78,6±6,3%, в группе пациенток от 40 лет и старше — 73,4±8,5%. Результаты представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (M±m). Статистически значимых различий в группах по зрелости ооцитов не выявлено.

Дальнейшей морфологической оценке подвергались только зрелые ооциты, поскольку только они принимали участие в процессе оплодотворения. Относительное количество аномальных ооцитов у пациенток изучаемых групп составило: в группе до 29 лет — 75,6±6,3% от общего количества зрелых ооцитов, в группе от 30 до 34 лет — 82,6±3,2%, в группе от 35 до 39 лет — 82,2±5,6%, в группе 40 лет и старше — 97,9±2,1%. При этом у пациенток возрастной группы 40 лет и старше выявлено статистически значимое повышение доли аномальных ооцитов по сравнению с женщинами остальных групп (рис. 3).

Рис. 3. Распределение относительного количества зрелых ооцитов и ооцитов с дисморфизмами у пациенток разных возрастных групп.

* — результаты статистически значимы (p<0,05).

Нами также проведено распределение конкретных морфологических изменений ооцитов в пределах каждой изучаемой возрастной группы (таблица).

Распределение дисморфизмов ооцитов по возрастным группам пациенток

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (M±m).

Статистический анализ с использованием метода парных корреляций показал отсутствие корреляций между возрастом и конкретными морфологическими изменениями ооцитов, кроме наличия рефрактерных телец в цитоплазме ооцита. Для данного вида дисморфизма найдена умеренная прямая корреляция с возрастными группами пациенток (коэффициент корреляции Спирмена rs=0,383, p=0,005). При этом рефрактерные тельца в нашем исследовании не оказывали влияния на изучаемые параметры эмбриогенеза.

Парный корреляционный анализ показал умеренную прямую зависимость между количеством полученных ооцитов и такими дисморфизмами ооцитов, как центральная грануляция (rs=0,351, p=0,010) и перивителлиновый мусор (rs=0,312, p=0,023). При этом показана умеренная обратная связь между наличием центральной грануляции и частотой дробления на 2-й день (rs= –0,323, p=0,018) и 3-й день (rs= –0,330, p=0,018) эмбрионального развития in vitro.

Такой дисморфизм, как перивителлиновый дебрис, в проведенном нами статистическом анализе данных имел прямую корреляцию с частотой дегенерации после оплодотворения (rs=0,411, p=0,002) и частотой остановки дробления на 3-й день эмбрионального развития in vitro (rs=0,315, p=0,022), а также обратную корреляцию с частотой нормального оплодотворения (rs= –0,341, p=0,012).

С частотой остановки дробления на 3-й день развития эмбриона коррелирует увеличение перивителлинового пространства (rs=0,327, p=0,017).

Аномалии zona pellucida показали умеренную отрицательную связь с формированием бластоцист хорошего и отличного качества на 5—6-й день культивирования эмбрионов (rs= –0,320, p=0,030).

Отдельно следует отметить аномалии полярного тела, которые показали прямую корреляцию с несколькими важными параметрами эмбриогенеза. Так, наличие гигантского полярного тела коррелирует с частотой аномального оплодотворения ооцитов (1pn — rs=0,420, p=0,002; 3pn — rs=0,326, p=0,017), а наличие фрагментации первого полярного тела при сохранении средних размеров связано с частотой аномального оплодотворения 3pn (rs=0,383, p=0,005).

Гигантские ооциты исключались из процесса оплодотворения в силу того, что есть много данных, указывающих на наличие анэуплоидий в клетках такого типа. Влияние остальных дисморфизмов на параметры эмбриогенеза в ходе анализа полученных данных не выявлено.

Обсуждение

В ходе статистического анализа результатов проведенного исследования не удалось выявить корреляционную зависимость между частотой получения зрелых клеток и возрастными группами пациенток. Однако качество полученных зрелых ооцитов, согласно результатам нашего исследования, находится в прямой зависимости от возраста пациенток. Так, частота выявления различного рода дисморфизмов у пациенток в возрасте до 29 лет составила 75,6±6,3%, и данный параметр постепенно увеличивался к 39 годам — до 82,2±5,6%. Частота обнаружения аномалий ооцитов у пациенток после 40 лет резко возросла и составила 97,9±2,1%. При этом корреляция с возрастом выыявлена только для одного вида дисморфизма — наличия в ооплазме рефрактерных тел, не оказывающего, однако, влияния на частоту нормального оплодотворения и ранний эмбриогенез. Обнаружена прямая связь между количеством полученных комплексов «ооцит — кумулюс» и наличием таких дисморфизмов, как центральная грануляция и дебрис в перивителлиновом пространстве. При этом если другие интрацитоплазматические аномалии ооцита практически не оказывали влияния на частоту оплодотворения и параметры раннего эмбриогенеза, то центральная грануляция отрицательно влияла на частоту дробления эмбрионов при культивировании в условиях in vitro, что согласуется с данными ранее проведенных исследований [7].

Полученные результаты свидетельствуют о преимущественном влиянии на параметры эмбриогенеза прежде всего экстрацитоплазматических аномалий. Так, выявлена корреляция между наличием перивителлинового дебриса и снижением частоты нормального оплодотворения ооцитов, увеличением частоты дегенерации после ИКСИ и остановки эмбрионов на стадии дробления. Другая аномалия — увеличение перивителлинового пространства — связана с остановкой развития эмбрионов на 3-й день культивирования in vitro. Эти выводы частично согласуются с результатами предыдущих исследований, которые показали снижение частоты оплодотворения ооцитов при наличии данных дисморфизмов [10, 14].

Аномалии zona pellucida отрицательно влияют на качество формирующихся бластоцист. Ранее опубликованные данные о влиянии данного дисморфизма на частоту оплодотворения и развитие эмбрионов противоречивы [6, 27].

Экстрацитоплазматическими дисморфизмами, оказавшими, по нашим данным, отрицательное влияние на параметры раннего эмбриогенеза, являются аномалии первого полярного тела (фрагментация и увеличение размера), которые прямо коррелируют с частотой аномального оплодотворения, что может говорить о нарушении хромосомного набора полученной зиготы. При этом исследования влияния фрагментации первого полярного тела на ранний эмбриогенез показали также неоднозначные результаты. В частности, обнаружена взаимосвязь данного дисморфизма со снижением частоты оплодотворения, дробления и формирования эмбрионов хорошего качества [17—20]. Данные об ооцитах с увеличением размера первого полярного тела указывают не только на снижение частоты нормального оплодотворения, дробления и развития эмбрионов, но и на возникновение мультиядерных бластомеров, остановку развития и увеличение частоты анэуплоидных эмбрионов [24].

Выводы

Проведя оценку морфологических параметров ооцитов женщин разных возрастных групп и их влияния на эмбриологический этап программы вспомогательных репродуктивных технологий, мы пришли к выводу, что с возрастом женщины значительно ухудшается качество ооцитов в составе комплексов «ооцит — кумулюс», что проявляется в увеличении частоты выявления морфологических аномалий. При этом такие дисморфизмы, как центральная грануляция, перивителлиновый дебрис, увеличение перивителлинового пространства, аномалии zona pellucida и аномалии первого полярного тела (фрагментация и увеличение размера), могут оказать отрицательное влияние на эмбриологический этап программы вспомогательных репродуктивных технологий. Однако ооциты с данными дисморфизмами могут быть использованы в программах вспомогательных репродуктивных технологий, поскольку не выявлены сильные корреляции между данными аномалиями и неблагоприятными исходами.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.