Введение

Эндометриоз — патологический процесс, при котором определяется наличие ткани по морфологическим и функциональным свойствам подобной эндометрию вне полости матки. Несмотря на способность к инфильтративному росту, склонность к рецидивированию, тенденцию к инвазии, эндометриоз относится к доброкачественным пролиферативным заболеваниям. Эндометриозом во всем мире болеет примерно 10% женщин, в основном репродуктивного возраста, 25—50% инфертильных женщин, а у 30—50% женщин с эндометриозом выявлено бесплодие [1].

Одной из основных причин бесплодия у женщин с эндометриозом является истощение овариального резерва. Исследования последних лет подтверждают снижение овариального резерва у пациенток с генитальным эндометриозом вне зависимости от локализации эктопических очагов [2, 3].

Механизм снижения овариального резерва при глубоком инфильтративном эндометриозе (ГИЭ) до настоящего времени не установлен. Развитие и прогрессирование эндометриоза ассоциировано с гормональной дисрегуляцией, нарушением процессов апоптоза и ангиогенеза, что может способствовать формированию патологического фолликулярного микроокружения при данном заболевании и приводить к истощению овариального резерва [4, 5].

Цель исследования — изучить молекулярно-биологические механизмы снижения овариального резерва после хирургического лечения ГИЭ у пациенток репродуктивного возраста.

Материал и методы

Проведено проспективное когортное сравнительное исследование, в которое включено 120 пациенток репродуктивного возраста. Основную группу (группа I) составили 70 женщин, которым проведено хирургическое лечение ГИЭ. Пациентки, у которых выявлено выраженное снижение уровня овариального резерва после хирургического лечения глубокого инфильтративного эндометриоза, составили подгруппу IA (n=30), пациентки без выраженного послеоперационного снижения овариального резерва — подгруппу IB (n=40). В группу сравнения включены 50 фертильных пациенток, которым выполнена пластическая операция на матке.

Хирургическое лечение пациенток основной группы проведено с применением лапароскопического доступа, на оборудованной стойке («Karl Storz, GmbH», Германия) и заключалось в максимальном иссечении очагов ГИЭ. Лапароскопию выполняли в условиях эндотрахеального наркоза по стандартной закрытой методике. При наличии эндометриоидных кист яичников проводили цистэктомию с максимальной энуклеацией стенки кисты в пределах здоровой ткани яичника при помощи мягких атравматичных зажимов. Гемостаз ложа эндометриоидных кист проводили с использованием прецизионной биполярной коагуляции. У всех пациенток интраоперационно с использованием эндоскопических ножниц выполняли инцизионную биопсию коркового слоя неизмененной ткани яичника объемом 0,5 см3.

Протокол исследования обсужден и согласован на заседании локального этического комитета (протокол №5 от 08.10.19), все пациентки подписывали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.

Проведен анализ соматического и гинекологического анамнеза, менструальной и репродуктивной функций, а также особенностей клинической картины заболевания у пациенток обеих групп. У всех пациенток до и через 6 мес после оперативного лечения с целью оценки состояния овариального резерва на 2—5-й дни менструального цикла определяли уровень антимюллерова гормона (АМГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и эстрадиола в крови методом иммуноферментного анализа на иммунохимическом анализаторе Access 2 («Beckman Coulter», США) с использованием реагентов этого же производителя в соответствии с инструкцией, а также подсчет количества антральных фолликулов в яичниках при трансвагинальном ультразвуковом исследовании (УЗИ), выполненном в раннюю фолликулярную фазу на аппарате Voluson 8 («General Electric», США).

Проведено иммуногистохимическое (ИГХ) исследование с определением уровня экспрессии рецепторов к эстрогену (ER1), регуляторов апоптоза (p53, Bcl-2, AKT, PTEN) и ангиогенеза (VEGF R1) в гранулезе фолликулов биоптата яичника, а также в эпителии желез и строме эндометриоидных очагов.

Для ИГХ исследования использовали двухэтапный стрептавидин-биотин-пероксидазный метод с демаскировкой антигена и применением стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител («Bond RTU Primary», США; «DAKO», Дания). Для визуализации первичных антител использовали безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System («Biogenex», США).

Для ИГХ реакций обрабатывали парафиновые срезы по традиционной методике с предварительной демаскировкой антигенов в СВЧ-печи с использованием соответствующих стандартных моноклональных или поликлональных антител.

Экспрессию ER1 определяли с помощью мышиных моноклональных антител к эстрогеновым рецепторам-α (клон 6F-11). Экспрессию ингибитора апоптоза Bcl-2 (B-клеточная лимфома-2) также определяли с помощью мышиных моноклональных антител (клон 100/D5) и оценивали по 3-балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степень). Анализ результатов ИГХ реакций для ER1 и Bcl-2 проводили с использованием метода гистологического счета H-score по формуле:

HS=1a+2b+3c,

где a — доля слабо окрашенных клеток (%); b — доля умеренно окрашенных клеток (%); c — доля сильно окрашенных клеток (%). 1, 2, 3 — интенсивность окрашивания (баллы).

