Особенности экспрессии мРНК генов транскрипционных факторов при физиологической доношенной беременности

Беременность представляет собой особое состояние, которое бросает вызов материнской иммунной системе. Плацента человека и плод рассматриваются иммунологами как необычный тип физиологического аллотрансплантата, а отсутствие отторжения генетически чужеродного плода — как иммунологический парадокс. После имплантации иммунная система матери должна не противодействовать наполовину генетически чужеродному организму, а, наоборот, способствовать его росту и развитию до определенного момента — родов, когда происходит смена клеток иммунного окружения, меняется баланс цитокинов. Механизмы инициации родовой деятельности еще до конца не изучены, вопрос вклада различных пулов T-хелперов по-прежнему остается открытым.

Важную роль в дифференцировке T-хелперов (Th1, Th2, Th17, Treg) и последующей выработке различных классов цитокинов играют транскрипционные факторы (ТФ) дифференцировки. Транскрипционные регуляторы дифференцировки — это разновидность ТФ, которые не только вызывают экспрессию определенных генов, но и стабилизируют паттерны экспрессированных и доступных для индукции генов, т.е. вызывают дифференцировку клеток [1]. О качественном и количественном составе ТФ в третьем триместре беременности (незадолго до родов) в литературе мало информации, их роль при физиологическом течении беременности до конца не определена. С уровнем ТФ коррелирует определенное количество продуцентов, в частности, Th1 или Th2 клеток, а также соотношение Th1/Th2.

Ранее считалось, что во время беременности необходимо переключение особенностей иммунного ответа с Th1 на Th2 [2], в настоящее время эта парадигма Th1/Th2-ответа заменена на более сложную концепцию — взаимодействие Th1/Th2/Th17-клеток, которое контролируется Treg-клетками [3]. ТФ для Th2 является GATA3, для Th17 — RORC2, Treg — FOXP3. В современной литературе мало данных об особенностях экспрессии этих ТФ при доношенной физиологически протекающей беременности и взаимодействии их между собой, однако баланс Treg/Th2, Th17-типов является одним из важных моментов как при физиологически протекающей беременности, так и при ее осложнениях [3—7].

Treg контролируют Th1, Th2, Th17-типы эффекторного иммунного ответа на собственные антигены и патогены посредством FOXP3-зависимых супрессорных программ (FOXP3 — forkhead box protein 3). В 2001 г. идентифицирован ген FOXP3 у людей (FoxP3 у мышей) как ключевой фактор транскрипции развития клеток Treg. Изначально считалось, что клетки Treg вырабатываются только в тимусе, в 2000 г. концепция изменилась и обнаружены периферические клетки Treg [8]. Наиболее исследованные ткани в плане экспрессии FOXP3 — это жировая ткань, скелетная мускулатура, собственная пластинка толстой кишки и кожа [9]. Так, истощение или уменьшение количества клеток FOXP3 усугубляет воспаление сердца и ставит под угрозу его репарацию при инфаркте, отмечено уменьшение экспрессии FOXP3 при старческой миодистрофии. Эти клетки выявлены в децидуальной оболочке, и доказана их значимая роль в поддержании беременности и обеспечении толерантности между матерью и плодом [5, 7]. Несколько исследований показали, что необъяснимое бесплодие, выкидыш и преклампсия часто связаны с дефицитом количества и функции Treg, в то время как нормальная беременность избирательно стимулирует накопление материнской FOXP3 CD4(+) Treg-клеток с фетальной специфичностью [9]. Однако очень мало исследований, касающихся экспрессии FOXP3 перед родами при доношенной беременности. Учитывая, что регуляция и продукция цитокинов, характерных для Treg (интерлейкинов (ИЛ) ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10) во время беременности более значима, чем баланс Th1/Th2 [4], то оценка экспрессии FOXP3 позволяет оценить участие Treg в процессе родов.

Транскрипционный фактор GATA-3 в первую очередь отвечает за дифференциацию интактных CD4+Т-клеток в Th2-клетки, которые осуществляют защиту от антигенов гельминтов и белковых антигенов, а также ответственны за аллергические реакции [4].

