Введение

Проблема бесплодия и невынашивания беременности является одной из наиболее актуальных в гинекологии. Известно, что частота выявления патологических изменений эндометрия при бесплодии достигает 88% [1, 2].

Эндометрий человека является важной и специализированной структурой в репродуктивной системе. Основное назначение тканей этого типа — дать возможность эмбриону имплантироваться посредством сложного процесса взаимодействия с тканями материнского организма; истончение эндометрия нарушает эти взаимодействия и приводит к репродуктивным неудачам. T. El-Toukhy и соавт. (2008) определили тонкий эндометрий как эндометрий, толщина которого ниже порога, необходимого для имплантации эмбриона человека [3]. За последние десятилетия выявлены ключевые рецепторы, цитокины, иммунокомпетентные клетки и паттерны белков, вовлеченные в процесс имплантации [4]. Тем не менее они мало применимы в клинической практике и не получили широкого распространения. Одним из перспективных методов является ультразвуковое исследование, однако отечественные и зарубежные авторы в своих работах приводят разные данные о толщине эндометрия в период предполагаемого «имплантационного окна». Одни исследователи считают, что толщина эндометрия менее 8 мм дает минимальные шансы на продуктивное зачатие [2, 5], в то же время другие авторы называют критической толщину эндометрия 7 мм [6]. Тем не менее в ряде исследований выделены общие гистологические признаки для соответствующей ультразвуковой картины: отсутствие предецидуальной реакции стромы, наличие очагов склероза, отсутствие секреторной трансформации желез [7]. У женщин с гипоплазией (тонким эндометрием) во время средней стадии пролиферации обнаруживаются структурные признаки ретардации (отставания в развитии) желез и стромы. На протяжении всей секреторной фазы отмечаются уменьшение общего количества желез, менее интенсивная экспрессия ядрами эпителиоцитов рецепторов эстрогена и прогестерона, уменьшение плотности распределения этих рецепторов в ядрах стромальных клеток. Одновременно фиксируется явное снижение пролиферативной активности ядер эпителиоцитов в составе маточного эпителия и желез [5]. Нарушение рецептивности эндометрия связано с уменьшением и неравномерной экспрессией лейкемия-ингибирующего фактора (leukemia inhibitory factor — LIF) [8]. G. Rosario и соавт. (2014) в исследовании на мышиных моделях установили, что LIF запускает сложный механизм взаимодействий в эндометрии, регулируя имплантацию путем увеличения экспрессии генов, включая гены рецепторов фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor — VEGF) и интегрина [9]. После идентификации маркерных молекул в эндометрии у фертильных женщин и демонстрации их важности для беременности у мышей возник интерес к исследованию функции данных молекул у женщин с репродуктивными неудачами и бесплодием. Продемонстрировано, что женщины с более выраженной экспрессией LIF во время «имплантационного окна» имеют больше шансов наступления беременности по сравнению с женщинами с более низким уровнем экспрессии LIF, что свидетельствует о важности LIF при проведении экстракорпорального оплодотворения. J. Alfer и соавт. (2017) при изучении эндометрия у женщин с тонким эндометрием и бесплодием на протяжении пролиферативной и секреторной фаз установили, что у фертильных женщин секреция LIF в эндометрии в секреторной фазе была в 2,2 раза выше, чем в пролиферативной фазе. У бесплодных женщин не выявлено повышения уровня LIF во время секреторной фазы [4]. Отсутствие морфометрических и иммуногистохимических критериев тонкого эндометрия у женщин с бесплодием определило цель настоящего исследования.

Цель исследования — оценить состояние эндометрия у пациенток с тонким эндометрием и бесплодием на основании морфометрического и микроскопического исследования с учетом выраженности экспрессии рецепторов эстрогена, прогестерона, VEGF, молекулы межклеточной адгезии (CD34), LIF и рецептора LIF (LIFR) в секреторной фазе цикла.

Материал и методы

Дизайн исследования

Исследование имеет дизайн когортного сравнительного исследования с использованием клинико-анамнестических, лабораторных, инструментальных, морфологических, статистических методов.