Экспрессию протеинкиназы AKT, фосфатазы PTEN, белка P53 (клон DO-7) и рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR1) определяли по ядерному или мембранному окрашиванию клеток для соответствующих маркеров с оценкой доли окрашенных клеток при увеличении ×400, при этом изучали не менее 10 полей зрения.

Статистическую обработку данных производили с использованием статистического пакета программ Microsoft Excel (2010), SPSS Statistics версия 22.0 («IBM Microsoft», США).

В случае подчинения распределения признака закону нормального распределения данные представляли в виде средней величины (M) и стандартной ошибки средней (m). Проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий количественных признаков в независимых группах осуществляли с использованием процедуры однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). При отклонении распределения признака от закона нормального распределения данные представляли в виде медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (25-го и 75-го процентилей, Р25—Р75). Проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий количественных признаков осуществляли с помощью непараметрического критерия Краскела—Уоллиса (Kruskel—Wallis), при отклонении нулевой гипотезы в ходе анализа проводили попарное сравнение групп. Проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий количественных признаков в зависимых группах (до и после лечения) осуществляли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона, t-критерия Стьюдента для несвязанных совокупностей и парного t-критерия Стьюдента.

Для показателей, характеризующих качественные признаки, указывали абсолютное значение и относительную величину в процентах, проверку статистических гипотез осуществляли с использованием критерия хи-квадрат (χ2). Критический уровень значимости различий (p), при котором нулевая гипотеза об отсутствии различий отвергалась и принималась альтернативная, устанавливали равным 0,025 (критерий Краскела—Уоллиса) и p<0,05 (критерий Вилкоксона).

Оценку статистически значимого снижения овариального резерва у пациенток группы I, позволяющую выделить подгруппы IA и IB, вели с помощью перестановочного критерия и построения доверительных интервалов медианных значений бутстрэпных выборок. Из выборок параметров АМГ и количества антральных фолликулов (КАФ) создано 100 000 выборок методом бутстрэп, и для каждой из них рассчитаны медианы. Для рассчитанных медиан построены 95% доверительные интервалы (ДИ). Для оценки разницы овариального резерва между группами женщин до и после операции рассчитана разница медианных значений групп по обоим показателям. Для показателя АМГ статистически значимая разница составила 0,77 нг/мл, для показателя КАФ — 2. Таким образом, выявление у пациенток группы I разницы между дооперационным и послеоперационным уровнем АМГ ≥0,77 нг/мл либо уровнем КАФ ≥2 позволяло отнести их к подгруппе IA, пациентки с разницей АМГ <0,77 либо КАФ <2 отнесены к подгруппе IB.

Результаты

Средний возраст женщин в группах сопоставим и составил 32,87±5,18 года в основной группе (31,9±4,01 года в подгруппе IA, 33,6±5,85 года в подгруппе IB) и 32,86±3,44 года в группе сравнения, p>0,05. При исследовании антропометрических данных женщин в группах наблюдения статистически значимых отличий не выявлено, средний индекс массы тела у пациенток основной группы составил 22,54±3,57 кг/м2, (21,97±3,15 кг/м2 у женщин подгруппы IA, 22,98±3,83 кг/м2 — подгруппы IB), группы сравнения — 23,40±3,91 кг/м2, p>0,05. Большинство пациенток основной группы (56 (80%) из 70) и группы сравнения (36 (72%) из 50), p>0,05, имели высшее образование.

При оценке характера сопутствующей соматической патологии выявлено, что у 7 (10%) из 70 пациенток с ГИЭ была хроническая анемия, тогда как у пациенток группы сравнения при обследовании анемия не выявлена, p<0,05. Не было различий по частоте выявления анемии между пациентками подгруппы IA (3 (10%) из 30) и IB (4 (10%) из 40), p>0,05. Частота курения среди женщин составила 7 (10,0%) из 70 в основной группе и 5 из 50 (10%) в группе сравнения, p>0,05. Частота курения в подгруппах IA (3 (10%) из 30) и IB (4 (10%) из 40) также статистически значимо не различалась.

Возраст менархе, продолжительность менструального цикла и продолжительность менструального кровотечения сопоставимы в группах и подгруппах, p>0,05. Болезненный характер менструаций наблюдался у 39 (55,7%) из 70 пациенток основной группы, что статистически значимо выше, чем у пациенток группы сравнения — 14 (28,0%) из 50, p<0,05. Не было статистически значимых различий по наличию болезненных менструаций между пациентками с ГИЭ, у которых уровень овариального резерва после операции снизился (14 (46,6%) из 30) и не снизился (25 (62,5%) из 40), p>0,05.