В исследованиях показано, что GATA3 связан с началом родов, активируя каскад выработки цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, СОХ-2, фактора некроза опухоли TNF-α, матриксной металлопротеиназы ММП-9) [10]. При преждевременном разрыве плодных оболочек в случае недоношенной беременности, наоборот, наблюдалось подавление GATA3 [11, 12].

Не менее важную роль в прогрессировании беременности и росте плода играет соотношение Treg/Th17. Это недостаточно изученные популяции Т-клеток, однако доказано, что они играют основную роль в патогенезе аутоиммунных и аллергических процессов, а также участвуют в формировании иммунологической толерантности между организмом матери и плода. Клетки Th17 экспрессируют RORC2 (retinoid orphan nuclear receptor) и цитокины семейства ИЛ-17, которые являются провоспалительными цитокинами [13]. Важно отметить, что эффекторные Treg-клетки способствуют иммунной толерантности, в децидуальной оболочке их содержание превышает 90%, что значительно выше, чем в периферической крови [5]. Показано, что при физиологически протекающей беременности соотношение Treg/Th17 склоняется в сторону Treg [5].

В настоящее время признано, что клетки Th17 составляют третье эффекторное плечо Th-клеток, дополняя клоны Th1 и Th2. RORC2 является основным ТФ, который может управлять дифференцировкой клеток Th17; кроме того, программирование человеческих Th17-клеток с помощью RORC2 приводит к частичной устойчивости этих Т-клеток к супрессии под действием Treg. Эти находки подтверждают представление о том, что RORC2 является главным переключателем, который запускает широкий диапазон фенотипического и функционального программирования во время дифференцировки клеток Th17. В литературе крайне мало источников, посвященных экспрессии RORC2 при доношенной беременности у человека. В ряде публикаций описана роль Th17 в реализации хронических воспалительных процессов [1, 5, 13], отторжение аллотрансплантата плода, участие в преждевременных родах и развитии преэклампсии [14].

Учитывая изложенное, определение экспрессии мРНК генов ТФ, специфичных для фетоплацентарного комплекса и формирующих различные пулы T-хелперов, может способствовать пониманию развития и функции плаценты перед родами и прогнозированию различных осложнений беременности.

Цель исследования — оценить уровень экспрессии мРНК генов транскрипционных факторов (ТФ) Т-хелперов (GATA3, RORC2, FOXP3) в цервикальном канале, плаценте и плодных оболочках при доношенной беременности.

Исследование выполнено на базе родильных отделений ГБУЗ СО «Самарская городская клиническая больница №1 им. Н.И. Пирогова», в которое включены 42 беременных в сроке гестации 37—41 нед. Гестационный возраст рассчитывали по данным ультразвукового исследования или по первому дню последней менструации. Все пациентки родоразрешены путем операции кесарева сечения в плановом порядке, показаниями к которому являлись неправильное положение и предлежание плода.

Критерии исключения: беременные, относящиеся к группе высокого риска по соматической патологии (сахарный диабет, гестационный диабет), особенностям плацентации и акушерским осложнениям (преэклампсия, синдром задержки развития плода); наличие острых и обострения хронических воспалительных заболеваний, в том числе кольпита; применение антибактериальной терапии во время беременности.

Всем пациенткам выполнено исследование мазка цервикального канала, образца плаценты и плодных оболочек методом обратной транскрипции и ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ОТ-ПЦР) на базе лаборатории молекулярно-генетических методов лаборатории ООО «ДНК-технология» согласно инструкциям производителя («ДНК-Технология», Россия) с использованием набора реагентов «Проба НК» (ООО «ДНК-технология», Россия) и дополнительной фенольной депротеинизацией. Проведено определение уровня экспрессии мРНК генов GATA3, RORC2, FOXP3, а также экспрессии мРНК В2М, который относится к референсным или так называемым генам «домашнего хозяйства» (housekeeping gen) и используется для нормирования полученных показателей. Забор образца плаценты и плодных оболочек проводили в стерильных условиях во время операции кесарева сечения, в пределах операционного поля. Забор плаценты выполняли посередине расстояния от места прикрепления пуповины до наиболее отдаленной точки края плаценты с помощью конхотома с диаметром рабочей поверхности 9,4 мм, отсекали стандартный образец ткани плаценты с захватом участка из глубины плаценты (с предварительным отсечением амниона, хорионической пластинки и децидуальной ткани с материнской стороны). Забор плодных оболочек выполняли посередине между плацентой и внутренним зевом с помощью стерильного конхотома с диаметром рабочей поверхности 9,4 мм, отсекали стандартный образец плодных оболочек. Полученные образцы помещали в пробирки Эппендорф с транспортной средой («Проба-НК» производства ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Обработка результатов осуществлялась с помощью программы MS Excel. Использован метод сравнения индикаторных циклов (метод ΔΔCq). Уровень экспрессии мРНК генов измеряли в относительных единицах (ОЕ), отражающих представленность транскрипта относительно нормировочного фактора, рассчитанного на основе уровня экспрессии мРНК референсного гена (В2М).

