Введение
Преэклампсия (ПЭ) — тяжелое осложнение беременности, которое является одной из основных причин заболеваемости и смертности матери и плода [1]. Согласно наиболее признанной гипотезе, причиной ПЭ является нарушение процессов формирования плаценты в самые ранние сроки гестации [2]. Нарушение ремоделирования спиральных артерий ведет к снижению перфузии, развитию гипоксии в тканях, усилению свободнорадикального окисления и, как следствие, к развитию эндотелиальной дисфункции [3]. В результате аномальной плацентации и нарушения перфузии в плаценте при ПЭ высвобождаются факторы, вызывающие распространенную эндотелиальную дисфункцию, синдром системного воспалительного ответа, приводящие к полиорганной недостаточности [4] и к системному окислительному стрессу [5]. Установлено, что у детей, родившихся у женщин с ПЭ в период беременности, развивается эндотелиальная дисфункция, которая может привести к развитию патологии периода новорожденности, а в дальнейшем к риску развития сердечно-сосудистых заболеваний [6, 7]. Снижение функциональных возможностей эндотелиальных клеток плода при ПЭ, происходящее вследствие дисфункциональных нарушений в плаценте, негативно влияет на эндотелий плода [8].
Пренатальный онтогенез плода зависит от целого ряда факторов, одним из которых является состояние пупочного канатика. Известно, что короткая или длинная пуповина, истинные узлы и аномальное прикрепление в перинатальном периоде неблагоприятно воздействуют на плод. Многообразие аномалий пупочного канатика и их влияние на состояние плода широко представлены в современной литературе [9], однако особенности таковых на фоне различной акушерской патологии недостаточно освещены, что означает необходимость дальнейшего изучения данного вопроса [10, 11].
Известно, что плацентарная ишемия способна нарушать функцию митохондрий и выработку энергии трофобластом, что может привести к высвобождению активных форм кислорода и развитию реакции свободнорадикального (перекисного) окисления липидов [12]. Обладая высокой токсичностью и реактивностью, продукты перекисного окисления липидов повреждают эндотелий сосудов, разрушая его мембраны, что приводит к нарушению нормального метаболизма на клеточном и органном уровнях [13—16].
Изменения морфофункциональных характеристик структурных компонентов пуповины и процессов свободнорадикального окисления липидов, антиоксидантной защиты клеток сосудов пуповины освещены недостаточно полно, а исследования таких маркеров, как циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), ангиогенин, эндотелиальная синтаза оксида азота (eNOS) в клетках эндотелия сосудов пуповины при различных формах ПЭ и без нее, практически отсутствуют.
Цель исследования — определить морфологические, иммуногистохимические и биохимические особенности эндотелия пупочного канатика при беременности, осложненной ПЭ.
Материал и методы
Исследовано 60 пуповин последов родильниц с ПЭ, составивших основную группу, в том числе 35 пуповин родильниц с умеренной ПЭ (1-я подгруппа) и 25 пуповин родильниц с тяжелой ПЭ (2-я подгруппа). Контрольную группу составили 30 пуповин родильниц без признаков ПЭ. Все дети родились живыми. В основной группе у 30 новорожденных гестационный возраст составил 32—35 нед и у 30 новорожденных — 38—41 нед. Среди детей контрольной группы, родившихся у женщин без признаков ПЭ в период беременности, 15 детей родились в сроке гестации 32—35 нед и 15 новорожденных — в сроке гестации 37—39 нед.
Критерии включения в исследование: женщины с впервые выявленной артериальной гипертензией после 20-й недели беременности в сочетании с протеинурией. Контрольная группа — женщины без признаков гипертензивных расстройств и с неосложненным течением беременности на момент обследования.
Критерии невключения в исследование: наличие у женщин острых и обострение хронических воспалительных заболеваний, аллергические реакции на момент обследования, злокачественные новообразования различной локализации, системные заболевания соединительной ткани, хроническая почечная недостаточность.
Исследование проведено на базе ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздрава России. Пациентки, поступившие в акушерскую клинику института, подписывали информированное добровольное согласие на обследование, включающее взятие крови у новорожденных, в соответствии с протоколом №5 от 10.02.18.
