Введение

Эндометриоз является одной из актуальных проблем современной гинекологии и остается предметом активного изучения на протяжении многих десятилетий. По совокупности данных более 176 млн женщин в мире болеют эндометриозом [1], при этом в последние годы наблюдается неуклонный рост его частоты. Важно отметить, что эндометриоз сопряжен с бесплодием в 50—80% случаев и хронической тазовой болью в 50% [1, 2], существенно ухудшающих психосоматическое состояние и качество жизни пациенток [3]. Сложности дифференциальной диагностики эндометриоза часто приводят к задержке установления диагноза на период от 4 до 11 лет, при этом 65% женщин устанавливают ошибочный диагноз [3, 4], что приводит к прогрессированию заболевания и тяжелым последствиям [5]. Современные фармакологические и хирургические подходы к лечению эндометриоза сопряжены с риском значительных побочных явлений и недостаточно эффективны, частота рецидивов остается высокой и достигает 15—21% [3].

Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ), характеризующийся разрастанием эктопической ткани эндометрия вне полости матки, классически рассматривается как хроническое эстрогензависимое иммунное воспалительное заболевание, локально ограниченное областью таза [6]. Однако в настоящее время НГЭ все чаще признается как воспалительное системное заболевание, нередко ассоциированное с гетерогенной полиорганной дисфункцией [3, 7]. Считается, что в патофизиологии синдрома системной воспалительной реакции при НГЭ существенную роль играет аберрантное продуцирование цитокинов, сопровождающееся дисрегуляцией иммунного ответа. При этом к наиболее значимым относятся провоспалительные интерлейкины (IL)-6, IL-8, фактор некроза опухоли альфа (TNF-α). Оценка цитокинового профиля крови у пациенток с НГЭ позволила обнаружить повышенные уровни IL-6, IL-8 и TNF-α [8—10]. Кроме этого, повышенный плазменный уровень IL-6 связан с выраженностью болевого синдрома [11], тяжестью заболевания [12] и частотой рецидивов [11] у пациенток с НГЭ. В то же время для плазменного уровня IL-8 выявлена ассоциация с размером и количеством активных поражений [13] и бесплодием [14], а для TNF-α — с выраженностью клинических проявлений, активностью и степенью распространенности НГЭ [15].

Современные исследования свидетельствуют о роли кишечной микробиоты в развитии и прогрессировании НГЭ. Это объясняется потенциальной иммунорегуляторной функцией микробиоты кишечника, играющей важную роль в системных воспалительных клеточных реакциях. Отмечается, что для НГЭ характерно изменение микробного ландшафта или дисбаланс представителей кишечной микробиоты, участвующих в образовании метаболитов с протективным эффектом по отношению к эпителию кишечника и репродуктивной системе, таких как короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК). Снижение уровня последних приводит к активации гистондеацетилазы и ингибированию G-белковых рецепторов GPR41, GPR43 и GPR109A, что влечет за собой развитие хронического воспаления [16]. Кроме того, следствием дисбиотического нарушения микробиоты кишечника является снижение барьерной функции кишечного эпителия, которое потенцирует транслокацию бактериальных продуктов. Ее отражением признано повышение уровня липополисахарида (ЛПС). В свою очередь ЛПС может взаимодействовать с Toll-подобными рецепторами 4-го типа с последующей активацией сигнальных каскадов, результатом которой является секреция воспалительных медиаторов [17].

Цель исследования — изучить изменения таксономического состава микробиоты кишечника и оценить на уровне родов характер их взаимосвязи с показателями IL-6, IL-8 и TNF-α в плазме крови у пациенток с НГЭ.

Материал и методы

Проведено одномоментное сравнительное исследование. Методом сплошной выборки в исследование включена основная группа (ОГ) — 50 пациенток с НГЭ I—IV степени распространенности в возрасте от 18 до 45 лет (средний — 37,0 (32,0—44,0) года), поступивших в гинекологическое отделение Клинического многопрофильного центра Святителя Луки ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» (Симферополь). Диагноз НГЭ верифицирован интраоперационно согласно критериям классификации Американского общества по репродуктивной медицине (ASRM).