Как минимум одна беременность в анамнезе наблюдалась у 37 (52,9%) из 70 пациенток основной группы, при этом у 29 (41,4%) из 70 она закончилась родами, тогда как 50 (100%) из 50 женщин группы сравнения имели роды в анамнезе (p<0,001). Следует отметить, что всего у 12 (40%) из 30 пациенток с ГИЭ и выраженным послеоперационным снижением овариального резерва были беременности в анамнезе, которые закончились родами у 9 (30%) из 30 женщин, тогда как у пациенток с ГИЭ без выраженного послеоперационного снижения овариального резерва данные показатели составили 25 (62,5%) из 40 и 20 (50%) из 40 соответственно, однако различия не достигли статистической значимости, p>0,05.

Частота медицинских абортов в анамнезе ниже у пациенток с ГИЭ (7 (10,0%) из 70), чем у пациенток группы сравнения (17 (34,0%) из 50), p=0,011. Статистически значимые различия по частоте медицинских абортов в подгруппах IA (6 (20%) из 30) и IB (4 (10%) из 40) не выявлены, p>0,05. Не было статистически значимых различий и по частоте самопроизвольных выкидышей, неразвивающихся и эктопических беременностей у пациенток обеих групп и подгрупп (p>0,05).

Бесплодие выявлено у 34 (48,6%) из 70 пациенток с ГИЭ и у 7 (14,0%) из 50 пациенток группы сравнения (p<0,001). При этом отмечено преобладание первичного эндометриоз-ассоциированного бесплодия (24 (70,6%) из 34) над вторичным (10 (29,4%) из 34). Частота бесплодия была статистически значимо выше у пациенток с выраженным послеоперационным снижением овариального резерва (19 (63,3%) из 30), чем у пациенток без снижения овариального резерва после хирургического лечения ГИЭ (15 (37,5%) из 40), p<0,05.

При оценке гинекологического анамнеза выявлено, что эктопия шейки матки встречалась у 12 (17,1%) из 70 пациенток основной группы и у 2 (4,0%) из 50 группы сравнения, p=0,028. При этом эктопия шейки матки статистически значимо чаще встречалась у женщин подгруппы IB (10 (25%) из 40), чем у женщин подгруппы IA (2 (6,7%) из 30), p<0,05.

У 6 (8,6%) из 70 пациенток ГИЭ сочетался с врожденными пороками развития внутренних половых органов, у пациенток группы сравнения врожденных пороков развития половых органов не было (p=0,034). Миома матки также встречалась чаще у женщин основной группы (21 (30%) из 70), чем у женщин группы сравнения (5 (10%) из 50), p=0,009. Частота выявления врожденных пороков развития половых органов и миомы матки не различалась в подгруппах IA и IB, p>0,05. Статистически значимые различия по частоте выявления других гинекологических заболеваний у женщин обеих групп и подгрупп не выявлены.

Не было статистически значимых различий в частоте хирургических вмешательств на яичниках в анамнезе между пациентками основной группы (17 (24,3%) из 70) и группы сравнения (8 (16,0%) из 50), а также между пациентками подгрупп IA (4 (13,3%) из 30) и IB (13 (32,5%) из 40), p>0,05.

Гистероскопические операции в анамнезе статистически значимо чаще отмечены у женщин основной группы (19 (27,1%) из 70), чем у женщин группы сравнения (6 (12,0%) из 50), p<0,05. В подгруппах IA и IB статистически значимых различий по частоте перенесенных гистероскопий не было, p>0,05. При оценке частоты других гинекологических операций анамнеза статистически значимые различия у женщин групп и подгрупп не выявлены.

Пациентки с наличием ГИЭ значительно чаще жаловались на хроническую тазовую боль (60 (85,7%) из 70), чем пациентки группы сравнения (6 (12,0%) из 50), p<0,001. Пациентки основной группы чаще испытывали диспареунию (14 (20%) из 70), чем пациентки группы сравнения (2 (4%) из 50), p<0,05. Не было статистически значимых различий по частоте встречаемости хронической тазовой боли и диспареунии между пациентками подгрупп IA и IB, p>0,05.

При оценке состояния овариального резерва установлено, что уровень АМГ на дооперационном этапе был статистически значимо ниже у пациенток с ГИЭ (2,4±2,0 нг/мл), чем у пациенток группы сравнения (3,6±2,9 нг/мл), p<0,05. При этом исходный уровень АМГ был статистически значимо ниже у пациенток подгруппы IB (1,7±1,4 нг/мл), чем у пациенток подгруппы IA (3,2±2,4 нг/мл), p<0,05.

Исходный средний уровень ФСГ статистически значимо не различался у пациенток основной группы (8,0±7,5 мМЕ/мл) и группы сравнения (6,8±7,5 мМЕ/мл), а также у пациенток подгрупп IA (7,3±4,5 мМЕ/мл) и IB (8,4±9,1 мМЕ/мл), p>0,05. Отсутствовали статистически значимые различия в среднем уровне эстрадиола в сыворотке крови на дооперационном этапе у женщин основной группы (150,3±123,7 пг/мл) и группы сравнения (168,4±112,5 пг/мл), а также у женщин подгрупп IA (168,9±143,9 пг/мл) и IB (134,9±101,0 пг/мл), p>0,05.