Комплексное морфологическое исследование фрагментов пупочного канатика включало обзорное гистологическое исследование с окраской парафиновых срезов толщиной 4 мкм гематоксилином и эозином, морфометрию сосудов с использованием системы анализа изображений «ВидеоТест-МастерМорфология-4», позволяющей определять площадь эндотелиоцитов (мкм2) и толщину (мкм) артериальных и венозного сосудов. Иммуногистохимическое исследование проводили стандартным иммунопероксидазным методом с использованием первичных мышиных моноклональных антител к фактору роста эндотелия сосудов (VEGF) и аннексину V типа (Santa Cruz) в рабочем разведении 1:200. Визуализацию комплексов «антиген — антитело» осуществляли с помощью системы детекции Dako REAL EnVision Detection System (Dako, Германия).
Выделение эндотелиальных клеток из вены пуповины проводили методом J.C. Gerlach и соавт. [17]. Для подсчета клеток использовали камеру Горяева. Полученную суспензию клеток разделяли на аликвоты, которые в необходимом объеме содержали 500 клеток. Лизат клеток получали путем замораживания суспензии клеток при температуре –20°C. В лизатах эндотелиальных клеток проводили определение содержания цГМФ набором реактивов фирмы Enzo (Швеция); содержание эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) и ангиогенина определяли с применением набора реактивов фирмы RayBiotech (США) иммуноферментным методом. Исследование показателей окислительного стресса — концентрации свободных радикалов, активных форм кислорода и антиоксидантной активности осуществляли методом железоиндуцированной хемилюминесценции на биохемилюминометре БХЛ-07 (Россия).
Математическую обработку полученных данных выполняли с помощью программы Statistica v. 10.0 (StatSoft Inc., США). Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения, медианы (Me) и квартилей Q1 и Q3 (Me [Q1; Q3]). Использовали критерии Манна—Уитни и Колмогорова—Смирнова для определения статистической значимости в случае независимых выборок и критерий Уилкоксона при парных сравнениях. Все результаты статистической обработки считали статистически значимыми при p<0,05 (95% уровень статистической значимости).
Результаты и обсуждение
В пуповинах, взятых из последов от родильниц с умеренной и тяжелой ПЭ, выявлены такие изменения, как периваскулярный и субамниальный отек Вартонова студня, межмышечный отек циркулярного гладкомышечного слоя и спазм артерий (рис. 1), который при длительном существовании может обусловливать реканализацию сосудов (рис. 2). Дилатация вены сопровождалась гидропической дистрофией эндотелиоцитов с нарушением их полярности и слущиванием в просвет сосуда (рис. 3). В 45 (75%) наблюдениях выявлен сосудисто-стромальный фуникулит (рис. 4). Морфометрия сосудов пуповин последов разных сроков гестации при беременности, осложненной умеренной и тяжелой ПЭ, позволила установить статистически значимое уменьшение толщины венозной стенки (p=0,03) и площади венозных эндотелиоцитов (p=0,04) по сравнению с контролем.
Рис. 1. Гистологический препарат пуповины новорожденного женщины с умеренной преэклампсией в период беременности: спазм артерии (↑), отек Вартонова студня (↑↑).
Окраска гематоксилином и эозином, ×10.
Рис. 2. Гистологический препарат пуповины новорожденного женщины с умеренной преэклампсией в период беременности: отек и реканализация (↑) стенки артерии.
Окраска гематоксилином и эозином, ×10.
Рис. 3. Гистологический препарат пуповины новорожденного женщины с тяжелой преэклампсией в период беременности: нарушение полярности (↑) и слущивание эндотелия (↑↑) в просвет вены.
Окраска гематоксилином и эозином, ×40.
Рис. 4. Гистологический препарат пуповины новорожденного женщины с тяжелой преэклампсией в период беременности: фуникулит.
Окраска гематоксилином и эозином, ×40.
Результаты иммуногистохимического исследования показателей в сосудах пуповин представлены в табл. 1. Согласно полученным данным, при доношенной беременности без ПЭ аннексин V типа экспрессируется в основном в цитоплазме венозного эндотелия. При недоношенной беременности его экспрессия указанной локализации статистически значимо (p=0,041) понижается. Беременность, осложненная умеренной ПЭ, сопровождается увеличением экспрессии аннексина V типа в случае срочных (p=0,023) и преждевременных (p=0,003) родов, что следует расценивать как адаптивно-компенсаторную реакцию, направленную на пролонгирование беременности и поддержание жизнедеятельности плода. Тяжелая ПЭ характеризуется истощением экспрессии аннексина V типа как при доношенной (p=0,043), так и при недоношенной (p=0,023) беременности.
