Динамика цитокинового профиля у беременных с аденомиозом

Физиологическое развитие беременности предполагает скоординированную во времени имплантацию эмбриона, адекватную инвазию трофобластами рецептивного и децидуально-трансформированного эндометрия, своевременное формирование экстраэмбриональных структур и ремоделирование спиральных артерий матки. Невыполнение любого из этих шагов может привести к ряду осложнений беременности, включая самопроизвольный выкидыш, преждевременные роды, плацентарную недостаточность, задержку роста плода, преэклампсию, аномалии прикрепления плаценты. В этих процессах ключевую роль играет изменение баланса Th1/Th2 в сторону преобладающей Th2 активности, приводящей к блокаде антифетальной реактивности, опосредованной материнскими клетками с привлечением цитокинов противовоспалительного пула. При этом ранние стадии имплантации, ремоделирования эндометрия и начальная инвазия трофобласта характеризуются временным всплеском провоспалительной реакции с привлечением децидуальных макрофагов экспрессирующих цитокины: интерлейкины (IL) IL-1, IL-6, TNF-β [1].

Представляется возможным предположить, что естественное провоспалительное усиление цитокинового баланса может стать гиперизбыточным на фоне исходно измененного. Одним из таких иммунозависимых заболеваний, часто встречающимся у женщин репродуктивного возраста, является аденомиоз. Данная нозология характеризуется как аберрантное смещение эутопических желез эндометрия и стромы матки, глубоко и бессистемно вовлеченных в миометрий, с активизацией ряда иммунных ответов, особенно на местном уровне, в эндометрии [2]. Оценка исходного цитокинового баланса и его динамики в течение беременности у пациенток с аденомиозом может стать основой для новых терапевтических подходов в предупреждении репродуктивных потерь.

Цель исследования — оценить особенности цитокинового баланса на локальном уровне применительно к течению беременности у пациенток с аденомиозом.

Проведено проспективное когортное исследование в ходе, которого на клинических базах кафедры акушерства, гинекологии и перинатологии ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России (Краснодар) в период с 2018 по 2021 г. на прегравидарном этапе и в течение беременности обследовано 120 пациенток репродуктивного возраста с аденомиозом. Все аспекты исследования, включая набор пациентов и получение информированного добровольного согласия, выполнены в соответствии с Хельсинкской декларацией. Диагноз аденомиоз установлен по данным ультразвукового исследования, включающего визуализацию «переходной зоны». В спорных случаях, при аденомиозе 1-й степени, применяли способ ранней неинвазивной диагностики аденомиоза [3], включающий ультразвуковую визуализацию «переходной зоны», определение индекса резистентности маточных артерий (IRma) до и после функциональной нагрузочной пробы и исследование содержания фактора роста эндотелия сосудов А (VEGF-A) в аспирате цервикальной слизи (ЦС). При наличии сочетанного выявления толщины «переходной зоны» более 5 мм, коэффициента функциональной пробы (КФП) более 1,2 усл. ед. и уровня VEGF-A более 70 пг/мл верифицировали наличие аденомиоза 1-й степени.

Прегравидарное обследование проведено согласно рекомендациям, изложенным в протоколе «Прегравидарная подготовка. Клинический протокол Междисциплинарной ассоциации специалистов репродуктивной медицины (МАРС). Версия 2.0»¹. Из исследования исключены пациентки, имеющие патологию шейки матки, экстрагенитальную патологию, ассоциированную с гипертензивными расстройствами, и генетические маркеры наследственных тромбофилий высокого риска.

На момент исследования при микроскопическом, микробиологическом исследовании и исследовании методом полимеразной цепной реакции у пациенток во влагалищном секрете и секрете цервикального канала не выявлено наличие хламидийной инфекции, герпеса I, II типов, цитомегаловируса, микоплазменной инфекции, трихомонад, получен отрицательный результат бактериологического исследования (посев на условно-патогенную и патогенную микрофлору).