Исследование одобрено комитетом по биоэтике ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (протокол №207 от 20 мая 2020 г.). Все женщины дали письменное информированное добровольное согласие.

Медиана возраста обследованных женщин составила 28 (28; 34) лет, срок беременности — 39,1 (39; 39,4) недели. В среднем на одну пациентку приходилось 2,53±1,81 беременности, число первородящих — 33,33%. Частота экспрессии мРНК генов GATA, RORC2, FOXP3 представлена на рисунке.

Частота экспрессии мРНК генов GATA3, RORC2, FOXP3 в цервикальном канале, плодных оболочках и плаценте при физиологически протекающей доношенной беременности.

Во всех случаях мы наблюдали экспрессию гена GATA3 в цервикальном канале, плодных оболочках и плаценте. Экспрессия мРНК гена RORC2 наблюдалась в 69% случаев в цервикальном канале, в 45% случаев в плодных оболочках и самая высокая частота экспрессии наблюдалась в плаценте — 76% (χ²=9,52; df=2; p=0,009). Различия статистически значимы для плодных оболочек при сравнении с цервикальным каналом (χ²=4,86; df=1; p=0,028) и плацентой (χ²=12,22; df=2; p<0,001). Профиль экспрессии мРНК FOXP3 представлен во всех локусах следующим образом: цервикальный канал — 40,5%, плодные оболочки — 54,7%, максимально в плаценте — 88,1% (χ²=21,11; df=2; p<0,001). Статистически значимые различия получены при сравнении экспрессии мРНК FOXP3 в плаценте с цервикальным каналом (χ²=20,47; df=2; p<0,001) и плодными оболочками (χ²=8,82; df=2; p=0,003).

Нами проанализировано количественное соотношение перечисленных генов (табл. 1). Уровень экспрессии GATA3 в плаценте был максимальным, статистически значимые различия по уровню экспрессии в цервикальном канале и плодных оболочках в количественном соотношении не получены. Максимальная экспрессия FOXP3 наблюдалась также в плаценте, менее выраженная — в плодных оболочках и минимальная — в цервикальном канале. Статистически значимые различия по уровню экспрессии RORC2 в различных локусах не выявлены.

Таблица 1. Уровень экспрессии мРНК генов GATA3, RORC2, FOXP3 в цервикальном канале, плодных оболочках и плаценте при физиологически протекающей доношенной беременности

Примечание. Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала Me (Q1—Q3).

Учитывая, что все показатели нормализованы по гену B2M, мы сравнили уровень экспрессии различных генов между собой. В цервикальном канале, плодных оболочках и плаценте первое место по уровню экспрессии мРНК занимает GATA3. Экспрессия RORC2 и FOXP3 в тысячи раз ниже, чем GATA3. При сравнении RORC2 и FOXP3 между собой статистически значимые различия получены только для плаценты: экспрессия FOXP3 была выше (p=0,045).

При проведении корреляционного анализа установлено, что показатели RORC2 и FOXP3 имели статистически значимую положительную корреляцию как в плодных оболочках и плаценте, так и в цервикальном канале (табл. 2). Уровень экспрессии GATA3 во всех локусах являлся совершенно самостоятельным и независимым от других ТФ.

Таблица 2. Корреляционная матрица для экспрессии мРНК геновGATA3, RORC2 и FOXP3 (r, p)

Примечание. цк — цервикальный канал; об — плодные оболочки; пл — плацента.

