Под овариальным резервом понимают функциональное состояние яичников, которое определяет способность последних к развитию фолликула с полноценной яйцеклеткой и адекватному ответу на овариальную стимуляцию. Овариальный резерв отражает количество находящихся в яичниках фолликулов (примордиальный пул и растущие фолликулы) и зависит от большого количества физиологических и патофизиологических факторов [1, 2].

Несмотря на бесспорное скрининговое значение определения ультразвуковых параметров и уровня антимюллерова гормона в сыворотке крови в оценке состояния овариального резерва, гистологическое исследование обладает большей информативностью в этом отношении, прежде всего, в связи с тем, что даже при малых размерах биоптата возможна детекция раннего фолликулярного роста (фолликулы до 2 мм в диаметре), что невозможно при ультразвуковом и гормональном исследованиях. Биопсия яичников может применяться в изучении истинного овариального резерва, позволяя получить необходимые данные о состоянии фолликулярного аппарата, и является информативным методом изучения состояния овариальной ткани [3].

Впервые прикладное значение гистологического исследования биоптатов яичников продемонстрировано группой исследователей во главе с K. Kawamura, использующих его как определяющий этап хирургического лечения, обосновывающий необходимость выполнения реимплантации фрагментированной овариальной ткани [4]. Так, изучение гистологической структуры ткани, которая подвергается механической активации, вносит вклад в понимание строения ткани яичника у пациенток со сниженным овариальным резервом, находящихся на заместительной гормональной терапии, а также позволяет выявить взаимосвязь между особенностями морфологических структур, представленных в объеме исследуемой ткани яичника и репродуктивными исходами.

Цель исследования — изучить гистологическое строение яичниковой ткани при сниженном овариальном резерве, а также выявить клинико-морфологические параллели между результативностью лечения бесплодия, морфологической структурой овариальной ткани и эндометрия и уровнем экспрессии белков PTEN, YAP, MST-1 и LATS-1 в них.

Материал и методы

Исследовано состояние овариального резерва и эндометрия у 14 пациенток репродуктивного возраста с бесплодием, резистентным к стандартным методам лечения, включая вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ). Пациентки не имели предшествующих операций на яичниках в анамнезе и получали заместительную гормональную терапию (эстрадиола валерат 2 мг+дидрогестерон 10 мг) в течение 2—3 менструальных циклов до операции. Всем пациенткам рекомендовано проведение программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) с использованием донорских ооцитов как единственно возможного варианта достижения беременности.

Всем обследованным после получения информированного добровольного согласия на участие в исследовании выполнено оперативное вмешательство в объеме: лапароскопия, ревизия органов малого таза, специфическое определение зоны биопсии яичниковой ткани с учетом минимальной васкуляризации и достаточной толщины, иссечение участка коркового слоя в области верхнелатерального полюса обоих яичников с последующей его фрагментацией и одноэтапной реимплантацией в толщу яичника, гистероскопия, биопсия эндометрия, хромогидротубация [5, 6].

После оперативного вмешательства всем пациенткам проведена стимуляция функции яичников.

Все образцы ткани подвергались обработке согласно стандартному гистологическому протоколу. Гистологическое исследование биоптатов яичников выполняли в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России в 1-м патологоанатомическом отделении (зав. отд. — д.м.н. А.В. Асатурова) с помощью микроскопа Axio Scope A1 («Karl Zeiss», Германия).

Иммуногистохимическое исследование проведено с использованием биомаркеров LATS1 (клон ab39250, RTU, «Abcam», США), MST1 (клон phosphor Thr183, «Abcam», США), YAP (клон D8H1X XP, «Abcam», США) и PTEN (клон A2B1, «Abcam», США) по стандартной методике на автоматическом иммуногистостейнере Ventana Benchmark Ultra («Roche», Швейцария) в 28 образцах ткани яичников. Все препараты оцифрованы с помощью сканирующего микроскопа Aperio («Leica», Германия). Подсчет экспрессии осуществлялся количественным методом с использованием программного обеспечения ImageJ (открытый доступ), вычисление интенсивности экспрессии оценивалось с помощью определения оптической плотности и измерялось в условных единицах (УЕ), от 0 до 255. Для унификации полученных результатов количественная оценка экспрессии ранжирована и переведена в балльную систему (от 0 до 3 баллов, где оптической плотности 0 УЕ соответствовала интенсивность экспрессии 0 баллов, 1—20 УЕ — 1 балл (слабая экспрессия), 20—60 УЕ — 2 балла (умеренная экспрессия), 60 УЕ и более — 3 балла (сильная экспрессия) в соответствии с данными D. Fuhrich и соавт. [7].