Исходное КАФ по данным трансвагинального УЗИ было ниже у пациенток с ГИЭ (8,0±4,4), чем у женщин группы сравнения (11,9±4,0), p<0,001, и ниже у пациенток подгруппы IB (6,7±3,7), чем у пациенток подгруппы IA (9,9±4,7 нг/мл), p<0,05.

Величина кровопотери, длительность операции, среднее количество и объем иссеченных очагов эндометриоза статистически значимо не различались у женщин подгрупп IA и IB. Средняя балльная оценка тяжести эндометриоза по классификационной схеме Американского общества фертильности AFS/ASRM составила 56,7±20,6 балла у женщин подгруппы IA и 55,9±24,5 балла у женщин подгруппы IB, p>0,05.

Иссечение очагов ГИЭ сочеталось с цистэктомией эндометриомы у 29 пациенток основной группы, в том числе у 13 (43,3%) из 30 пациенток подгруппы IA и у 16 (40%) из 40 пациенток подгруппы IB, p>0,05.

Через 6 мес после хирургического лечения ГИЭ отмечалось статистически значимое снижение уровня АМГ (1,7±1,5 нг/мл) по сравнению с исходным показателем (2,4±2,0 нг/мл), p<0,05 у женщин основной группы. Послеоперационный уровень АМГ у пациенток подгруппы IA составил 1,8±1,5 нг/мл, подгруппы IB — 1,6±1,5 нг/мл.

КАФ по данным УЗИ также статистически значимо снизилось после хирургического лечения ГИЭ (6,6±3,5) по сравнению с исходным показателем (8,0±4,4), p<0,05. Послеоперационное КАФ у женщин подгруппы IA составило 6,3±2,9, подгруппы IB — 6,8±3,9.

Полученные данные свидетельствуют о снижении исходно скомпрометированного овариального резерва у пациенток репродуктивного возраста после хирургического лечения ГИЭ. При этом тяжесть эндометриоза, а также выполнение энуклеации эндометриомы яичника статистически значимо не повлияли на послеоперационное снижение овариального резерва у пациенток с ГИЭ. Открытым остается вопрос, какие именно факторы способствуют послеоперационному снижению овариального резерва после хирургического лечения инфильтративной формы наружного генитального эндометриоза.

Этиопатогенез эндометриоза представляет собой многофакторный процесс, который приводит к развитию чрезвычайно гетерогенного заболевания, характеризующегося утратой одних и приобретением других клеточных функций. Для понимания механизмов, лежащих в основе снижения овариального резерва при ГИЭ, проведено ИГХ исследование образцов гранулезной ткани яичников, а также стромы и желез эктопических очагов с определением экспрессии ER1, p53, Bcl-2, AKT, PTEN и VEGF R1.

По результатам ИГХ исследования выявлено, что экспрессия ER1 в гранулезной ткани яичников пациенток с ГИЭ статистически значимо ниже (1,41±0,57 балла H-score), чем у пациенток группы сравнения (14,83±6,22 балла H-score), p<0,001. При этом у пациенток основной группы с послеоперационным снижением овариального резерва отмечено более выраженное уменьшение экспрессии ER1 в гранулезной ткани яичника (1,17±0,36 балла H-score), чем у пациенток без послеоперационного снижения овариального резерва (1,64±0,86 балла H-score), p<0,05. Несмотря на то, что в строме и железах эндометриоидных очагов экспрессия ER1 была высокой, у пациенток подгруппы IA она была ниже (в строме очага — 54,55±23,61 балла, в железах — 60,09±38,03 балла H-score), чем у пациенток подгруппы IB (в строме очага — 67,90±31,12 балла, в железах — 91,15±56,71 балла H-score), p<0,05.

Экспрессия VEGF R1 в гранулезной ткани яичников статистически значимо не различалась у пациенток с ГИЭ (1,68±0,55%) и пациенток группы сравнения (1,41±1,75%), p>0,05. Однако у пациенток группы I с послеоперационным снижением овариального резерва экспрессия VEGF R1 в гранулезной ткани яичника оказалась выше (1,86±0,75%), чем у пациенток без выраженного послеоперационного снижения овариального резерва (1,48±0,35%), p<0,05. В строме и железах очагов эндометриоза экспрессия VEGF R1, напротив, была ниже у женщин подгруппы IA (1,92±1,41% и 6,82±4,46% соответственно), чем у женщин подгруппы IB (3,32±2,05 и 9,74±5,26% соответственно), p<0,05.