Ведение беременности осуществлялось в соответствии с приказом Минздрава России от 20.10.20 №1130н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология»², при возникновении осложнений руководствовались клиническими протоколами. Оценка цитокинового профиля ЦС осуществлялась на этапе прегравидарного обследования в лютеиновой фазе менструального цикла и в сроке 5—6 недель, в 13—14 недель и 30—34 недели беременности. Прегравидарная подготовка пациенткам не проведена по ряду не зависящих от исследователей причин.

Для оценки локального цитокинового статуса (децидуально-измененный эндометрий, плацента, плодные оболочки) использовали определение уровня цитокинов в ЦС. Данное исследование неинвазивное и может свидетельствовать об изменении концентраций цитокинов в зоне продуцирующих их клеток, так как имеются доказательства о наличии прямой умеренной корреляционной связи между концентрацией биологических маркеров в ЦС и интенсивностью их экспрессии на локальном уровне [4]. Исследовали концентрацию IL-2, IL-6, IL-10, а также уровень антимикробного пептида кателицидина LL-37. Рассчитывали провоспалительный индекс цервикальной слизи (ПВИ) как отношение IL-6/IL-10 усл. ед. В периферической крови определяли содержание плацентарного фактора роста (PLGF). Концентрацию цитокинов в ЦС определяли методом иммуноферментного анализа («ASCENT», Финляндия) и использованием панели моноклональных антител (ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ», Россия). Уровень кателицидина LL-37 определяли с помощью набора реактивов фирмы «Hycult Biotech human LL-37 ELISA» (Нидерланды). Концентрацию PLGF (пг/мл) определяли методом электро-хемилюминесцентного иммуноанализа (ECLIA).

Анализ полученных результатов осуществляли в программе Statistica версия 10.0, («StatSoft, Inc.», США). Распределение числовых признаков проверяли по критерию Шапиро—Уилка. При соответствии числового распределения признака нормальному закону сравнение осуществляли с помощью критерия Стьюдента. В случае отклонения исследуемого распределения от нормального закона распределения проверку статистических гипотез при сравнении числовых данных двух несвязанных групп проводили с использованием U-критерия Манна—Уитни. Данные представлены в виде Me (25; 75), где Me — это медиана, 25 и 75 — это значения 25-го и 75-го процентилей, или в виде (M±m), где M — среднее значение, m — средняя ошибка средней арифметической. Сравнение относительных показателей (частот) для групп проводили с помощью критерия χ² Пирсона. Различия считали статистически значимыми при значении p<0,05. Для оценки интенсивности корреляционной связи использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмена (r).

Пациентки с аденомиозом стратифицированы в две группы по признаку невынашивание/вынашивание: 1-я группа — 48 пациенток, беременность которых завершилась самопроизвольным выкидышем или очень ранними преждевременными родами; 2-я группа — 72 пациентки с беременностью, завершившейся срочными или преждевременными родами. Группу контроля (3-я группа) составили 50 пациенток, не имеющих в анамнезе репродуктивных проблем, с физиологически протекающей беременностью, завершившейся срочными родами. Средний возраст пациенток 1-й группы составил 29,6,2±1,4 года, 2-й группы — 28,5±1,5, группы контроля — 28,4±1,2 года. По среднему возрасту группы сопоставимы. При анализе соматических заболеваний выявлено, что преобладающей патологией у пациенток с аденомиозом была железодефицитная анемия — 46 (38,3%) пациенток, количество пациенток с железодефицитной анемией в группе контроля было статистически значимо меньше —5 (10%), χ²=15,6, p<0,001, что, вероятно, связано с менее выраженной кровопотерей при менструации.

При анализе частот степени распространения аденомиоза (1-я и 2-я степень) у пациенток 1-й и 2-й групп статистически значимых различий не было (p>0,05). Пациентки (8,3%) с аденомиозом 3-й степени выявлены только в 1-й группе (табл. 1).