Результаты

Данное исследование направлено на детальное изучение гистологического строения яичниковой ткани при сниженном овариальном резерве, а также на выявление клинико-морфологических параллелей между результативностью лечения бесплодия, морфологической структурой овариальной ткани и эндометрия и уровнем экспрессии белков PTEN, YAP, MST-1 и LATS-1 в них. Помимо характерных различий в макроскопической картине ткани яичников, определяемых интраоперационно, выявлен ряд гистологических и иммуногистохимических особенностей состояния овариальной ткани у обследуемых пациенток.

Определяли степень экспрессии белков Hippo-сигнального пути (YAP, MST-1, LATS-1) и ингибитора фосфоинозитол-3-киназного сигнального пути — PTEN в ткани яичников. Отмечен следующий уровень экспрессии: YAP от 6,11 до 42,06 УЕ (0—2 балла); MST-1 от 8,18 до 45,85 УЕ в строме (0—2 балла); LATS-1 24-75,44 УЕ (2—3 балла). Экспрессия PTEN составила 14,79-58,09 (1—2 балла) УЕ. Обращает на себя внимание «асимметричная» экспрессия в пределах парных образцов овариальной ткани в пользу одного из яичников. При этом разница в экспрессии всех изучаемых иммуногистохимических маркеров статистически значима (p<0,05) (см. рисунок на цв. вклейке).

Экспрессия маркеров PI3K/Akt/mTOR и Hippo-сигнальных путей в корковом веществе яичника с сохраненным поверхностным эпителием яичника и отсутствием стигм фолликулогенеза.

а — окраска гематоксилином и эозином, ×200; б — экспрессия LATS1, ×200; в — экспрессия PTEN, ×200; г — экспрессия MST1, ×200; д — экспрессия YAP, ×200.

Expression of markers PI3K / Akt / mTOR and Hippo-signaling pathways in the cortical layer of the ovary with preserved superficial epithelium and the absence of folliculogenesis stigmas,

Морфологическая оценка яичниковой ткани у пациенток с наступлением самопроизвольной беременности показала наличие стигм фолликулогенеза различной степени давности: скопление текалютеинизированных клеток и наличие фиброзных тел в образцах коркового слоя обоих яичников. При этом поверхностный эпителий яичников определялся на площади от 5 до 10%, а количество сосудов на единицу объема коркового слоя яичников — от 0 до 3. Уровень экспрессии тканевых маркеров составлял 1—2 балла.

При гистологическом исследовании биоптатов яичников у пациентки с неразвивающейся беременностью в сроке 8—9 нед отмечено наличие фолликулярного аппарата в образце одного из яичников с представленностью поверхностного эпителия яичников на малой (5%) площади и низкой выраженностью сосудистого компонента (3—4 сосуда на единицу объема биоптата). При этом степень экспрессии описанных выше белков характеризовалась как низкая (1 балл = до 10 УЕ).

Проведенный анализ морфологической структуры эндометрия в соответствии с разделением групп пациентов и результатами комплексного лечения бесплодия показал, что у 11 (78,5%) из 14 пациенток, которым проведена стимуляция функции яичников в рамках программы ЭКО, отмечен фолликулярный рост. При этом нормальная структура эндометрия определена у 10 (71,4%) из 14 женщин. Изменения эндометрия, соответствующие хроническому эндометриту, выявлены у 4 (28,5%) из 14 пациенток. У 3 (21,5%) из 14 пациенток с отсутствием фолликулярного роста на фоне стимуляции функции яичников выявлена следующая морфологическая структура эндометрия: эндометрий, соответствующий фазе менструального цикла, определен у 1 (33,3%) пациентки, хронический эндометрит — у 2 (66,6%).

Следует отметить, что состояние эндометрия у пациенток при наступлении беременности характеризовалось соответствием его гистологической структуры дню менструального цикла во всех случаях.