У пациенток с ГИЭ отмечалась более высокая экспрессия p53 в гранулезе яичника (2,77±2,16%), чем у пациенток группы сравнения (1,88±1,12%), p<0,05. При этом у пациенток группы I с выраженным снижением овариального резерва экспрессия p53 в гранулезе яичника была более существенной (3,40±3,16%), чем у пациенток без выраженного послеоперационного снижения овариального резерва (2,12±0,92%), p<0,05. В то же время в очагах эндометриоза отмечено снижение экспрессии p53 у пациенток подгруппы IA как в строме (1,53±0,54%), так и в железах (4,00±1,55%), у пациенток подгруппы IB данные показатели составили 2,18±1,33 и 6,91±5,39% соответственно, p<0,05.

Экспрессия Bcl-2 была ниже в гранулезной ткани яичника у пациенток основной группы (100,21±54,37 балла H-score), чем у пациенток группы сравнения (128,1±63,46 балла H-score), p<0,05. Эта разница более выражена у пациенток подгруппы IA (экспрессия Bcl-2 составила 86,58±44,68 балла H-score), чем у пациенток подгруппы IB (114,29±69,22 балла H-score), p<0,05 (рис. 1 на цв. вклейке). В очагах эндометриоза, напротив, экспрессия Bcl-2 преобладала у пациенток с послеоперационным снижением овариального резерва как в строме очага (79,00±44,84 балла H-score), так и в железах (122,95±55,39 балла H-score), у пациенток группы I без выраженного послеоперационного снижения овариального резерва экспрессия составила 59,36±26,70 балла H-score и 84,73±39,74 балла H-score соответственно, p<0,05.

Рис. 1. Экспрессия Bcl-2 (коричневое окрашивание) в гранулезной ткани яичников пациенток с глубоким инфильтративным эндометриозом.

а — слабая экспрессия Bcl-2 в гранулезной ткани яичников женщин подгруппы IA; б — выраженная экспрессия Bcl-2 в гранулезной ткани яичников женщин подгруппы IB; ×100 (окуляр 10 × объектив 10).

Fig. 1. Bcl-2 expression (brown staining) in ovarian granulosa tissue in patients with deep infiltrative endometriosis.

Экспрессия PTEN, являющегося блокатором антиапоптотического сигнального пути PI3K/AKT/mTOR, была статистически значимо ниже в гранулезной ткани яичника у пациенток с ГИЭ (55,61±25,05%), чем у пациенток группы II (70,31±24,74%), p<0,05. Экспрессия PTEN в гранулезной ткани яичника также была значимо ниже у пациенток подгруппы IA (48,20±22,11%) по сравнению с пациентками подгруппы IB (62,19±28,79%), p<0,05 (рис. 2 на цв. вклейке). В строме и железах эндометриоидных очагов экспрессия PTEN, как и в ткани яичника, была ниже у пациенток подгруппы IA, составив 56,00±28,23 и 40,70±24,06% соответственно, по сравнению с пациентками подгруппы IB, у которых данный показатель составил 73,90±33,93 и 63,21±30,64% соответственно, p<0,05.

Рис. 2. Экспрессия PTEN (коричневое окрашивание) в гранулезной ткани яичников пациенток с глубоким инфильтративным эндометриозом.

а — слабая экспрессия PTEN в гранулезной ткани яичников женщин подгруппы IA; б — выраженная экспрессия PTEN в гранулезной ткани яичников женщин подгруппы IB; ×100 (окуляр 10 × объектив 10).

Fig. 2. PTEN expression (brown staining) in ovarian granulosa tissue in patients with deep infiltrative endometriosis.

Экспрессия протеинкиназы AKT, являющейся центральным компонентом антиапоптотического сигнального пути PI3K/AKT/mTOR, была выше в гранулезной ткани яичника у пациенток основной группы (61,04±15,96%), чем у пациенток группы сравнения (50,6±22,96%), p<0,05. Статистически значимые различия по уровню экспрессии AKT в гранулезной ткани яичников и очагах эндометриоза между пациентками подгрупп IA и IB отсутствовали. Уровни экспрессии ИГХ маркеров в гранулезной ткани яичников и тканях эндометриоидных очагов у пациенток исследуемых групп представлены в табл. 1—4.

Таблица 1. Уровень экспрессии иммуногистохимических маркеров в гранулезной ткани яичников пациенток исследуемых групп

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD); * — различия статистически значимы.

Таблица 2. Уровень экспрессии иммуногистохимических маркеров в гранулезной ткани яичников пациенток с глубоким инфильтративным эндометриозом в зависимости от наличия послеоперационного снижения овариального резерва

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD); * — различия статистически значимы.

Таблица 3. Уровень экспрессии иммуногистохимических маркеров в стромальной ткани эндометриоидных очагов у пациенток с глубоким инфильтративным эндометриозом в зависимости от наличия послеоперационного снижения овариального резерва

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD); * — различия статистически значимы.