Таблица 1. Внутригрупповое распределение пациенток с аденомиозом по степени распространения

Наблюдение за течением беременности показало, что, несмотря на проводимое лечение, у 26 (54,2%) пациенток 1-й группы самопроизвольный выкидыш произошел на 6—8-й неделе гестации, у 5 (10,4%) — на 10-й неделе, у 3 (6,2%) на 12—13-й неделе, у 2 (4,1%) — на 15-й неделе и еще у 2 (4,1%) — на 19-й неделе беременности (см. рисунок).

Сравнительная характеристика исходов гестации.

Замершая беременность в сроки 7—11 и 9—11 недель наблюдалась у 9 (18,6%) женщин. У одной беременной произошли очень ранние преждевременные роды в сроке 22—23 недели с летальным исходом для новорожденного.

Беременность закончилась срочными родами у 54 (45%) пациенток 2-й группы, у 2 (2,7%) произошли ранние преждевременные роды на 33-й неделе беременности, у 16 (22,2%) — преждевременные роды с благополучным исходом для новорожденного.

Согласно критериям включения, у пациенток группы контроля осложнения беременности и родов отсутствовали. Обращало на себя внимание, что в целом относительно благополучный исход беременности у пациенток с аденомиозом оказался ниже общепопуляционного и составил 60%.

При наблюдении за течением беременности у пациенток 2-й группы отмечено, что более чем у 30% женщин беременность осложнилась угрожающим самопроизвольным выкидышем и угрожающими преждевременными родами. Результаты ультразвукового исследования с допплерометрией показали наличие плацентарной недостаточности с нарушением плодово-плацентарного кровотока у 37,5% беременных в третьем триместре. Обращало на себя внимание увеличение частоты преэклампсии, которая имела место у 15,2% беременных 2-й группы.

Как известно, прегравидарный процесс перестройки иммунной системы начинается в секреторной фазе менструального цикла и индуцируется прогестероном через прогестерон-индуцированный блокирующий фактор (PIBF), продуцируемый Т-супрессорами (CD8+), включая благоприятный для беременности иммунный ответ через систему Т-хелперов 2-го типа. PIBF, воздействуя на В-клетки, индуцирует повышенную выработку асимметричных нецитотоксических антител и изменение профиля секреции цитокинов активированными лимфоцитами с увеличением продукции противовоспалительных IL (IL-4 и IL-10) и снижение выработки цитокинов провоспалительного пула, опосредующих реакции клеточного иммунного ответа по механизму хронического воспаления (IFN-β, TNF-α и IL-2) [1]. Наши исследования показали, что у пациенток с невынашиванием (1-я группа) до беременности наблюдалось статистически значимое снижение уровня IL-2 до 11,9±0,26 пг/мл по сравнению с 22,4±0,21 пг/мл у пациенток 2-й группы и 21,5±0,21 пг/мл — у пациенток группы контроля (χ²=26,0, χ²=25,0, p<0,001). Статистически значимых различий между показателями у пациенток 2-й и группы контроля не было (χ²=0,34, p=0,73) (табл. 2).

Таблица 2. Динамика уровня интерлейкина IL-2 в цервикальной слизи в течение беременности

Примечание. В табл. 2—6 данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентили) — Me (LQ—UQ) или в виде среднего значения и средней ошибки средней арифметической — M±m.

В ранние сроки беременности в момент инвазии бластоцисты и начала дифференцировки трофобласта концентрация IL-2 в ЦС увеличивалась в 1,5 раза у пациенток 2-й и 3-й групп. Подобного увеличения у женщин 1-й группы не наблюдалось, и концентрация IL-2 оставалась практически на прежнем уровне (12,6±0,45 по сравнению с исходным уровнем — 11,9±0,26, χ²=1,52, p=0,149). В дальнейшем в сроке 10—14 недель выявлено шестикратное увеличение концентрации IL-2 у пациенток 1-й группы (χ²=10,3, p<0,001), тогда как у женщин группы контроля и 2-й группы наблюдался плавный статистически значимый прирост (χ²=12,2, p<0,001) (см. табл. 2). Однако темпы прироста уровня IL-2 у пациенток с аденомиозом были статистически значимо выше по сравнению с пациентками группы контроля (χ²=11,4, p<0,001). В третьем триместре уровень IL-2 практически не менялся у пациенток 2-й группы (χ²=1,2, p=0,12) и несколько прирастал у беременных группы контроля (χ²=5,4, p=0,03), при этом сохранялась статистически значимая межгрупповая разница. Поскольку IL-2 определяет уровень естественной цитотоксичности, и длительное воздействие антигенного влияния сопровождается уменьшением концентрации IL-2 [5], дефицитарность IL-2 у пациенток 1-й группы может свидетельствовать о наличии у этих беременных дополнительной антигенной нагрузки на иммунную систему, которая не связана ни с наличием аденомиоза, ни с влиянием беременности на организм женщины.