Поскольку интерфейс матери и плода представляет собой точку соединения между двумя иммунологически разными людьми, это стало решающим рубежом для иммунологических исследований. Новые технологии, одной из которых является метод обратной транскрипции и ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени [15, 16], позволили количественно оценить локальные иммунные взаимодействия на качественно новом уровне. Выполнены работы по определению экспрессии генов врожденного иммунитета при беременности и привычном невынашивании [17], преждевременных родах [6], реализации внутриутробной инфекции плода [18, 19], в которых выделена роль провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Учитывая то, что экспрессирующие FOXP3 Т-клетки человека с функцией Treg и Th17, трансдуцированными RORC2, являются относительно новым предметом исследования в иммунологии, особенности продукции этих ТФ мало изучены и развитие этого направления несомненно представляет интерес для современного акушерства.

Согласно данным литературы [20], во влагалищных выделениях определяют гены с высокой частотой экспрессии; к этой группе относится GATA3, со средней частотой экспрессии — RORC2, и низкой частотой экспрессии — FOXP3. В нашем исследовании для цервикального канала частота экспрессии генов ТФ соответствовала данной градации: GATA3 наблюдали в 100% случаев, RORC2 — в 69%, а FOXP3 — лишь в 40,5% случаев.

GATA3 является интенсивно экспрессируемым геном [15, 16, 20], что также подтверждено и в нашем исследовании. GATA3 выявлен у всех пациенток во всех локусах, с достаточно стабильной экспрессией, а в плаценте в десятки раз по количеству превосходил остальные.

В исследованиях S. Tsuda и соавт. (2018), М.К. Меджидовой и соавт. (2012), Н.Ю. Катковой и соавт. (2017) установлено, что при нормально протекающей беременности соотношение Treg/Th17 сдвигается в сторону Treg, за счет которых обеспечиваются иммуносупрессия и неотторжение антигенной структуры плода [5, 12, 19]. Полученные нами данные совпали: экспрессия FOXP3 в плаценте по активности преобладала над RORC2.

При развитии воспалительных заболеваний, в том числе инфекционных, соотношение Treg/Th17 смещается в сторону Th17. Treg отвечают за успешное протекание беременности, а Th17, наоборот, ответственны за преждевременные потери беременности и развитие осложнений [21]. Тем не менее нами отмечена статистически значимая положительная корреляция между экспрессией FOXP3 и RORC2 в цервикальном канале, плодных оболочках и плаценте. Наличие положительной корреляции между FOXP3 и RORC2 представлено также в исследовании Н.П. Логиновой и соавт., в котором продемонстрировано, что в условиях гипоксии при врожденных пороках сердца у новорожденных конкордантно повышается экспрессия FOXP3 и RORC2 в периферической крови [22]. Это повышение ведет к увеличению представительства минорных регуляторных субпопуляций Т-клеток в тимусе (nTreg, Th17 соответственно). Согласно данным A.S. Figueiredo и соавт., клетки Th17 и Treg образуют комплекс и динамические сети для поддержания гомеостаза. Более того, при некоторых обстоятельствах Treg-клетки способны трансдифференцироваться в клетки Th17 и наоборот [21].

Об особенностях экспрессии мРНК RORC2 при доношенной беременности в литературе крайне мало информации (всего 21 источник по данным базы PubMed), все они касаются преимущественно аутоиммунных заболеваний и невынашивания в первом триместре. Наше исследование демонстрирует наличие экспрессии RORC2 в клетках эпителия шейки матки и плаценте примерно у каждой третьей обследованной и практически у каждой второй в плодных оболочках. Мы полагаем, что определение уровня RORC2 при различных осложнениях беременности может иметь в будущем прогностическое значение.