Таблица 4. Уровень экспрессии иммуногистохимических маркеров в железистой ткани эндометриоидных очагов у пациенток с глубоким инфильтративным эндометриозом в зависимости от наличия послеоперационного снижения овариального резерва

Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD); * — различия статистически значимы.

Обсуждение

Патогенез эндометриоза до сих пор неясен, однако известно, что он характеризуется эстроген-зависимым ростом эктопического эндометрия и резистентностью к прогестерону [6, 7]. Вместе с тем исследования последних лет демонстрируют пониженную экспрессию как прогестероновых, так и эстрогеновых рецепторов в эутопическом эндометрии пациенток с генитальным эндометриозом. При этом атипичный эндометриоз яичников, обладающий предраковым потенциалом, сопровождается более выраженным снижением экспрессии рецепторов к эстрогену и прогестерону [1, 8]. Более того, M. Sroyraya и соавт. (2018) в своем исследовании установили, что экспрессия эстрогеновых рецепторов (ERa и ERβ) и рецепторов к прогестерону в стенках эндометриомы яичника была статистически значимо ниже, чем в эутопическом эндометрии тех же пациенток и существенно не менялась после терапии препаратами прогестерона [9]. R. Maekawa и соавт. (2019) также выявили снижение экспрессии гена ESR1 в тканях эндометриомы яичника по сравнению с эутопическим эндометрием пациенток с эндометриозом, что ассоциировано с повышением уровня аберрантного метилирования ДНК при наличии эндометриомы яичника [10].

В свою очередь, U. Kalkan и соавт. (2022) в результате ИГХ исследования обнаружили, что экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона, а также белков клеточной адгезии, Т-кадгерина и Е-кадгерина была значительно ниже в очагах ГИЭ, чем в тканях эндометриомы яичника (p<0,0001 для всех маркеров) [11].

В ходе настоящего исследования также выявлено снижение экспрессии рецепторов к эстрогену в гранулезной ткани яичников у пациенток с ГИЭ, наиболее выраженное у пациенток с выраженным послеоперационным снижением овариального резерва. Снижение экспрессии эстрогеновых рецепторов в строме и железах эндометриоидных очагов коррелировало с послеоперационным снижением овариального резерва. Полученные данные свидетельствуют о нарушении дифференцировки стромальных и железистых клеток эндометрия, а также о формировании гормональной резистентности яичников при эндометриозе.

Учитывая, что эндометриоз — пролиферативное заболевание, характерными чертами которого являются способность к инфильтративному росту, отсутствие выраженной капсулы вокруг эндометриоидного очага, прорастание в соседние органы, данное заболевание рассматривают как переходную форму от доброкачественного к злокачественному. Поэтому в последние годы ведется активное изучение механизмов канцерогенеза, в частности снижения способности к апоптозу и неоангиогенеза при эндометриозе, а также их влияния на овариальный резерв [12]. Исследования последних лет демонстрируют повышение экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 и снижение экспрессии проапоптотических белков BAX (Bcl-2-ассоциированного X-белка) и p53, а также кодирующих их генов в стромальной и железистой ткани эндометриоидных очагов [13, 14]. В то же время V. Di Nisio и соавт. (2019) обнаружили повышенный уровень проапоптотических маркеров (p53, транскрипционного фактора NFkB и каспазы 8) в корковой ткани яичников, окружающей эндометриоидные кисты, по сравнению с яичниками здоровых женщин [15]. L. Chen и соавт. (2021) в исследовании, включившем 60 пациенток с бесплодием, в том числе 30 с эндометриоз-ассоциированным бесплодием, изучали механизмы влияния фолликулярной жидкости на апоптоз гранулезных клеток. Выявлены статистически значимые различия уровня экспрессии пяти белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, BAX, CASP3, CASP9 и p53) между фолликулярной жидкостью пациенток с эндометриоз-ассоциированным бесплодием и пациенток контрольной группы с преобладанием проапоптотических факторов при эндометриозе [16].

S. Zhou и соавт. (2021) на мышиной модели продемонстрировали важную роль апоптотического сигнального пути p53-BAX-каспаза-3 в старении яичников. Они показали, что ингибирование фосфатазы WIP1, экспрессия которой снижается с возрастом, ускоряет атрезию примордиальных фолликулов путем активации пути p53-BAX-каспазы-3 [17]. В свою очередь ингибирование гомологов белка p53 защищает функцию яичников, подавляя апоптотические пути, запускаемые противоопухолевой терапией, в частности, циклофосфамидом [18, 19].

Результаты настоящего исследования также указывают на снижение апоптотического потенциала в эндометриоидных очагах и его усиление в гранулезной ткани яичников у пациенток с ГИЭ, особенно выраженное у пациенток с послеоперационным снижением овариального резерва. Полученные данные указывают на ускоренный процесс апоптоза гранулезных клеток при ГИЭ, лежащий в основе снижения овариального резерва при эндометриоз-ассоциированном бесплодии.