Критерии соответствия

Критерии включения: бесплодие маточного генеза, обусловленное тонким эндометрием, для основной группы и мужской фактор бесплодия для группы сравнения; наличие показаний к лечению бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий; репродуктивный возраст (18—45 лет); регулярный овуляторный менструальный цикл длительностью 28 дней; соответствующий физиологической норме уровень гормонов гипоталамо-гипофизарной системы, стероидных гормонов яичников, гормонов надпочечников, щитовидной железы; письменное добровольное информированное согласие пациентки на участие в исследовании; для женщин основной группы толщина эндометрия на 20—22-й дни менструального цикла по данным М-эхо менее 8 мм.

Критерии исключения: иные формы бесплодия; тяжелая соматическая патология; прием противомикробных, иммуномодулирующих, гормональных препаратов (стимуляция в программах вспомогательных репродуктивных технологий; прием комбинированных оральных контрацептивов, прогестагенов, агонистов/антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона) в течение последних 3 мес; субмукозная, деформирующая полость матки миома более 40 мм; ВИЧ-инфекция; ановуляторный цикл; злокачественные опухоли любой локализации.

Метод выборки

Метод выборки: сплошной. Способ формирования выборки: пациентки, соответствующие критериям включения, подписавшие согласие на участие в исследовании.

Условия проведения

Проводилось обследование пациенток, обратившихся по поводу бесплодия в кабинет бесплодного брака и гинекологическое отделение ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России (Екатеринбург).

Методы регистрации исходов

Изучали анамнез жизни и заболевания, соматический анамнез, акушерско-гинекологический анамнез. Оценивали менструальную функцию.

Все образцы эндометрия взяты в секреторной фазе цикла методом пайпель-биопсии. При микроскопии в зависимости от площади, занимающей эпителиальный покров, пиноподии характеризовались как изобилующие (более 50% площади), умеренные (от 20 до 50%) и невыраженные (менее 20%). Зрелыми пиноподиями считались высокие (более ¹/₃ высоты клетки) мембранные выросты на апикальной поверхности клеток, незрелыми — невысокие гладкие вертикальные выросты на апикальной поверхности клеток [10].

Микроскопию проводили с учетом выраженности экспрессии рецепторов эстрогена, прогестерона, VEGF, CD34, LIF и LIFR (leukemia inhibitory factor receptor).

Исследование проводилось в стандартных условиях на иммуногистостейнере закрытого типа Bond-maX (Leica, Германия). Использование каждого вида антител сопровождалось постановкой реакций положительного контроля на тех же самых срезах согласно оригинальным инструкциям по их использованию. Количественные исследования выполняли с помощью метода гистологического счета HISTO Score.

Для этого использовали формулу:

HS=1a+2b+3c,

где a — % слабо окрашенных клеток; b — % умеренно окрашенных клеток; c — % выраженно окрашенных клеток; 1, 2, 3 — степень выраженности экспрессии (в баллах).

Экспрессию рецепторов в строме и железах оценивали путем подсчета количества окрашенных клеток в поле зрения при увеличении ×400, при этом изучали не менее 10 полей зрения. Результаты реакции рецепторов эстрогенов и прогестеронов идентифицировали по ядерному или мембранному окрашиванию клеток для соответствующих маркеров с оценкой доли окрашенных клеток и интенсивности их окраски. Экспрессию рецептора VEGF (VEGFR-3) определяли в эпителии, строме эндометрия и эндотелии сосудов. Активность проявлялась в виде окрашивания мембраны и цитоплазмы эпителиальных и эндотелиальных клеток. Экспрессию CD34 оценивали только в эндотелиальных клетках и путем подсчета сосудистых щелей в поле зрения при увеличении ×400 при изучении не менее 10 полей зрения.

Исследование уровня экспрессии LIF как маркера рецептивности эндометрия проводили, используя поликлональные кроличьи антитела (1:150) системы Genentech, Inc. (США). Для оценки выраженности экспрессии рецепторов LIF использовали поликлональные кроличьи антитела (1:100) системы Life Technologies/Invitrogen Corp. (США).

Этическая экспертиза

Все исследования выполнены в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных и медицинских исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 1 апреля 2016 г. №200н «Об утверждении правил надлежащей клинической практики».Протокол исследований одобрен этическим комитетом ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России 2 октября 2017 г.