Известно, что важную роль в патогенезе аденомиоза играет IL-6, основными функциями которого являются активация В-лимфоцитов и стимуляция пролиферации Т-лимфоцитов за счет индукции рецепторов IL-2 и, как следствие, увеличение продукции IL-2. Активность аденомиоза во многом определяется степенью повышения уровня IL-6, а также факторов пролиферации и неоангиогенеза [2]. IL-6 в организме беременной продуцируется материнскими лимфоцитами, моноцитами и макрофагами, а также клетками трофобласта и контролирует иммунные реакции в зоне контакта мать-плод.

Анализ исходной концентрации провоспалительного IL-6 выявил статистически значимо более высокий уровень у пациенток 1-й группы по сравнению с показателями у пациенток 2-й и 3-й групп (в 2,2 и 3,6 раза соответственно (χ²=122,2, p<0,001; χ²=166,4, p<0,001), двукратно нарастая к 13—14-й неделе беременности (табл. 3).

Таблица 3. Динамика уровня интерлейкина IL-2 в цервикальной слизи в течение беременности

Ранее нами отмечено, что у пациенток с аденомиозом и отсутствием репродуктивных неудач (2-я группа) беременность чаще осложнялась угрозой прерывания, плацентарной недостаточностью и преэклампсией, что коррелировало со статистически значимым (p<0,001) повышением в 1,5 раза уровня IL-6 в ЦС как на этапе фертильного цикла, так и в течение гестации. При этом аналогично пациенткам группы контроля концентрация IL-6 статистически значимо снижалась в сроке 5—6 недель беременности (3,7±0,03 пг/мл по сравнению с 2,7±0,05 пг/мл, χ²=12,1, p<0,001), а далее двукратно нарастала во втором и третьем триместрах, отличаясь от результатов у пациенток группы контроля (p<0,001).

IL-10 при его достаточной концентрации подавляет секрецию и синтез провоспалительных цитокинов IL-2, TNF-α и IFN-γ клетками и экспрессию антигена класса II главного комплекса гистосовместимости и действует как посредник других внутриматочных регуляторов — прогестерона, катехоламинов и простагландинов. Концентрация IL-10 при физиологически протекающей беременности у здоровых женщин (3-я группа) и у пациенток с аденомиозом (1-я и 2-я группы) статистически значимо и умеренно прирастала в первом триместре беременности и в течение второго и третьего триместра беременности (2-я группа). При этом межгрупповых статистически значимых различий не было (табл. 4).

Таблица 4. Динамика уровня интерлейкина IL-10 в цервикальной слизи в течение беременности

Соотношение содержания в ЦС провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (баланс Th1/Th2 цитокинов) наиболее показательно демонстрировал ПВИ ЦС, определяемый как отношение уровней IL-6/IL-10 усл. ед. Выявлено, что у практически здоровых женщин (3-я группа) ПВИ исходно в средней секреторной фазе составлял 0,3±0,01, далее в момент формирования маточно-плодовой перфузии имел тенденцию к снижению за счет уменьшения концентрации IL-6 (табл. 5), а затем возвращался к исходным параметрам и несколько увеличивался в третьем триместре. У пациенток 2-й группы мы наблюдали некоторый дисбаланс в системе Th1/Th2 цитокинов, выразившийся в приросте ПВИ в начале первого триместра беременности до 0,5±0,03 усл. ед. с минимальным увеличением в третьем триместре, что статистически значимо отличалось от параметров у женщин 3-й группы (χ²=3,6, p<0,002).