Таблица 1. Значения индексов экспрессии аннексина V типа и VEGF в сосудах пуповины при беременности у женщин с преэклампсией и без преэклампсии с разными сроками гестации
| Показатель | Пуповины новорожденных у женщин без ПЭ в период беременности (контрольная группа, n=30) | Пуповины новорожденных у женщин с умеренной ПЭ в период беременности (1-я подгруппа, n=35) | Пуповины новорожденных у женщин с тяжелой ПЭ в период беременности (2-я подгруппа, n=25) |
| Аннексин V типа, усл. ед., при доношенной беременности | 0,23 [0,21; 0,25] | 0,6 [0,55; 0,66] | 0,08 [0,05; 0,1] |
| р1 | — | 0,023 | — |
| р2 | — | — | 0,043 |
| Аннексин V типа, усл. ед., при недоношенной беременности | 0,04 [0,03; 0,06] | 0,41 [0,38; 0,43] | 0,014 [0,013; 0,016] |
| р1 | — | 0,003 | — |
| р2 | — | — | 0,023 |
| р3 | 0,041 | — | — |
| VEGF, усл. ед., при доношенной беременности | 0,14 [0,1; 0,21] | 0,15 [0,11; 0,18] | 0,59 [0,55; 0,62] |
| р2 | — | — | 0,041 |
| VEGF, усл. ед., при недоношенной беременности | 0,61 [0,52; 0,68] | 0,18 [0,13; 0,21] | 0,16 [0,11; 0,18] |
| р1 | — | 0,041 | — |
| р2 | — | — | 0,023 |
| р3 | 0,041 | — | — |
Примечание. ПЭ — преэклампсия; VEGF — фактор роста эндотелия сосудов. p1 — статистическая значимость различий между показателями 1-й подгруппы и контрольной группы; p2 — статистическая значимость различий между показателями 2-й подгруппы и контрольной группы; p3 — статистическая значимость различий при доношенной и недоношенной беременности. Значения оценены с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни, данные представлены в виде медианы (Me) и квартилей Q1 и Q3 в формате Me (Q1; Q3).
На основании иммуногистохимической идентификации VEGF в сосудах пуповины установлено, что доношенная беременность при умеренной ПЭ по уровню экспрессии биомаркера в эндотелиоцитах не отличается от аналогичной беременности без ПЭ (контрольная группа), а беременность, осложненная тяжелой ПЭ, сопровождается статистически значимым (p=0,041) повышением экспрессии биомаркера, что, вероятно, является одним из эффективных компенсаторных механизмов, направленных на пролонгирование беременности. Недоношенная беременность, осложненная умеренной либо тяжелой ПЭ, характеризуется статистически значимым (p<0,05) понижением уровня экспрессии VEGF в эндотелии артерий и вены пупочного канатика, что свидетельствует об эндотелиальной дисфункции.
Для оценки показателей окислительного стресса и антиоксидантной активности в лизате клеток пуповины использовали параметры хемилюминесценции: показатели Imax (значение максимальной интенсивности свечения за время опыта) и S (площадь под кривой интенсивности), или показатель полной светосуммы (мВ×с), дающие представление о потенциальной способности биологического объекта к свободнорадикальному окислению липидов. Показатели антиоксидантного потенциала: Z — нормированная светосумма (с); a — относительная светосумма; tgα — тангенс угла максимального наклона кривой к оси времени (мВ/с); установлено, что снижение величин a и Z и повышение tgα свидетельствует о повышении антиоксидантной активности. Все параметры рассчитываются автоматически прибором и наиболее информативны для оценки хемилюминесценции. Интенсивность хемилюминесценции стандартизировали на число эндотелиальных клеток, для этого в кювету биохемилюминометра помещали объем лизата, который, предположительно, содержит 500 клеток, в этой связи проводили определение содержания десквамированных эндотелиоцитов, выделенных из вены пуповины.
Данные исследования количества десквамированных эндотелиоцитов и показателей хемилюминесценции в лизате эндотелиальных клеток пуповин новорожденных, родившихся у матерей с ПЭ и без ПЭ, представлены в табл. 2. В ходе исследования выявлено увеличение количества десквамированных эндотелиоцитов в лизате у новорожденных, родившихся у женщин с умеренной и тяжелой ПЭ в период беременности, по сравнению с контролем, что указывает на повреждение эндотелия пуповины. Относительные величины медиан интенсивности свечения (Imax) как в пуповинах основной группы, так и в пуповинах подгрупп, разделенных по степени тяжести ПЭ, возрастали по сравнению с таковыми в пуповинах новорожденных, матери которых не имели ПЭ в период беременности. Изменения относительных величин медиан угла спада кинетической кривой (tgα) в пуповинах новорожденных, родившихся у женщин с ПЭ в период беременности, основной группы и подгрупп, также статистически значимо выше. Таким образом, выявлено, что в ответ на развитие окислительного стресса в клетках эндотелия пуповины повышается антиоксидантная активность. Ранее проведенные исследования хемилюминограмм с использованием модельной системы фосфат-цитрат-люминол лизата клеток сосудов пуповины у новорожденных подтвердили это заключение [18].