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics (США), Exel 2007 (Microsoft Corp., США). Для показателей, характеризующих качественные признаки, указывали абсолютное значение и относительную величину в процентах, для проверки статистических гипотез использовали критерий хи-квадрат. Количественные признаки выражали в виде средних значений. Проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий осуществляли с помощью критерия Манна—Уитни.

Результаты

Объекты (участники) исследования

Основную группу составили 34 женщины с бесплодием, обусловленным тонким эндометрием, группу сравнения — 29 здоровых, фертильных женщин. Средний возраст женщин был сопоставимым и составил в основной группе и группе сравнения 34,25±4,02 и 34,22±5,45 года соответственно (p>0,05). Женщины с тонким эндометрием в среднем имели бесплодие в течение 8,75±2,58 года, при этом количество попыток экстракорпорального оплодотворения в группе составляло от 0 до 4 за весь период. Обе группы пациенток не имели статистически значимых различий по макроскопической характеристике образцов эндометрия. При световой микроскопии фибропластическая трансформация стромы в образцах эндометрия женщин основной группы регистрировалась в 73% (n=25) случаев, в образцах эндометрия женщин группы сравнения — лишь в 37,9% (n=11) случаев (p=0,014). Предецидуальная реакция стромы в образцах эндометрия женщин основной группы выражена в 35% (n=12) случаев, группы сравнения — в 68,9% (n=20) наблюдений (p=0,02). Тем не менее не выявлены статистически значимые различия при оценке субнуклеарной вакуолизации различной степени выраженности, которая отмечалась в образцах эндометрия женщин основной группы и группы сравнения соответственно в 35% (n=12) и 27,58% (n=8) случаев (p>0,05). Секреторная трансформация также выявлена во всех исследуемых образцах эндометрия, однако при балльной оценке от 1 до 3 полноценная трансформация и признаки апокриновой секреции регистрировались в 58,8% (n=20) образцов эндометрия женщин основной группы и в 86,2% (n=25) образцов эндометрия женщин группы сравнения (p=0,051). Отек стромы и кровоизлияния различной степени выраженности встречались во всех исследуемых образцах эндометрия. Значительные различия наблюдались при оценке пиноподий (см. таблицу).

Таблица. Частота выявления и степень зрелости пиноподий у женщин с гипоплазией эндометрия

Установлено снижение относительного числа изобилующих пиноподий в образцах эндометрия женщин с бесплодием (p=0,01), в некоторых случаях они отсутствовали. Степень зрелости пиноподий в образцах эндометрия женщин исследуемых групп также различалась: незрелые пиноподии в образцах эндометрия женщин с тонким эндометрием наблюдались почти в 10 раз чаще, а зрелые — почти в 4 раза реже по сравнению с эндометрием фертильных женщин (p<0,001).

У пациенток с тонким эндометрием (менее 8 мм) при иммуногистохимическом исследовании образцов эндометрия отмечено снижение уровня нескольких маркерных молекул, которые считаются критически важными для рецептивности эндометрия.

При оценке экспрессии рецепторов прогестерона клетками стромы в образцах эндометрия женщин группы сравнения среднее количество баллов составило 72,56±12,12 — по сравнению со 126,9±15,60 балла в эндометрии женщин основной группы (p<0,001).

Экспрессия LIF эпителием желез и стромой в образцах эндометрия женщин с репродуктивными нарушениями выражена слабо и составила 106±10,6 балла и 0 баллов соответственно, в то же время закономерно повышена экспрессия LIFR в железах и строме — соответственно 183±20,2 и 111,9±7,8 балла. В образцах эндометрия фертильных женщин экспрессия LIF железами и стромой оценена в 223±18,8 и 170,8±12,6 балла, в то время как экспрессия LIFR в железах и строме снижена и составила соответственно 98,5±9,6 и 78±11,4 балла (p<0,001). В образцах эндометрия женщин основной группы наблюдалось снижение экспрессии VEGFR-3, как клетками желез, так и клетками стромы, она составила 116±12,4 и 26±3,4 балла соответственно, в то время как в образцах эндометрия женщин без репродуктивных нарушений — 224±30,1 и 161±21,3 балла соответственно (p<0,001). Количество капилляров, определяемых по уровню экспрессии маркера CD34, в образцах эндометрия женщин основной группы на одно поле зрения при увеличении ×400 составляло 15±2,7, в то время как в образцах эндометрия женщин группы сравнения число капилляров достигало 36±3,4 (p<0,001).