Таблица 5. Динамика провоспалительного индекса (IL-6/IL-10) в цервикальной слизи в течение беременности

Напротив, у пациенток 1-й группы мы наблюдали исходно статистически значимо более высокий ПВИ с практически двукратным приростом в сроке 5—6 недель беременности (0,7±0,0 по сравнению с 1,1±0,05, p<0,001). ПВИ нарастал по мере прогрессирования беременности в основном за счет возрастания в ЦС концентрации IL-6.

Таким образом, умеренный провоспалительный цитокиновый дисбаланс при аденомиозе, вероятно, может приводить к нарушению дифференцировки и инвазии трофобласта с развитием угрозы самопроизвольного выкидыша, а наличие дефицитарности регуляторного IL-2, опосредованной выраженным провоспалительным дисбалансом у ряда пациенток, приводит к ее прерыванию. Это косвенно подтверждается наличием, по нашим данным, сильных отрицательных корреляционных связей между уровнями PLGF, регистрируемыми у пациенток с аденомиозом в начале первого триместра беременности, и ПВИ (r= –0,86; p<0,05). В целом анализ динамики уровня PLGF в периферической крови у здоровых женщин на фоне физиологической беременности выявил статистически значимое пятикратное нарастание его уровня во втором триместре по сравнению с первым (365,5±0,35 по сравнению с 45,0±0,35, p<0,001) и дальнейшее двукратное увеличение в третьем триместре беременности (604,4±0,35 пг/мл, p<0,001). Подобная динамика наблюдалась и у пациенток с аденомиозом, не имеющих нарушений репродукции (2-я группа), но уровень PLGF был статистически значимо ниже по сравнению с результатами у женщин группы контроля (35,6±0,75, 267,4±0,38, 408,5±0,65 — первый, второй и третий триместры соответственно, p<0,001 по сравнению с результатами у пациенток группы контроля). При этом у пациенток с аденомиозом и невынашиванием (1-я группа) выявлен максимально низкий уровень PLGF в первом триместре беременности (p<0,001) (табл. 6).

Таблица 6. Динамика уровня плацентарного фактора роста (PLGF) в периферической крови в течение беременности

PLGF, вырабатываемый эндометрием, клетками трофобласта и эндотелиоцитами сосудов, является одним из важнейших регуляторов формирования плаценты и васкуляризации ее ворсин. PLGF также влияет на иммунный ответ, действуя как на врожденные, так и на адаптивные иммунные клетки, инициирует функциональное созревание NK-клеток, способствуя инвазии трофобласта и перестройке спиральных артерий матки. По совокупности указанных причин аномальная экспрессия PLGF во время беременности влияет на функцию трофобластов в такой же степени, как и на кровоснабжение плацентарного ложа и служит маркером плацентарной дисфункции и преэклампсии [6].

По данным нашего исследования, уровень PLGF статистически значимо коррелировал с последующим развитием преэклампсии (r=0,84; p<0,05) и плацентарной недостаточности с нарушением гемодинамики (r=0,72; p<0,05). Наличие корреляций такого рода, по всей вероятности, связано с тем, что в условиях хронического воспаления PLGF недостаточно продуцируется формирующимися хориальными структурами, что приводит к поверхностной или неадекватной инвазии трофобласта, к неполному преобразованию спиральных артерий матки, к ослаблению межворсинчатого кровотока и в целом — к нарушению кровотока в системе мать-плацента-плод.

