Введение
Согласно современным представлениям, сепсис определяется как жизнеугрожающая органная недостаточность, вызванная дисрегуляцией иммунного ответа на инфекцию [1]. Сепсис, развивающийся в течение первых 30 дней жизни, называют неонатальным. Заболеваемость неонатальным сепсисом составляет 0,5—8,0‰; заболевание характеризуется высокой летальностью, которая при раннем развитии может достигать 40%, при позднем — 20%. К факторам риска развития сепсиса относятся низкая масса при рождении, низкая оценка в баллах по шкале Апгар, материнский хориоамнионит и колонизация стрептококками группы B [2]. Диагностика сепсиса у новорожденных сложна из-за неспецифичности клинических проявлений: помимо температурной нестабильности, гемодинамических нарушений и изменения сознания заболевание на ранних этапах может проявляться нарушением дыхания, периферической циркуляции или даже только изменением поведения ребенка [3]. В связи с этим любое подозрение на развитие сепсиса у новорожденного требует выполнения развернутого лабораторного обследования, включающего оценку формулы крови, уровня воспалительных биомаркеров, таких как С-реактивный белок (СРБ) и прокальцитонин (ПКТ), а также бактериологическое исследование крови, мочи, спинномозговой жидкости и других сред по показаниям [4]. Диагностическая точность конвенциональных лабораторных маркеров неонатального сепсиса высока и составляет в среднем около 90% [5]. Тем не менее сложная последовательность появления биомаркеров в ответ на развитие инфекции, а также индивидуальные особенности иммунного реагирования организма новорожденного могут стать источником диагностических ошибок при раннем выявлении септического процесса [6]. Поэтому не теряют актуальность поиск и внедрение в практику новых биомаркеров неонатального сепсиса [7].
На сегодняшний день предложено большое количество потенциальных биомаркеров сепсиса новорожденных [8, 9]. К ним относятся, в частности, цитокины и хемокины (интерлейкины (ИЛ)-6 [10], ИЛ-10 [11], RANTES [12] и др.). К достоинствам клинической оценки цитокинового профиля следует отнести скорость и простоту исполнения (методом иммуноферментного анализа — ИФА), отсутствие субъективного фактора работы оператора и возможность автоматизации, а также относительно низкие экономические затраты. На примере 6 недоношенных новорожденных показано значительное увеличение концентрации ИЛ-6, предшествующее летальному исходу, в результате раннего сепсиса [13]. Метаанализ выявил высокую диагностическую точность (чувствительность 85%, специфичность 88%) определения уровня ИЛ-6 для диагностики неонатального сепсиса, ассоциированного с преждевременным разрывом плодных оболочек [14]. Продемонстрировано статистически значимое повышение уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 в 5,5 раза, ИЛ-6 в 5,4 раза, ИЛ-18 в 3 раза, фактора некроза опухоли (ФНО) в 3 раза); постулируется возможность их использования в качестве скрининговых маркеров в прогнозе и диагностике перинатальных инфекций у недоношенных детей [15]. Неблагоприятный эффект ИЛ-1 заключается не только в формировании избыточного воспалительного ответа, но и в стимулировании долгосрочных когнитивных нарушений из-за воздействия этого цитокина на гиппокамп [16]. ИЛ-1 опосредует многие осложнения недоношенности, включая бронхолегочную дисплазию и ассоциированную с ней легочную гипертензию, поражение белого вещества головного мозга, ретинопатию, а также инфекционно-септические осложнения [17]. Подтверждена активация экспрессии генетических транскрипционных путей, ответственных за выработку интерферонов, ИЛ-1 и ИЛ-6 при сепсисе новорожденных с поздним началом [18]. ИЛ-6 и ИЛ-8 способны запускать процессы выработки активных форм кислорода, вызывающих тканевое повреждение при неонатальном сепсисе [19]. Так, показана зависимость между уровнем провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8) и клиническими проявлениями инфекции у новорожденных разного гестационного возраста [20]. Отмечена значимость ИЛ-6 и ФНО для диагностики сепсиса новорожденных (вместе с ИЛ-27, ИЛ-10, СРБ, ПКТ и содержанием лейкоцитов) [21]. Авторы заключают, что для ранней диагностики нозокомиальной инфекции у новорожденных комбинация ИЛ-6 и СРБ превосходит по точности определение ПКТ, а также отмечают хорошие диагностические перспективы полуколичественного определения ИЛ-8 при его низкой чувствительности [22]. Кроме того, исследования цитокинового профиля хорошо зарекомендовали себя при оценке локального воспаления подсвязочного пространства трахеи [23], а также динамики септического шока и острого повреждения почек при применении различных методов экстракорпоральной детоксикации [24]. Таким образом, получено большое количество свидетельств эффективности определения цитокинов для диагностики сепсиса новорожденных, однако до сих пор не предложен единый подход к решению этой задачи.