Исследование одобрено Этическим комитетом Крымской медицинской академии им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» (протокол №10 от 16.02.22), спланировано и проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все лица, включенные в исследование, подписали добровольное информированное согласие.

Критериями невключения в ОГ были: возраст <18 или >45 лет; индекс массы тела (ИМТ) >24,9 кг/м²; беременность и период лактации; сахарный диабет 1-го и 2-го типов; коморбидные системные и тяжелые соматические заболевания; психические расстройства, алкоголизм или наркомания в анамнезе; диагностированные воспалительные и функциональные заболевания кишечника; прием гормональных, контрацептивных, противовоспалительных препаратов, антибиотиков, пробиотиков, пребиотиков, противовирусных, симбиотических или кислотоподавляющих препаратов в течение 3 мес до начала исследования; прием препаратов, влияющих на стул, в предшествующие исследованию 8 нед; отказ от участия в исследовании.

Контрольную группу (КГ) составили 50 относительно здоровых женщин (средний возраст 37,7 (32,7—43,2) года), проходивших ежегодный профилактический медицинский осмотр на базе медицинского центра ООО «Гемокод-Крым» (Симферополь). Критерии включения в КГ: возраст 18—45 лет; ИМТ <24,9 кг/м²; отсутствие хронических заболеваний и аллергических реакций; отсутствие инфекционных и острых заболеваний в течение 2 мес перед исследованием; отсутствие психических расстройств, алкоголизма или наркомании в анамнезе; отсутствие нарушений стула (запоры/диарея) в предшествующий исследованию месяц; не принимавшие контрацептивные средства, антибиотики, пробиотики, пребиотики, противовирусные и симбиотические препараты в течение 3 мес до начала исследования; не принимавшие препараты, влияющие на стул в течение 8 нед до начала исследования; подписавшие информированное добровольное согласие на участие в исследовании.

Для анализа таксономического состава микробиоты кишечника у пациенток в 1-й день госпитализации (в утренние часы: с 8.00 до 10.00) взяты образцы кала, которые замораживали и хранили в одноразовых пластиковых контейнерах при температуре –80 °C до проведения метагеномного анализа. Выделение тотальной ДНК осуществляли методом фенольной экстракции. Нуклеотидная последовательность выделенной ДНК установлена методом шотган-секвенирования с использованием высокопроизводительного секвенатора SOLiD5500 Wildfire («Applied Biosystems, Inc.», США). Фильтрация прочтений по качеству и их таксономическая классификация выполнены с использованием программного обеспечения QIIME версии 1.9.1. Для определения таксономической принадлежности прочтений применяли подход, включающий в себя применение двух таксономических баз данных. На первом этапе осуществляли подбор референсного набора операционных таксономических единиц (ОТЕ) бактерий на основании сравнения полученных прочтений генов 16S рРНК с базой данных GreenGenes версии 13.5. На втором этапе с использованием алгоритма RDP определение таксономической принадлежности данных ОТЕ проводили на основе специализированной базы данных кишечной микробиоты человека HITdb. Изучение качественного и количественного состава микробиоты кишечника осуществляли на основании определения родов и фил микроорганизмов. Оценку α-разнообразия сообщества выполняли путем расчета индекса Chao1, показателя количества обнаруженных таксонов (Sobs) и показателя, отражающего реальное количество таксонов (ACE), — с использованием программы Mothur v.1.22.0 (https://www.mothur.org).

Забор крови для определения показателей IL-6, IL-8 и TNF-α методом твердофазного иммуноферментного анализа выполняли из кубитальной вены в 1-й день госпитализации утром (7.00—9.00) натощак в состоянии покоя (не менее 15 мин). Оценку уровней IL-6, IL-8 и TNF-α в сыворотке крови проводили с использованием тест-системы (АО «Вектор-Бест», Россия). Пробирки с сывороткой крови хранили в замороженном состоянии при температуре –20 °C (7.00—9.00) в состоянии покоя.