Обсуждение

LIF играет ключевую роль в контроле ангиогенеза в ворсинах хориона, поскольку человеческие эмбриональные эндотелиальные клетки экспрессируют LIFR, а мыши, у которых отсутствует функциональный ген LIFR, имеют нарушения развития сосудистой сети в плаценте, что ухудшает инвазию трофобласта и ремоделирование спиральных артерий и может приводить к прерыванию беременности. Таким образом, имеется множество доказательств того, что LIF может контролировать ангиогенез в эндометрии и плаценте. LIF может также влиять на экспрессию VEGF в эндометрии человека [11, 12].

Уменьшение экспрессии LIF, по сообщению G. Rosario и соавт. (2014), приводит к нарушению неоангиогенеза [9], что согласуется с полученными данными о снижении экспрессии VEGFR-3 в эндометрии и слабом развитии капиллярной сети у женщин с тонким эндометрием. Ранее I. Miwa и соавт. (2009) отмечали, что патофизиологические особенности тонкого эндометрия включают высокий импеданс кровотока в лучевых артериях матки, плохой рост эпителия, снижение экспрессии VEGF и слабое развитие сосудов [8].

Нехватка VEGF может привести к недостаточному росту кровеносных сосудов у женщин с тонким эндометрием, поскольку, согласно мнению L. Zanetta и соавт. (2000), VEGF способен усиливать экспрессию мРНК и белка фактора Виллебранда в культивируемых эндотелиальных клетках [13].

Это также согласуется с данными О.Ф. Серовой и соавт. (2015), свидетельствующими о том, что в тонком эндометрии уменьшается экспрессия VEGF, следствием чего является недостаточное образование сосудов. В слизистой оболочке полости тела матки наблюдается неравномерная васкуляризация с преобладанием изолированных капиллярных трубочек с незначительным ветвлением без слияния их в сосудистые сети (отсутствие ангиогенеза) [7].

Резюме основного результата исследования

Фибропластическая трансформация стромы у женщин с тонким эндометрием и бесплодием регистрировалась практически в 2 раза чаще по сравнению с фертильными женщинами. Также у женщин с тонким эндометрием и бесплодием установлено статистически значимое снижение относительного числа и степени зрелости пиноподий. При иммуногистохимическом исследовании у женщин с тонким эндометрием выявлено снижение уровня экспрессии рецепторов прогестерона клетками стромы на 43%, а также снижение уровня экспрессии VEGFR-3 на 48% и 84% соответственно клетками желез и клетками стромы. Количество капилляров в поле зрения в образцах эндометрия женщин с тонким эндометрием снижено в 2 раза. Дефицит рассматриваемых маркерных молекул убедительно подтверждает гипотезу о том, что нарушения ангиогенеза, приводящие к недостаточной секреторной трансформации и истончению эндометрия, могут стать одной из причин бесплодия. Необходимы дальнейшие исследования для выявления основных регуляторных механизмов, участвующих в данном процессе.

Ограничения исследования

Исследование ключает в себя относительно небольшой объем выборки и ограниченный набор антител.

Выводы

У женщин с тонким эндометрием и бесплодием установлено следующее: снижение площади покровного эпителия с пиноподиями с преобладанием их незрелых форм; умеренно сниженная экспрессия рецепторов эстрогена клетками стромы; уменьшение экспрессии LIF и увеличение экспрессии LIFR железами и стромой; снижение уровня экспрессии VEGF и CD34. Это свидетельствует о нарушениях рецептивности эндометрия и процессов неоангиогенеза, впоследствии приводящих к уменьшению толщины эндометрия и неполноценной инвазии цитотрофобласта.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Чистякова Г.Н.

Сбор и обработка материала — Гришкина А.А., Ремизова И.И., Михельсон А.А., Данькова И.В.

Статистический анализ данных — Гришкина А.А., Ремизова И.И.

Написание текста — Гришкина А.А.

Редактирование — Ремизова И.И.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.