В результате комплексного лечения бесплодия с использованием одноэтапного хирургического метода активации функции яичников к настоящему моменту беременность наступила у 10 из 70 пациенток, включенных в исследование, период послеоперационного наблюдения которых составляет от 14 дней до 1,5 лет (исследование продолжается).

При сопоставлении полученных данных иммуногистохимического исследования с морфологической характеристикой яичниковой ткани выявлены следующие закономерности: при визуализации поверхностного эпителия яичников на площади поверхности исследуемого образца равной >20% отмечены статистически значимо более высокие значения экспрессии ранее описанных белков Hippo-сигнального пути, которые приближаются к минимально отмеченным значениям при отсутствии морфометрической визуализации поверхностного эпителия яичников.

При соотнесении данных степени выраженности сосудистого компонента в строме коркового слоя яичников с уровнем экспрессии тканевых маркеров корреляционная взаимосвязь не выявлена.

Наличие стигм функциональной активности обратно коррелирует с уровнем экспрессии белков YAP, PTEN, LATS-1, MST-1. При этом данная ассоциация является статистически значимой (p<0,05). В образцах коркового слоя яичников без визуализации стигм функциональной активности (фолликулярного аппарата, белых и фиброзных тел, инклюзионных кист и др.) отмечается наибольший уровень экспрессии, достигающий 3 баллов.

Определены различия в степени экспрессии белков в зависимости от исходов лечения бесплодия. Всем описанным пациенткам проведена стимуляция функции яичников в послеоперационном периоде.

В отсутствие ответа на стимуляцию функции яичников уровень экспрессии тканевых маркеров характеризуется статистически значимо более высоким уровнем, при этом ответ на стимуляцию отмечается в том яичнике, в образце которого при иммуногистохимическом исследовании степень экспрессии ниже.

У 5 пациенток, у которых наступила беременность в результате комплексного лечения бесплодия с использованием хирургического метода активации функции яичников, уровень экспрессии отмеченных белков был статистически значимо ниже, чем у пациенток без наступления беременности в исходе лечения бесплодия (p<0,05), и характеризовался следующими показателями: YAP от 16,46 до 30,45 УЕ (1 балл), MST-1 — 15,74—29,18 УЕ (1 балл), LATS-1 — 24—53,67 УЕ (1—2 балла), PTEN — 14,79—32,65 УЕ (1—2 балла). При этом наибольшие различия в показателях отмечены в экспрессии PTEN.

При специальном сравнительном анализе показателей, определяющих гистологическое строение ткани яичников у пациенток со сниженным овариальным резервом, нами установлены морфометрические особенности овариальной ткани, коррелирующие с таковыми в ткани эндометрия. Однако отсутствует статистически значимая корреляционная связь между экспрессией тканевых маркеров, определяемых иммуногистохимическим методом, в тканях яичников и эндометрия.

Обсуждение

Известно, что фолликулогенез — это сложный биологический процесс, участие в котором принимают сразу несколько независимо регулируемых сигнальных путей. Среди многих регуляторов определена критическая роль PI3K/Akt/mTOR сигнального пути [8]. Его функционирование ингибируется фосфатазой PTEN и комплексом туберозного склероза (TSC1/2). Делеция PTEN или TSC1/2 у мышей вызывает сверхэкспрессию Akt и/или mTOR и, следовательно, фосфорилирование нижележащего рибосомного белка S6 (rpS6) в ооците, что приводит к массивной и преждевременной активации пула примордиальных фолликулов [9—13]. Ряд экспериментальных исследований показал, что передача сигналов по Hippo-пути также играет решающую роль в активации фолликулярного роста [14]. Путь Hippo был идентифицирован как главный супрессор чрезмерного роста тканей [15]. Передача сигналов по нему происходит через каскад серин/треониновых протеинкиназ, включающий в себя киназу-супрессор опухолей (LATS1/2), Ste-20-подобную киназу млекопитающих (MST1/2), адаптер Salvador (Sav) и связывающие белки Mps one (Mob), которые препятствуют доступу к ядру ключевых эффекторов белка YAP (Yes-associated protein) посредством фосфорилирования и цитоплазматического удержания. При фрагментации овариальной ткани нарушается функционирование сигнального пути Hippo, что приводит к транслокации нефосфорилированного YAP в ядро для взаимодействия с транскрипционными факторами, в том числе регулирующими процессы апоптоза [16]. Культивирование ткани яичников в присутствии ингибитора PTEN и/или активатора PI3K вызывает массивную инициацию роста примордиальных фолликулов [17, 18]. Также была продемонстрирована критическая роль Lats1/2 в реализации функционирования клеток гранулезы, в том числе под влиянием данных ключевых факторов [19]. Таким образом, хирургическая активация приводит к реализации эффектов сигнальных путей PI3K/Akt/mTOR и Hippo на рекрутинг и рост фолликулов у пациенток со сниженным овариальным резервом [14, 20].