Недавно разработанный K. Kawamura метод in vitro активации яичников (IVA) у пациенток с преждевременной недостаточностью яичников подчеркнул важность антиапоптотического сигнального пути PI3K/AKT/mTOR в раннем фолликулогенезе и активации примордиальных фолликулов. Это один из универсальных внутриклеточных сигнальных путей, характерный для большинства клеток человека, который отвечает за уход от апоптоза, рост и пролиферацию клеток [20]. Сверхактивация сигнального пути PI3K/AKT/mTOR приводит к развитию преждевременной недостаточности яичников вследствие ускоренного роста примордиальных фолликулов и раннего их истощения. Ингибирование же данного сигнального пути защищает примордиальные фолликулы от сверхактивации и приводит к сохранению овариального резерва [21, 22]. В последние годы установлено, что активация сигнального пути PI3K/AKT/mTOR инициирует пролиферацию и подавляет апоптоз эндометриоидных клеток, приводя к прогрессированию эндометриоза. В то же время отмечается сверхактивация данного сигнального пути не только в эндометриоидных очагах, но и в корковой ткани яичников при эндометриозе, что сопровождается уменьшением доли примордиальных фолликулов [23]. В свою очередь ингибирование киназного пути PI3K/AKT/mTOR может приводить к подавлению роста эктопического эндометрия и снижению скорости истощения овариального резерва при эндометриозе [24].

Данные, полученные в ходе настоящего исследования, указывают на активацию антиапоптотического сигнального пути PI3K/AKT/mTOR в клетках гранулезы яичников у пациенток с ГИЭ, наиболее выраженную у пациенток с послеоперационным снижением овариального резерва. Настоящие результаты демонстрируют дисрегуляцию процессов апоптоза в корковой ткани яичника при ГИЭ.

Активация сигнального пути PI3K/AKT/mTOR при эндометриозе способствует уклонению от апоптоза и преждевременному истощению примордиальных фолликулов. На фоне повышенной пролиферативной активности, по-видимому, компенсаторно запускается p53-ассоциированный апоптоз гранулезных клеток яичника, что приводит к более выраженному истощению овариального резерва при ГИЭ.

Помимо дисрегуляции апоптоза, в последние годы активно изучается роль патологического ангиогенеза, в частности, его ключевого регулятора —VEGF и его рецепторов в развитии и прогрессировании эндометриоза.

Исследования последних лет демонстрируют повышение уровня VEGF, а также его растворимого fms-подобного рецептора тирозинкиназы 1 (flt-1 или VEGFR-1) в сыворотке крови и клетках эндометрия больных эндометриозом, коррелирующее со стадией заболевания [22, 25].

VEGFR-1 (flt-1) является высокоаффинным рецептором тирозинкиназы для VEGF, при этом биологическая роль VEGFR-1 очень сложна. Несмотря на то, что VEGFR-1 взаимодействует с лигандом с наивысшей аффинностью, предполагают, что он функционирует главным образом в качестве ловушки для VEGF-А, ингибируя VEGF-опосредованную сигнализацию. Однако в последние годы описаны новые функции VEGFR-1, в частности, показаны позитивная регуляция ангиогенеза через активацию протеиназ и экспрессию факторов роста, а также участие в опухолевой прогрессии путем усиления клеточной миграции и инвазии [26].

В отличие от VEGF-A, который воздействует в основном через VEGFR-2, VEGF-B и плацентарный фактор роста (PlGF) связываются и активируются только через VEGFR-1. Первоначальные исследования VEGF-B как члена семейства VEGF были сосредоточены на его роли в ангиогенезе, но позже установили, что VEGF-B напрямую не участвует в неоангиогенезе как в нормальных условиях, так и при сверхэкспрессии. Доказано, что VEGF-B отвечает за защиту клеток от апоптоза, способствуя росту и инвазии тканей [27].

M. Ling и соавт. (2021) продемонстрировали, что VEGF-B проявляет пролиферативную активность через сигнальный путь VEGFR1-PI3K/AKT/mTOR. Таким образом, активация VEGFR1 способна блокировать апоптоз через запуск антиапоптотического сигнального пути PI3K/AKT/mTOR [28].

Активируемая PlGF внутриклеточная передача сигнала может участвовать в хемотаксисе моноцитов, которые в свою очередь также активируют пролиферацию и ангиогенез. У пациенток с эндометриозом обнаружена статистически значимая ассоциация между полиморфизмом rs2268613 гена PLGF и уровнем PLGF в плазме крови [29].

K. Hattori и соавт. (2020) на мышиной модели показали, что активация VEGFR1 стимулирует рост эндометриоидных имплантов и усиление лимфангиогенеза путем опосредованной стимуляции VEGF-C и VEGF-D [30]. Ранее K. Sekiguchi и соавт. (2019) также на мышиной модели продемонстрировали подавление роста эндометриоидных очагов путем блокирования VEGFR1, что доказывает важную роль передачи сигналов через VEGFR1 в прогрессировании эндометриоза [31].