Цель исследования — оценить прогностическую ценность профиля цитокинов плазмы крови — ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-1, ФНО как биомаркеров сепсиса у новорожденных, находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ).
Материал и методы
Дизайн исследования соответствует этическим стандартам Хельсинкской декларации 1975 г. и ее пересмотренного варианта 2000 г., одобрен локальным этическим комитетом ГБУЗ «ДГКБ №9 им. Г.Н. Сперанского ДЗМ» на заседании 31 мая 2022 г. Получено информированное добровольное согласие всех участников. Набор пациентов продолжался с июля по декабрь 2023 г. В настоящее проспективное когортное исследование включали новорожденных любого пола в возрасте до 21 дня с массой тела не менее 2 кг с любым сроком гестации. Исследовали кровь находящихся в ОРИТ 46 новорожденных из числа детей, включенных в группы: без признаков инфекционно-септического процесса (контроль) — соответствие критериям включения при отсутствии подтвержденных инфекционно-воспалительных осложнений: дети с синдромом дыхательных расстройств, судорожным синдромом, неонатальной желтухой); с клинически подтвержденным очагом инфекции без генерализации (Очаг инфекции); с сепсисом (соответствие критериям включения при наличии двух клинически подтвержденных очагов инфекции, а также одного из критериев: наличие температурной нестабильности/повышение содержания СРБ/повышение содержания ПКТ/лейкоцитоз/сдвиг лейкоцитарной формулы влево) (Сепсис). Клиническая характеристика больных представлена в табл. 1.
Таблица 1. Клиническая характеристика больных
| Параметр | Контроль (n=34) | Очаг инфекции (n=32) | Сепсис (n=7) |
| Количество мальчиков, n (%) | 24 (70,6) | 20 (62,5) | 5 (71,4) |
| Возраст, дни | 3—7 | 5—7 | 4—8 |
| Срок гестации, нед | 36—39 | 36—40 | 35—38 |
Образцы крови отбирали в 1-й день после поступления, а также на 8-й день у пациентов с инфекционными осложнениями. Оценивали уровень цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-1, ФНО в плазме методом ИФА (АО «Вектор-Бест», Россия), вычисляя относительное содержание исследуемых цитокинов (относительные единицы люминесценции, relative luminescent units — RLU). Оценивали содержание конвенциональных лабораторных биомаркеров воспалительного процесса — лактата, СРБ, ПКТ, нейтрофильно-лимфоцитарного соотношения (НЛС) по стандартным методикам. Расчеты выполнены с применением пакета IBM SPSS 21 (IBM Corporation, США).
При выполнении статистической обработки данных сравнивали качественные и количественные показатели в интересующих совокупностях пациентов. Для оценки качественных характеристик вычисляли структурные показатели (доли). Для оценки количественных параметров вычисляли описательные статистики: медиану, 1-й и 3-й квартили. Вычисление квартилей выполнили по методу Джона Тьюки, который предполагает оценку первого квартиля как медианы нижней половины данных и третьего — как медианы верхней половины [25]. Сравнение распределений проводили на основании непараметрического критерия Манна—Уитни для двух независимых групп. Для оценки взаимосвязи между показателями использовали непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена (ρ). Коэффициент ρ может принимать значения от 0 до 1, и для его интерпретации использована агрегированная шкала Чеддока: степень связи между признаками оценивали как слабую при ρ≤0,33, как умеренную при 0,33<ρ≤0,66 и как сильную при ρ>0,66.