Статистическая обработка проведена с помощью пакета прикладных программ Statistica 8.0 («StatSoft Inc.», США). Для количественных показателей определяли характер распределения с использованием метода Колмогорова—Смирнова. Ввиду того, что большинство количественных признаков не соответствовало нормальному распределению, вычисляли медиану (Me) и интерквартильный диапазон (25-й процентиль; 75-й процентиль). Для качественных признаков определяли долю и абсолютное количество значений. Для сравнения качественных признаков использовали критерий χ², количественных — критерий Манна—Уитни. Для оценки взаимосвязи между факторами проводили ранговый корреляционный анализ по Спирмену. Уровень значимости при сравнении качественных и количественных признаков, а также при проведении корреляционного анализа соответствует значениям p<0,05.

Результаты

Пациентки из ОГ и КГ были сопоставимы по возрасту — 37,0 (32,0; 44,0) и 37,7 (32,7; 43,2) года (p=0,880), ИМТ — 23,0 (21,0; 24,3) и 21,0 (20,1; 24,3) кг/м² (p=0,250) соответственно. НГЭ I—II степени распространенности диагностирован у 14 (28,0%) пациенток, III—IV степени — у 36 (70,0%).

При изучении таксономического состава микробиоты кишечника у пациенток ОГ по сравнению с женщинами КГ наблюдалось статистически значимое снижение α-разнообразия бактериального сообщества (индекс Chao1 p=0,014). Индексы ACE и Sobs у пациенток ОГ по сравнению с женщинами КГ также были несколько снижены, однако статистически значимых различий не было (p=0,053; p=0,051 соответственно) (рис. 1).

Рис. 1. Сравнительный анализ филогенетического состава микробиоты кишечника у пациенток с наружным генитальным эндометриозом и здоровых женщин.

НГЭ — группа пациенток с наружным генитальным эндометриозом; КГ — контрольная группа.

При сравнении родового состава кишечной микробиоты в группах обследованных установлено, что у пациенток ОГ по сравнению с женщинами КГ регистрировалось статистически значимое снижение численности Eubacterium (p=0,040), Coprococcus (p=0,009), Ruminococcus (p<0,001), Turicibacter (p=0,008), Bacterioides (p=0,001), Prevotella (p=0,008) и повышение численности Shigella (p<0,001) (рис. 2).

Рис. 2. Сравнительный анализ родового состава микробиоты кишечника у пациенток с наружным генитальным эндометриозом и здоровых женщин.

НГЭ — группа пациенток с наружным генитальным эндометриозом; КГ — контрольная группа; * — статистическая значимость различий (p<0,05) между показателями групп пациенток с наружным генитальным эндометриозом и здоровых женщин, ** — p <0,01, *** — p <0,001

Уровни IL-6, IL-8 и TNF-α в плазме крови пациенток ОГ были статистически значимо выше по сравнению с показателями у женщин КГ: 14,7 (8,1; 18,3) и 3,8 (2,0; 6,6) пг/мл; 14,59 (9,57; 28,8) и 2,2 (1,4; 6,8) пг/мл; 17,9 (9,3; 26,5) и 5,2 (2,8; 7,6) пг/мл соответственно.

В ходе корреляционного анализа выявлено, что более высокая численность бактерий рода Shigella ассоциирована с более высоким показателем IL-8 (r=0,51; p=0,033), в то время как более низкая численность бактерий рода Ruminococcus и Prevotella сопряжена с более высоким показателем TNF-α (r= –0,54; p=0,001, r= –0,49; p=0,022 соответственно).

Обсуждение

В настоящем исследовании уточнены изменения таксономического состава микробиоты кишечника и впервые изучена на уровне родов их связь с уровнями IL-6, IL-8 и TNF-α в плазме крови у пациенток с НГЭ.