В исследовании J. Lima и соавт. уровень экспрессии FOXP3 в Treg в третьем триместре и в родах был ниже, чем у небеременных женщин и быстро повышался в послеродовом периоде до уровня у небеременных женщин [23]. Это свидетельствует в пользу важной роли Treg в поддержании беременности, а к моменту родов происходит снижение их числа, что способствует запусканию процесса родов. Исследования C. La Rocca и соавт. (2014) показали стабильное соотношение Treg/Th17 при здоровой беременности [9], которое нарушается с преобладанием Th17 при преждевременных родах и преэклампсии [17, 18, 24]. Исследование T. Shima и соавт. (2015) [25] показало, что эффекторные Treg-клетки в децидуальной оболочке наблюдались более чем в 90%, что значительно выше, чем в периферической крови, и высказано предположение, что Treg являются основной популяцией децидуальных Treg-клеток [5]. Сообщается, что количество децидуальных Treg-клеток снижается при повторном невынашивании беременности и преэклампсии, что также указывает на их важную роль в поддержании беременности у человека [5]. Таким образом, высокое содержание Treg-клеток в децидуальной оболочке объясняет феномен вынашивания беременности. Децидуальная оболочка отлично маскирует антигены плодного яйца и в последствии плода. В нашем исследовании отмечено незначительное преобладание FOXP3 (ТФ для Treg) над RORC2 (ТФ для Th17) в тканях плацент и плодных оболочек, таким образом, плацента и плодные оболочки играют важную роль в формировании иммунного окружения для плода. Однако экспрессия FOXP3 выявлена не у всех пациенток, что, вероятнее всего, связано с наличием неких дублирующих механизмов, ответственных за поддержание беременности накануне родов, либо с тем, что необходимость в преобладании Treg-клеток отпала в связи с физиологическим окончанием беременности и подготовкой к родам.

По-видимому, с начала беременности и до родов поддерживается постоянное соотношение этих Т-клеток, и разбалансировка происходит при необходимости изменения клинической ситуации, например, преждевременный разрыв плодных оболочек, либо развитие родовой деятельности. Следует отметить результаты исследования, выполненного A. Areia и соавт. (2015), в которых показано, что у здоровых беременных женщин Treg-клетки экспрессируют рецептор для прогестерона — мембранный рецептор прогестерона. Высказано предположение, что защитный эффект прогестерона в ситуациях преждевременных родов может действовать, активируя распространение Treg-клеток [2].

Относительно Th1 и Th2 долгое время считалось, что перераспределение Т-клеточного ответа во время беременности в сторону Th2 является устойчивым механизмом, ответственным за пролонгирование беременности [2], за дифференцировку которых отвечает GATA3 [26]. Экспрессия GATA3 в нашем исследовании отмечена в 100% изучаемых образцов, ее уровень превышал в количественном соотношении в сотни раз экспрессию других исследованных ТФ. Однако переключение дифференцировки на Th2 происходит в регионарных лимфатических узлах, а не локально в очагах инфекции [1, 5]. GATA3 экспрессируется не только предшественниками лимфоцитов, а также некоторыми другими типами клеток; так он играет важную роль в пролиферации опухолевых клеток при раке молочной железы (при GATA3-положительных вариантах отмечается большая степень дифференцировки клеток и меньшая степень метастазирования), необходим для нормального развития кожи, адипоцитов и клеток нервной системы [20]. Характерным признаком воспаления и пролиферативных процессов в клетках эпидермиса является снижение экспрессии GATA3 [1]. При вагините отмечено снижение транскрипции GATA3, вероятно, связанное с процессами физиологической регенерации вагинального эпителия [15]. При гиперфункции GATA3 говорят о высоком риске развития аллергических реакций [1]. В нашем исследовании мы можем четко сказать, что GATA3 — это ТФ с высокой частотой и уровнем экспрессии, максимально представленный в плаценте и минимально на плодных оболочках, что, видимо, связано с меньшим количеством на плодных оболочках клеток — продуцентов данного ТФ. Высокая частота экспрессии GATA3 позволяет использовать данный ТФ в качестве критерия оценки отклонений от нормы при доношенной беременности, и его повышение будет свидетельствовать в пользу преобладания аллергического компонента, а снижение — о наличии воспалительных реакций [1, 15, 20, 26, 27].

Изучение ролей и регуляции врожденных и адаптивных иммунных клеток в норме при доношенной беременности и их связь в плаценте, плодных оболочках и цервикальном канале важны для понимания тонкого баланса иммунной толерантности матери и плода до момента начала родовой деятельности и запуска каскада иммунологических реакций с началом родовой деятельности.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Каганова М.А., Спиридонова Н.В.

Сбор и обработка материала — Каганова М.А.

Статистический анализ данных — Каганова М.А.

Написание текста — Каганова М.А.

Редактирование — Спиридонова Н.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.