Оценку прогностической силы построенных моделей выполняли методом ROC-анализа. ROC-анализ (receiver operating characteristics — операционные характеристики наблюдателя) представляет собой исследовательский инструмент, позволяющий анализировать взаимоотношения чувствительности и специфичности метода исследования в бинарной классификации. Основой данного анализа является построение ROC-кривой, которая показывает зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров [26].
Длительность госпитализации исследовали методом анализа Каплана—Мейера. График оценки функции выживаемости представляет собой убывающую ступенчатую линию, приближающую реальные значения функции выживаемости для этой задачи. Значения функции выживаемости между точками наблюдений считаются константными. Метод Каплана—Мейера учитывает, что пациенты (наблюдения) выбывают в ходе исследования. Построены средние и медианы длительности госпитализации, а также доверительные интервалы (ДИ) для указанных параметров. Значимость различий показателей длительности госпитализации (проверка равенства распределений) определяли на основании логрангового критерия.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследования оценили влияние гендерного фактора, а также возраста и срока гестации на исследуемые воспалительные биомаркеры. При попарном сопоставлении показателей у мальчиков и девочек контрольной группы различия не выявлены по всем показателям, кроме ПКТ. Уровень ПКТ у девочек оказался выше и составил 0,76—3,11 нг/мл по сравнению с 0,05—0,35 нг/мл у мальчиков (p=0,010).
При корреляционном анализе выявлена отрицательная взаимосвязь умеренной силы между возрастом пациентов и уровнем цитокинов ИЛ-6 (ρ=–0,356, p=0,039), ИЛ-8 (ρ= –0,353, p=0,041), ИЛ-1 (ρ=–0,398, p=0,026), а также между возрастом и НЛС (ρ= –0,364, p=0,034). Выявлено снижение уровня ИЛ-8 в плазме детей старше 3 дней (0,37—1,06 и 0,15—0,42 RLU; p=0,046, рис. 1); для остальных исследуемых цитокинов у детей контрольной группы статистически значимые различия не выявлены. Кроме того, содержание ИЛ-6 оказалось связано с уровнем лактата (ρ=0,412, p=0,015), ИЛ-8 (ρ=0,406, p=0,017) и ИЛ-1 (ρ=0,529, p=0,002), а уровень ПКТ — с НЛС (ρ=0,597, p=0,001).
Рис. 1. Уровень ИЛ-8 у новорожденных контрольной группы в зависимости от возраста.
На втором этапе проанализировали уровень обследуемых цитокинов и его динамику у пациентов с очагом инфекции и с течением сепсиса. При прямом сопоставлении статистически значимые различия между группами (контроль, Очаг инфекции и Сепсис) не получены как в 1-е, так и на 8-е сутки наблюдения. При анализе динамики уровня цитокинов выявлено, что темп прироста уровня ИЛ-6 при сепсисе находится в диапазоне (–15,3)—(89,8)%, в то время как при наличии инфекционного очага без признаков генерализации показатель составляет (–24,4)—(–72,8)% (p=0,027) (рис. 2). У детей этих групп статистически значимо различались уровни СРБ и ПКТ. Уровень СРБ у детей группы сепсиса составил 2,1—14,5 мг/л, у детей группы локализованного инфекционного очага — 1,0—4,7 мг/л (p=0,028); уровень ПКТ у детей группы сепсиса составил 4,3—32,5 мг/л, у детей группы локализованного инфекционного очага — 0,11—2,4 мг/л (p=0,001). Выявлена умеренная значимая корреляция между уровнями СРБ и ПКТ для всех пациентов (ρ=0,502, p<0,001), в то время как корреляция между СРБ и ПКТ с одной стороны и динамикой ИЛ-6 с другой стороны отсутствует.