В настоящее время накоплено достаточно данных, доказывающих существование прямой связи между дисбиотическими изменениями кишечной микробиоты и развитием и прогрессированием НГЭ. Однако преимущественное количество исследований проведено на животных моделях, а имеющиеся клинические работы носят единичный и противоречивый характер. Например, в клиническом исследовании A. Svensson и соавт. [18] показано, что микробиота кишечника пациенток с НГЭ, по сравнению с микробиотой здоровых женщин, характеризовалась снижением богатства (α-разнообразие) и индивидуального β-разнообразия, в работе S. Chen и соавт. — только более низким микробным α-разнообразием [19]. Наши результаты также свидетельствуют о наличии более низкого бактериального α-разнообразия микробиоты кишечника у пациенток с НГЭ, что подтверждается статистически более низким индексом Chao1 и является общей отличительной чертой хронических воспалительных заболеваний [20]. Кроме того, у пациенток с НГЭ дисбиотические изменения кишечника характеризовались снижением численности бактерий с иммуномодулирующим потенциалом — представителей родов Eubacterium, Coprococcus, Ruminococcus, которые, как известно, являются продуцентами КЦЖК, т.е. ключевых продуктов жизнедеятельности для поддержания метаболического и иммунологического гомеостаза хозяина. Кроме того, у пациенток с НГЭ наблюдалось снижение представленности пробиотических бактерий рода Bacterioides, принадлежащих к семейству Bacteroidaceae, и рода Turicibacter, принадлежащих к семейству Turicibacteraceae. В некоторых исследованиях указывалось на иммуномодулирующие свойства последнего [21]. Однако имеются данные и о предполагаемой роли Turicibacter в развитии воспалительных заболеваний кишечника [22], что свидетельствует об отсутствии единого мнения относительно роли этого рода в организме человека. Полученные нами результаты частично согласуются с данными A. Svensson и соавт. [18]: снижение численности Paraprevotella, Lachnospira и повышение — Bacterioides, Coprococcus, Parabacteroides и Oscillospira характерно для пациенток с НГЭ. Контрастирование полученных данных может быть обусловлено тем фактом, что, во-первых, исследования выполнялись в различных географических регионах, а во-вторых, в отличие от указанных выше авторов мы не включали в настоящее исследование пациенток, принимающих гормональные, контрацептивные и противовоспалительные препараты, с целью нивелирования их влияния на результаты исследования. Мы также отметили снижение численности бактерий рода Prevotella, принадлежащего к семейству Prevotellaceae и ассоциирующегося с развитием ряда хронических воспалительных заболеваний [23]. Подобное снижение представленности Prevotella также обнаружено в микробиоте кишечника пациентов с хроническими заболеваниями почек, колоректальным раком и болезнью Паркинсона. Вместе с тем нами обнаружена у пациенток с НГЭ повышенная численность бактерий рода Shigella семейства Enterobacteriaceae, ассоциированных с кишечными инфекциями. Полученные нами результаты не противоречат данным, приведенным B. Ata и соавт. [24].

Роль микробиоты кишечника в формировании и модуляции системных иммунных реакций хорошо известна. Дисбиоз кишечника, который все чаще признается в качестве одного из факторов риска развития воспаления, а также аутоиммунных и иммуноопосредованных заболеваний, может запускать формирование иммунологического и воспалительного ответа с ростом уровня системных провоспалительных цитокинов [25]. Как указывалось ранее, у пациенток с НГЭ обнаруживаются значительно повышенные уровни IL-6, IL-8 и TNF-α, роль которых в развитии и прогрессировании тяжести заболевания доказана [8—10]. Результаты нашего исследования не расходятся с данными литературы. Так, у пациенток с НГЭ по сравнению со здоровыми женщинами установлены статистически значимые различия в уровнях IL-6, IL-8 и TNF-α. Примечательно, что некоторые виды микробиоты кишечника у пациенток с НГЭ ассоциированы с уровнями IL-8 и TNF-α в плазме крови. Предположения о сущности полученных взаимосвязей могут быть выстроены на более детальном анализе научных сведений о видах бактерий, которые, согласно результатам настоящего исследования, сопряжены с уровнями указанных выше цитокинов. Прямой характер ассоциации с уровнем IL-8 в плазме крови продемонстрирован для рода Shigella. В качестве факторов патогенности Shigella выделяют фимбрии и жгутики, формирование капсулы, ЛПС, специфические антигены [26], которые оказывают неблагоприятное воздействие на выраженность локальных и системных воспалительных реакций [27]. Высказано предположение о роли данного рода в качестве триггера инициации иммунологических изменений, вызывающих эндометриоз [28]. Кроме этого, исследования in vitro показали, что Shigella способствуют прогрессированию эндометриоза [29]. Установленная нами ассоциация позволяет предположить, что наличие этого патогенного вида может быть потенциально неблагоприятно сопряжено с НГЭ. Аналогичный прямой характер корреляции уровня IL-8 с численностью Shigella flexneri продемонстрирован в исследовании R. Raqib и соавт. [30] у взрослых лиц с подтвержденной инфекцией Shigella flexneri. Таким образом, подтверждены приведенные выше данные о неблагоприятном воздействии представленности рода на уровень IL-8 в сыворотке крови [24], которое может быть опосредовано повышением проницаемости кишечника и развитием синдрома системной воспалительной реакции.