Таблица 2. Количество десквамированных эндотелиоцитов и показатели хемилюминесценции в лизате эндотелиальных клеток пуповины новорожденных, родившихся у женщин с преэклампсией и без преэклампсии в период беременности
| Показатель | Пуповины новорожденных у женщин без ПЭ в период беременности (контрольная группа, n=30) | Пуповины новорожденных у женщин с ПЭ в период беременности (основная группа) | ||
| всего (основная группа, n=60) | пуповины новорожденных у женщин с умеренной ПЭ в период беременности (1-я подгруппа, n=35) | пуповины новорожденных у женщин с тяжелой ПЭ в период беременности (2-я подгруппа, n=25) | ||
| Эндотелиоциты, количество клеток/мкл | 10 [7; 12] | 23 [19,5; 9] | 20 [17; 26] | 29 [26; 30] |
| p | — | 0,001 | 0,001 | 0,003 |
| Imax, мВ | 50 [38; 63] | 75 [47; 91] | 70 [52; 91] | 77 [46; 85] |
| p | — | 0,027 | 0,049 | 0,030 |
| S, мВ×с | 389 [292; 585] | 512 [408; 645] | 512 [411; 645] | 562 [408; 617] |
| a | 0,242 [0,201; 0,325] | 0,261 [0,245; 0,281] | 0,256 [0,245; 0,263] | 0,268 [0,259; 0,296] |
| Z, с | 7,65 [6,09; 9,71] | 7,81 [7,32; 8,23] | 7,37 [7,33; 7,89] | 7,91 [7,73; 8,231] |
| tgα, мВ/с | 13,4 [11,3; 16,5] | 18 [13,5; 24] | 18 [15; 21,8] | 19,9 [13,5; 25,5] |
| p | — | 0,021 | 0,021 | 0,019 |
Примечание. ПЭ — преэклампсия; p — статистическая значимость различий по сравнению с показателями контрольной группы. Значения оценены с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни, данные представлены в виде медианы (Me) и квартилей Q1 и Q3 в формате Me (Q1; Q3).
Для оценки функциональной активности эндотелиальных клеток сосудов пуповины проводили определение в лизате эндотелиальных клеток, выделенных из вены пуповины, уровней цГМФ, eNOS и ангиогенина. Данные исследований представлены в табл. 3. Выявлено, что содержание цГМФ в лизате статистически значимо, в 1,5 раза, выше в пуповинах новорожденных у женщин основной группы и 2-й подгруппы по сравнению с контрольной группой (p=0,049 и p=0,046 соответственно). Отмечено повышение уровня цГМФ в 1,4 раза при тяжелой ПЭ по сравнению с пуповинами новорожденных у женщин с умеренной ПЭ в период беременности (p=0,021). Содержание eNOS в пуповинах основной и контрольной групп было сходным и статистически значимо не различалось. Уровень ангиогенина статистически значимо выше в пуповинах основной группы, 1-й и 2-й подгрупп по сравнению с таковым контрольной группы (p=0,001).