Рис. 2. Темп прироста ИЛ-6 при локализованном очаге инфекции и его генерализации.
С помощью ROC-анализа оценили пороговое значение изменения содержания ИЛ-6, а также вычислили чувствительность и специфичность его определения. Площадь под ROC-кривой составила 0,802 (ДИ 0,549—1,000) (p=0,027) (рис. 3); чувствительность теста 83,3%, специфичность 85,7% при точке отсечения 20% (рис. 4). Для СРБ и ПКТ площадь под ROC-кривой составила 0,745 (ДИ 0,589—0,900) (p=0,036) и 0,875 (ДИ 0,759—0,991) (p=0,001). Чувствительность определения СРБ 57,1%, специфичность 76,8%; чувствительность определения ПКТ 71,4%, специфичность 91,1%.
Рис. 3. ROC-кривая для изменения содержания ИЛ-6 в плазме.
Показаны эмпирические данные, аппроксимация кривой Лоренца и доверительный интервал [21].
Рис. 4. Чувствительность и специфичность изменения содержания ИЛ-6 в плазме.
С целью валидации полученной точки отсечения проанализировали длительность госпитализации пациентов обследуемых групп. Сопоставляли общее количество койко-дней (к/д) и количество к/д в ОРИТ. Длительность госпитализации пациентов обследуемых групп показана в табл. 2 и на рис. 5, 6.
Таблица 2. Длительность госпитализации пациентов
| Группа | Количество койко-дней | |||||
| общее | в ОРИТ | |||||
| Q1 | Q2 | Q3 | Q1 | Q2 | Q3 | |
| Контроль | 8 | 14 | 18 | 1 | 3 | 7 |
| Инфекционный очаг | 14 | 17 | 30 | 4 | 6 | 12 |
| Сепсис | 29 | 37 | 73 | 8 | 10 | 43 |
Рис. 5. Общая длительность госпитализации пациентов обследуемых групп.
Рис. 6. Длительность пребывания в отделении реанимации и интенсивной терапии пациентов обследуемых групп.
С помощью анализа Каплана—Мейера определили длительность госпитализации пациентов, характеризовавшихся снижением уровня ИЛ-6 ниже порогового значения 20% или недостаточным снижением уровня ИЛ-6. Медиана общей продолжительности госпитализации пациентов этих групп составила соответственно 16 к/д и 36 к/д (p=0,007); медиана длительности пребывания в ОРИТ — соответственно 6 к/д и 27 к/д (p=0,010) (табл. 3, 4, рис. 7, 8).
Таблица 3. Показатели общей длительности госпитализации в зависимости от уровня ИЛ-6
| Снижение уровня ИЛ-6 | Среднее | Медиана | ||||||
| оценка | стандартная ошибка | 95% ДИ | оценка | стандартная ошибка | 95% ДИ | |||
| нижняя граница | верхняя граница | нижняя граница | верхняя граница | |||||
| На 20% и ниже | 20,58 | 2,51 | 15,66 | 25,49 | 16,00 | 1,08 | 13,89 | 18,11 |
| Недостаточное снижение | 49,86 | 13,91 | 22,60 | 77,12 | 36,00 | 3,93 | 28,30 | 43,70 |
| Всего | 28,46 | 4,75 | 19,15 | 37,77 | 24,00 | 4,53 | 15,11 | 32,89 |
Таблица 4. Показатели общей длительности пребывания в отделении реанимации и интенсивной терапии в зависимости от уровня ИЛ-6
| Снижение ИЛ-6 | Среднее | Медиана | ||||||
| оценка | стандартная ошибка | 95% ДИ | оценка | стандартная ошибка | 95% ДИ | |||
| нижняя граница | верхняя граница | нижняя граница | верхняя граница | |||||
| На 20% и ниже | 7,47 | 1,50 | 4,54 | 10,41 | 6,00 | 1,31 | 3,44 | 8,56 |
| Недостаточное снижение | 32,14 | 11,91 | 8,80 | 55,48 | 27,00 | 24,88 | 0,00 | 75,76 |
| Всего | 14,12 | 3,89 | 6,49 | 21,74 | 8,00 | 0,99 | 6,06 | 9,94 |
Рис. 7. Кривые Каплана—Мейера для общей продолжительности госпитализации.