Известно, что снижение представленности Prevotellaceae может привести к развитию системного воспаления посредством повышения уровня ЛПС плазмы [31]. При этом отмечено, что ЛПС способствует развитию и прогрессированию эндометриоза [32]. Кроме того, снижение представленности бактерий этого рода сопряжено с ингибированием выработки КЦЖК, особенно бутирата, который является важным энергетическим субстратом эпителиальных клеток кишечника и поддерживает целостность эпителиального барьера, что редуцирует воспалительную реакцию, обусловленную бактериями и их метаболитами [33]. Таким образом, снижение представленности Prevotellaceae приводит к снижению индуцируемых регуляторных T-клеток (iTregs) и активации провоспалительных молекул [34]. Отрицательная корреляция между сниженной представленностью Prevotella и уровнем TNF-α в сыворотке крови, обнаруженная в нашем исследовании, является дополнительным доказательством этой ассоциации. Подобный обратный характер ассоциации с TNF-α продемонстрирован для рода Ruminococcus. Представители семейства Rumonococcaceae и рода Ruminococcus принадлежат к основным продуцентам бутирата, который выступает в качестве мощного регулятора иммунной системы, вызывая антипролиферативный и противовоспалительный эффекты, включая воздействие на миграцию иммунокомпетентных клеток, экспрессию адгезивных и цитокиновых молекул [35]. Есть данные, что микробиота кишечника мышей с эндометриозом характеризуется сниженным содержанием бутирата, ассоциированной с низкой представленностью Ruminococcus [36] и прогрессированием НГЭ [37]. В свою очередь введение бутирата снижало активность гистондеацетилазы, участвующей в индукции воспаления, опосредованного TNF-α [38], необходимого для роста эндометриотических клеток, и способствовало ингибированию роста очагов эндометриоза в исследованиях in vitro и in vivo [37]. Повышенная экспрессия гистондеацетилазы ранее наблюдалась у пациенток с НГЭ [39]. Эти данные могут быть полезны в понимании возможного механизма ассоциации между представленностью Ruminococcus и плазменным уровнем TNF-α, установленной в нашей работе.

Заключение

Представленные результаты показывают, что для пациенток с НГЭ характерны выраженные нарушения численности и таксономического состава микробиоты кишечника: снижение микробного α-разнообразия, значительное снижение численности Eubacterium, Coprococcus, Ruminococcus, Turicibacter Bacterioides, Prevotella и повышение численности Shigella. Обнаруженные статистически значимые корреляции численности родов Shigella, Ruminococcus и Prevotella с уровнями IL-8 и TNF-α в плазме крови позволяют предположить связь между микробиотой кишечника и патогенетическими механизмами развития и прогрессирования НГЭ. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения роли микробиоты кишечника в патогенезе данного заболевания.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Гуменюк Л.Н., Доброхотова Ю.Э.

Сбор и обработка материала — Чотчаев Р.М., Заурова М.Б., Энзель Д.А.

Статистический анализ данных — Чотчаев Р.М., Заурова М.Б., Энзель Д.А.

Написание текста — Пучкина Г.А.

Редактирование — Гуменюк Л.Н., Доброхотова Ю.Э.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.