Наше исследование демонстрирует, что у пациенток со сниженным овариальным резервом действительно существует субстрат для последующего влияния механизмов активации в части дефектов сигнальных путей PI3K/Akt/mTOR и Hippo, в связи с чем нами были выбраны ключевые компоненты данных сигнальных путей — белки LATS1, MST1, YAP и PTEN. Принимая во внимание вышеописанные закономерности, ожидаемым был результат обратной пропорциональности между наличием стигм функциональной активности и уровнем экспрессии белков YAP, PTEN, LATS-1, MST-1. Факт повышенной экспрессии всех выбранных компонентов говорит о тотальном нарушении обоих сигнальных путей у пациенток с отсутствием стигм фолликулогенеза и необходимостью снижения уровня всех компонентов для успешной хирургической активации. С этой же точки зрения можно объяснить взаимосвязь между сохранением поверхностного эпителия яичников, стигмами фолликулогенеза и экспрессией белков YAP, PTEN, LATS-1, MST-1. Первостепенным, на наш взгляд, является невозможность рекрутинга и роста фолликулов в отсутствие нормального функционирования PI3K/Akt/mTOR и Hippo-сигнальных путей. Отсутствие овуляции не позволяет поверхностному эпителию яичника сохранять физиологическую пластичность, не потенцирует его репаративное восстановление с обретением эпителиальных или мезенхимальных фенотипических свойств, что присуще данному типу ткани в овуляторном менструальном цикле.

Таким образом, нарушение экспрессии путей PI3K/Akt/mTOR и Hippo ведет к изменению процесса созревания фолликулов, циклических изменений поверхностного эпителия яичников и образования стигм фолликулогенеза. В предыдущих работах мы показали прямую взаимосвязь данных признаков с результатами стимуляции функции яичников и наступлением беременности [21].

Выводы

Выявлены клинико-морфологические параллели между гистологической структурой яичниковой ткани и эндометрия, экспрессией тканевых маркеров в них, выявленной при иммуногистохимическом исследовании, и результативностью стимуляции функции яичников у пациенток со сниженным овариальным резервом.

Наличие фолликулярного аппарата и/или стигм функциональной активности при морфологическом исследовании статистически значимо коррелирует с результативностью стимуляции функции яичников и уровнем экспрессии изучаемых белков, определенных при иммуногистохимическом исследовании.

При наличии ответа на овариальную стимуляцию фолликулярный рост определяется в том яичнике, в образце которого гистологически выявляют стигмы функциональной активности, а экспрессия белков Hippo-сигнального пути, обнаруженная при иммуногистохимическом исследовании, характеризуется как низкая.

Наличие поверхностного эпителия яичников на большей площади поверхности (>20%) исследуемого образца ткани яичника положительно коррелирует с уровнем экспрессии кандидатных белков.

При сравнительном анализе показателей состояния эндометрия с патоморфологической оценкой строения яичника выявлены статистически значимые параллели, что свидетельствует о функциональной взаимосвязи овариальной ткани и слизистой оболочки тела матки у пациенток с бесплодием при сниженном овариальном резерве. Однако отсутствует статистически значимая корреляционная связь между экспрессией тканевых маркеров, определяемых методом иммуногистохимического исследования в тканях яичников и эндометрия, что может быть связано с объемом выборки пациенток, включенных в исследование.

При сопоставлении данных оценки состояния эндометрия и морфологической структуры яичников с результатами комплексного лечения бесплодия с использованием хирургических технологий выявлена статистически значимая разница состояния эндометрия в зависимости от наступления беременности. Необходимо отметить нормальную морфологическую характеристику состояния эндометрия, соответствующего фазе менструального цикла, у всех пациенток, достигших беременности в ходе комплексного лечения бесплодия, включающего одноэтапный хирургический метод активации функции яичников.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.