Таблица 3. Показатели содержания биомаркеров в лизате эндотелиальных клеток пуповины новорожденных, родившихся у женщин с преэклампсией и без преэклампсии в период беременности
| Показатель | Пуповины новорожденных у женщин без ПЭ в период беременности (контрольная группа, n=30) | Пуповины новорожденных у женщин с ПЭ в период беременности (основная группа) | ||
| всего (основная группа, n=60) | пуповины новорожденных у женщин с умеренной ПЭ в период беременности (1-я подгруппа, n=35) | пуповины новорожденных у женщин с тяжелой ПЭ в период беременности (2-я подгруппа, n=25) | ||
| цГМФ, пмоль/мл | 4,12 [3,59; 5,12 ] | 6,08 [4,57; 8,55] | 4,54 [3,07; 6,86] | 6,58 [5,55; 9,25] |
| p1 | — | 0,049 | — | 0,046 |
| p2 | — | — | — | 0,021 |
| eNOS, нг/мл | 0,43 [0,39; 0,55] | 0,52 [0,42; 0,61] | 0,46 [0,41; 0,61] | 0,52 [0,42; 0,62] |
| p1 | — | — | — | — |
| Ангиогенин, пг/мл | 4,46 [ 2,26; 11,23] | 21,1 [2,96; 50,1] | 20,2 [2,96; 48,39] | 22,5 [3,34; 52,7] |
| p1 | — | 0,001 | 0,001 | 0,001 |
Примечание. цГМФ — циклический гуанозинмонофосфат; eNOS — эндотелиальная синтаза оксида азота. p1 — статистическая значимость различий по сравнению с показателями контрольной группы; p2 — статистическая значимость различий между показателями 1-й и 2-й подгрупп. Значения оценены с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни, данные представлены в виде медианы (Me) и квартилей Q1 и Q3 в формате Me (Q1; Q3).
Известно, что цГМФ является вторичным посредником, который необходим для широкого спектра регуляторных процессов на клеточном и субклеточном уровнях. Функция цГМФ сопряжена с гуанилатциклазой, активность которой регулируется оксидом азота (NO). Эндотелиальный NO синтезируется из L-аргинина в присутствии eNOS, а также кислорода. NO, в свою очередь, стимулирует растворимую гуанилатциклазу, что приводит к повышению в клетке уровня цГМФ. В настоящее время показано, что цГМФ опосредует эффекты широкого спектра гормонов, натрийуретических пептидов, газообразных посредников — NO и монооксида углерода (СО), Са2+, лекарственных средств и токсинов в различных типах клеток, оказывая влияние на активность ряда внутриклеточных белков, транспорт ионов в клетке, цитоскелет и процессы экзоцитоза и эндоцитоза. цГМФ в кровеносных сосудах расслабляет гладкомышечные клетки сосудистой стенки, что приводит к вазодилатации и увеличению кровотока [19, 20].
Ангиогенин является одним из ключевых факторов ангиогенеза. Он участвует в большинстве стадий процесса ангиогенеза, в том числе связывается с эндотелиальными клетками, стимулирует образование вторичных посредников и активирует клеточно ассоциированные протеазы. Выявлена взаимосвязь между эффектом ангиогенина как основного ангиогенного фактора и высвобождением внеклеточного NO. Отмечено, что ангиогенин увеличивает уровни NO, тем самым запуская активность синтазы оксида азота [21].
По данным нашего исследования, в пуповинах новорожденных, родившихся у женщин с ПЭ в период беременности, на фоне окислительного стресса отмечается повышение содержания цГМФ и ангиогенина в лизате эндотелиальных клеток, что свидетельствует о повышении функциональной активности сосудистого эндотелия пуповины, которое можно расценить как компенсаторно-приспособительную реакцию, направленную на жизнеобеспечение плода и новорожденного.
Заключение
Патоморфологические изменения пупочного канатика у новорожденных, родившихся у женщин с преэклампсией в период беременности, характеризуются отеком стромы, спазмом артерий и дилатацией вены в сочетании с истончением стенки последней и очаговой десквамацией атрофически измененных венозных эндотелиоцитов.
На основании иммуногистохимического исследования сосудов пуповины установлено, что беременность без преэклампсии характеризуется умеренной экспрессией VEGF и аннексина V типа в эндотелии сосудов. Беременность, осложненная преэклампсией, отличается эндотелиальной дисфункцией, в основе которой лежит дисбаланс экспрессии аннексина V типа и VEGF, который более выражен при тяжелой преэклампсии и может являться риском преждевременных родов.
Установлено, что в сосудах пуповины новорожденных, родившихся у женщин с преэклампсией в период беременности, на фоне развития окислительного стресса отмечено повышение уровня цГМФ и регулятора ангиогенеза — ангиогенина, что отражает изменение функционального состояния клеток эндотелия пуповины и является компенсаторно-приспособительной реакцией в этих условиях.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Попова И.Г., Назаров С.Б.
Сбор и обработка материала — Попова И.Г., Проценко Е.В., Ситникова О.Г.
Статистический анализ данных — Попова И.Г., Проценко Е.В., Ситникова О.Г.
Написание текста — Попова И.Г., Проценко Е.В.
Редактирование — Харламова Н.В., Кузьменко Г.Н.
Финансирование. Исследование поддержано грантом Российского фонда фундаментальных исследований №18-415-370002.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.