Рис. 8. Кривые Каплана—Мейера для продолжительности пребывания в отделении реанимации и интенсивной терапии.
Полученные результаты дают основание для клинического применения оценки уровня провоспалительных цитокинов с целью мониторинга инфекционно-септических осложнений у новорожденных. Отсутствие влияния гендерного фактора и срока гестации на уровень исследуемых цитокинов позволяет применять их определение на практике без формирования отдельных референсов для мальчиков и девочек разной степени доношенности. При этом цитокиновый профиль глубоко недоношенных детей необходимо изучить в дальнейшем. Выявленная обратная взаимосвязь между возрастом детей и уровнем ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-1 может свидетельствовать о повышении уровня этих цитокинов сразу после рождения. Полученные данные о снижении уровня ИЛ-8 в течение первых трех дней жизни указывают на необходимость проведения уточняющих исследований у детей в этом возрасте для дальнейшего клинического применения цитокинового профиля. Обнаруженные взаимосвязи между уровнем ИЛ-6 с одной стороны и уровнем лактата, ИЛ-8 и ИЛ-1 с другой стороны подтверждают ключевую роль ИЛ-6 в развитии воспалительного ответа и обосновывают его применение в качестве биомаркера генерализации инфекции при развитии сепсиса новорожденных. В работе показано, что динамика уровня ИЛ-6 является опережающим индикатором течения инфекционно-септического процесса у новорожденных, причем благоприятным фактором следует считать снижение показателя на 20% и ниже в течение первой недели наблюдения. Неизменный или возрастающий уровень ИЛ-6 в плазме связан с генерализацией инфекции и значительным удлинением сроков пребывания пациента как в ОРИТ, так и в госпитальном отделении. В обследованной совокупности пациентов площадь под ROC-кривой для динамики уровня ИЛ-6 оказалась на промежуточном месте между таковыми для динамики уровней СРБ и ПКТ, причем уровень ПКТ характеризуется наивысшим значением площади под ROC-кривой. Однако диагностическая точность изменения уровня ИЛ-6 находится на первом месте среди обсуждаемых биомаркеров. Уровень ИЛ-6 рассматривается в качестве возможного биомаркера сепсиса новорожденных многими исследователями. В частности, показано, что сочетанное определение уровней ИЛ-6 и СРБ улучшает точность диагностики неонатального сепсиса с ранним началом, однако изолированный подъем уровня ИЛ-6 не является признаком генерализации инфекции сам по себе [27], что согласуется с нашими данными. К аналогичным выводам пришли авторы, которые предлагают комбинированную оценку уровней СРБ, ПКТ, ИЛ-6 и лейкоцитов для повышения точности диагностики неонатального сепсиса [28]. Полученные данные о прогностической значимости динамики уровня ИЛ-6 к 7-му дню заболевания у новорожденных согласуются с результатами, демонстрирующими диагностическую ценность показателя для работы с сепсисом у взрослых пациентов [29].
Заключение
Проанализированы особенности цитокинового профиля новорожденных без признаков течения воспалительного процесса, а также прогностические возможности исследования цитокинов для диагностики генерализации воспаления. Показано, что снижение уровня ИЛ-6 более чем на 20% по сравнению с исходным уровнем в течение недели статистически значимо является благоприятным прогностическим фактором и свидетельствует о низкой вероятности прогрессии инфекционно-септических осложнений.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Образцов И.В.
Сбор и обработка материала — Черникова Е.А., Образцова А.А., Епифанова М.А.
Статистический анализ данных — Образцов И.В.
Написание текста — Образцов И.В.
Редактирование — Жиркова Ю.В.
Работа выполнена при поддержке гранта АНО «Московский центр инновационных технологий в здравоохранении» на реализацию научно-практического проекта в сфере медицины. Грантовое соглашение №1712-3/22 от 06 апреля 2022 г.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.