Обнаружена прямая корреляция между уровнем васкуляризации фолликулов по данным допплерометрии и качеством полученных ооцитов в программах экстракорпорального оплодотворения. VEGF является основным регулятором овариального ангиогенеза и фолликулярной оксигенации. W.B. Wu и соавт. (2021) в исследовании с участием 185 пациенток, проходивших процедуру экстракорпорального оплодотворения в протоколе с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона, установили, что интрафолликулярная концентрация VEGF в преовуляторных фолликулах отрицательно коррелирует с уровнем овариального резерва и скоростью созревания яйцеклеток, положительно коррелирует с базальным уровнем ФСГ в сыворотке крови. Повышенная концентрация интрафолликулярного VEGF в преовуляторных фолликулах у пациенток с низким овариальным резервом может возникать компенсаторно в ответ на гипоксию [32].

В ходе настоящего исследования выявлено, что экспрессия VEGF-R1 выше в гранулезной ткани яичника у пациенток со сниженным овариальным резервом после хирургического лечения ГИЭ. Это может свидетельствовать о повышенной пролиферативной активности, ведущей к преждевременной активации примордиальных фолликулов, а также о снижении фолликулярной оксигенации вследствие конкурентного захвата и блокирования VEGF-A в яичниках у данной категории пациенток. В то же время в стромальной и железистой ткани эндометриоидных очагов у пациенток с выраженным послеоперационным снижением овариального резерва экспрессия VEGF-R1 была выше, чем у пациенток без послеоперационного снижения овариального резерва. По-видимому, это связано с преобладанием в эндометриоидных очагах у пациенток данной подгруппы VEGF-A-связанного ангиогенеза.

Заключение

Хирургическое лечение глубокого инфильтративного эндометриоза у пациенток репродуктивного возраста приводит к снижению овариального резерва, исходно скомпрометированного заболеванием. Это проявляется уменьшением уровня антимюллерова гормона в сыворотке крови, а также количества антральных фолликулов в яичниках по данным трансвагинального ультразвукового исследования.

В нашем исследовании снижение овариального резерва после хирургического лечения глубокого инфильтративного эндометриоза ассоциировалось с уменьшением степени дифференцировки эктопического эндометрия и формированием резистентности к эстрогенам в гранулезной ткани яичников, что проявлялось снижением экспрессии рецепторов в этих тканях.

Полученные в ходе исследования данные свидетельствуют о том, что активация антиапоптотического сигнального пути PI3K/AKT/mTOR в гранулезной ткани яичника при глубоком инфильтративном эндометриозе может приводить к преждевременному истощению овариального резерва. В ответ на чрезмерную активность PI3K/AKT/mTOR-киназного пути нами отмечена компенсаторная сенсибилизация клеток коркового вещества яичников к p53-зависимому апоптозу. Таким образом, формируется порочный патогенетический круг, который приводит к ускоренной и необратимой утрате фолликулярного резерва.

Исследование экспрессии рецепторов фактора роста эндотелия сосудов у пациенток с глубоким инфильтративным эндометриозом указывает на усиление ангиогенного потенциала в эктопическом эндометрии и его снижение в гранулезной ткани яичника, ведущее к нарушению фолликулярной оксигенации.

Результаты исследования могут помочь в выборе оптимальной тактики ведения пациенток с глубоким инфильтративным эндометриозом для восстановления их фертильности и успешной реализации репродуктивной функции. На стадии активации только антиапоптотического сигнального пути PI3K/AKT/mTOR хирургическое лечение может стать методом выбора для пациенток с глубоким инфильтративным эндометриозом в аспекте сохранения овариального резерва. На стадии присоединения компенсаторной активации p53-ассоциированного апоптоза методы вспомогательных репродуктивных технологий и банкинг ооцитов могут быть предпочтительнее, так как хирургическое лечение в этом случае несет риск дальнейшего снижения овариального резерва. Будущие исследования должны быть направлены на разработку малоинвазивных тест-систем, способных определять стадии дисрегуляции процессов апоптоза при глубоком инфильтративном эндометриозе.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Мелкозерова О.А., Михельсон А.А., Чистякова Г.Н.

Сбор и обработка материала — Окулова Е.О., Мелкозерова О.А., Михельсон А.А., Гришкина А.А.

Статистический анализ данных — Окулова Е.О., Лимановская О.В., Глухов А.С., Духович А.С.

Написание текста — Окулова Е.О., Мелкозерова О.А.

Редактирование — Мелкозерова О.А., Чистякова Г.Н., Михельсон А.А.

Финансирование исследования проводилось за счет средств федерального бюджета, выделяемых в рамках выполнение федерального государственного задания по научно-исследовательской работе №0056-00128-21-05.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.