Наличие выраженного провоспалительного дисбаланса у пациенток 1-й группы, вероятно, связано не только с наличием аденомиоза, но и с дополнительной стимуляцией нейтрофильного и макрофагального звеньев иммунитета, подтверждающейся наличием повышенного уровня кателицидина LL-37 в ЦС. Нами выявлено, что у пациенток 2-й группы уровень LL-37 в периферической крови не имел статистически значимого отличия от параметров, определяемых у женщин группы контроля (3-я группа), и составил 21,3±3,1 пг/мл по сравнению с 20,5±3,7 пг/мл у женщин группы контроля (p=0,85). Напротив, при анализе параметров концентрации кателицидина LL-37 в ЦС у пациенток 1-й группы выявлено более чем двукратное повышение его уровня — 46,4±6,4 пг/мл, p<0,001 (табл. 7).

Таблица 7. Уровень кателицидина LL-37 в цервикальной слизи на этапе прегравидарной подготовки

Кателицидин LL-37 представляет собой защитный антимикробный пептид, выделяемый нейтрофилами в ответ на антигенную стимуляцию, и проявляет цитотоксичность против грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов, некоторых вирусов и простейших, инициируя активацию моноцитов, эозинофилов, тучных клеток и Т-лимфоцитов. Повышенный уровня кателицидина LL-37 в цервикальной слизи у пациенток с аденомиозом свидетельствует о наличии сопутствующего воспалительного процесса, возможно, опосредованного инфекционными агентами, не выявляющимися стандартными методами.

Таким образом, у большинства пациенток с аденомиозом наблюдаются нарушения процесса вынашивания беременности, связанные с развитием гестационных осложнений и/или с ее несвоевременным прерыванием. Во многом это объясняется наличием изменения адаптивных механизмов, обеспечивающих иммунологическую толерантность к аллогенному плоду, выражающуюся в недостаточном смещении хелперных соотношений Th1/Th2 в сторону преобладания Th2 и усилении провоспалительного компонента цитокинового баланса. У пациенток с аденомиозом и ранними репродуктивными потерями наблюдается максимальная степень цитокинового дисбаланса при наличии дефицитарности IL-2 как в лютеиновой фазе цикла, так и в начале первого триместра беременности. При этом провоспалительный дисбаланс на локальном уровне тесно коррелирует с максимальными значениями кателицидина LL-37 в цервикальном секрете и минимальными значениями содержания в периферической крови плацентарного фактора роста (r=0,94). Поскольку именно плацентарный фактор роста во многом определяет адекватное развитие и функционирование плацентарной системы, регулирует процесс ангиогенеза и неоангиогенеза, в том числе и коллатерального в эмбриональном и фетальном периодах, недостаточная его продукция обусловливает нарушения неоангиогенеза при формировании хориона и плаценты. Это является причиной плацентарной недостаточности и гипертензионных расстройств. Наличие увеличенной концентрации кателицидина LL-37 в цервикальной слизи пациенток с аденомиозом и ранними репродуктивными потерями указывает на вероятность сопутствующего инфекционно-зависимого воспалительного процесса, усугубляющего локальные иммунные дефекты при аденомиозе, и является основанием для верификации хронического эндометрита с применением иммуногистохимических и микробиологических критериев на прегравидарном этапе.

Установленные в данном исследовании особенности функционирования иммунной системы на локальном уровне предопределяют дальнейшее изучение данной проблемы в аспекте поиска причин, теоретического обоснования и практической разработки своевременной и индивидуализированной прегравидарной подготовки женщин с аденомиозом с целью профилактики невынашивания и осложнений гестации.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Кравцова Е.И., Куценко И.И., Лукошкина И.Н.

Сбор и обработка материала — Кравцова Е.И., Куценко И.И., Лукошкина И.Н.

Статистический анализ данных — Кравцова Е.И.

Написание текста — Кравцова Е.И., Лукошкина И.Н.

Редактирование — Куценко И.И.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹Прегравидарная подготовка. Клинический протокол Междисциплинарной ассоциации специалистов репродуктивной медицины (МАРС). Версия 2.0. М.: Редакция журнала StatusPraesens; 2020.

²Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 20 октября 2020 г. №1130н «Об утверждении порядка оказания медицинской помощи по профилю «Акушерство и гинекология». Ссылка активна на 15.07.22 https://publication.pravo.gov.ru/Document/View/0001202011130037?ysclid=l5rs8k523r852103181