Несмотря на многочисленные исследования этиологии и патогенеза эндометриоза, природа этого патологического состояния остается неизвестной. Кроме этого, клиническая, воспалительная, иммунологическая, биохимическая, гистохимическая и генетически-эпигенетическая гетерогенность сходных по виду поражений при эндометриозе является сложной задачей для исследований. Исследователями предлагается объединение клинических, биохимических и гистохимических данных с молекулярно-биологическими путями и генетически-эпигенетическим анализом поражений [1].

Консолидированное мнение авторов обзора, посвященного уточнению особенностей возникновения, течения и диагностики различных форм эндометриоза у подростков, свидетельствует о том, что эти данные единичны и не систематизированы. Кроме этого, делается вывод о необходимости изменения общепринятых взглядов на проблему эндометриоза как «взрослой» болезни, предлагается расширить и ускорить поиск основ патологического процесса у девочек для своевременного выбора наиболее корректного лечебного подхода [2].

Однако самые современные методы анализа, включая последние достижения в области омиксных технологий, с помощью либо геномного, либо протеомического подхода привели к тому, что многие регуляторные молекулы в эндометрии во время рецептивной фазы менструального цикла изменяются: интегрин αvβ3, LIF, gp130, белки теплового шока, HB-EGF, муцины, аннексин А и аннексин IV и многие другие, но однозначный рецепторный маркер еще не определен [3]. Нет такого маркера и для диагностики эндометриоза [4]. Это может быть прежде всего связано с тем, что гликозилированные формы этих белков в эндометрии не изучались, но именно они имеют большое физиологическое значение в регуляции репродуктивной функции [3].

Вазоактивный интестинальный пептид (VIP) является выдающимся нейропептидом, проявляющим широкий спектр биологической активности у млекопитающих, включая человека. В том числе VIP обладает свойствами локального нейромодулятора, выделяемого кишечными нейронами, что, в свою очередь, активирует глюконеогенез кишечника как ключевой процесс в регуляции глюкозы и баланса энергии [5]. Имеются данные о его роли в возникновении воспаления микроокружения при эндометриозе [6]. Тем не менее клиническое применение VIP в основном затруднено из-за его быстрой деградации in vivo. Процедура пептидного гликозилирования часто используется для повышения устойчивости к протеолитической деградации и, следовательно, повышения метаболической стабильности пептида. Однако механизмы, участвующие в гликозилировании первого рецептора VIP (VIPR1), который достигает клеточной поверхности, и контроле качества членов семейства GPCR (G protein-coupled receptors), неизвестны. Ранее показано наличие трех сайтов N-гликозилирования в структуре VIPR1 [7].

Гликозилирование VIP-лиганда к VIPR1 потенциально может увеличить его сродство к рецептору из-за глико-глико-взаимодействия между лигандом и рецептором. Показано, что для улучшения метаболической стабильности VIP и увеличения связывания/активации его с рецептором успешно синтезированы восемь гликозилированных производных VIP. Каждый аналог VIP был моногликозилирован моносахаридом путем добавления к одному аминокислотному остатку. Гликозилирование не влияло на альфа-спиральную структуру VIP по отношению к нативному белку. Гликозилированные аналоги VIP обладали высокоэффективным связыванием с VIPR1 при цАМФ-индуцированной активации, при этом показано значительное повышение их устойчивости к ферментативному расщеплению трипсином по сравнению с нативным VIP. Следовательно, VIP-гликозилирование может приводить к его повышенной метаболической стабильности [8].

Молекулярная масса белка ENPP3 составляет 100 кДа. Он является ферментом, членом семейства 3 эктонуклеотид пирофосфатазы/фосфодиэстеразы и кодируется геном ENPP3. Однако при вестерн-блоттинг (WB) анализе на электрофореграмме обнаружена полоса с более высоким молекулярным весом — около 165 кДа, которая представляет собой гликозилированную форму. Подтверждено, что эта высокомолекулярная полоса является гликозилированной формой ENPP3, так как обработка образцов эндометриальной ткани с помощью N-Glycosidase привела к потере полосы 165 кДа на электрофореграмме при WB и наличию полосы 100 кДа. Экспрессия ENPP3 в ткани эндометрия во время рецептивной фазы менструального цикла у фертильных женщин имела сходную картину с гликозилированной формой ENPP3 [3]. Работа H. Korekane и соавт. показывает, что ENPP3 может или увеличивать, или уменьшать активность гликанов, которые присутствуют как в эндометрии, так и в секрете матки, играя важную роль в регуляции фертильности [9]. Следовательно, гликозилирование белков при целом ряде патологических состояний, включая эндометриоз, может играть существенную роль в биологических и функциональных эффектах на системном и локальном уровнях, в частности в эндометрии. К сожалению, эти факты практически не отражены в литературе, а единичные публикации не позволяют достоверно определить их роль.

Цель исследования — изучить изменения гликозилирования белков VIPR1 при эндометриозе в сочетании с хронической тазовой болью.

Материал и методы

Основная группа. Под наблюдением находились 58 женщин в возрасте 27—37 лет с перитонеальной формой эндометриоза I—III стадии согласно классификации Американского общества репродуктивной медицины (rASRM), установленного во время проведения лапароскопии, как это описано нами ранее [6]. Больные распределены на две группы: без наличия признаков хронической тазовой боли (22 пациентки) и с наличием признаков хронической тазовой боли (36 пациенток).

Сравнительная группа. В группу включены 10 женщин репродуктивного возраста с глубоким инфильтративным эндометриозом и хронической тазовой болью, как это описано нами ранее [10]. Дополнительно включены 5 девочек-подростков в возрасте 14—16 лет с перитонеальной формой эндометриоза и хронической тазовой болью. Диагноз эндометриоза подтвержден во время проведения лапароскопии [10].

Контрольная группа — 25 пациенток, которым произведена стерилизация с использованием лапароскопического доступа. Эндометриоз у пациенток этой группы исключали после исследования висцеральной и париетальной брюшины на наличие гетеротопических эндометриоидных очагов, как это описано ранее [6].

Дизайн исследования. Выполнено ретроспективное одномоментное исследование, одобренное этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Информированное согласие на участие в исследовании и использование ткани эндометрия получено от всех пациенток. Рандомизация и рекрутинг больных основной группы осуществлялись совместно с д.м.н., проф. А.С. Гаспаровым, д.м.н. Н.И. Волковым, д.м.н. Т.Е. Самойловой, д.м.н. Е.Д. Дубинской, д.м.н. Е.А. Межевитиновой, д.м.н. А.В. Лединой, к.м.н. М.А. Шороховой, к.м.н. М.Ф. Дорфманом, к.м.н. Н.С. Щетининой, к.м.н. А.С. Онищенко, врачом О.М. Векилян, врачом К.Р. Набиевой; сравнительной группы — с д.м.н., проф. Л.В. Адамян, д.м.н., проф. Е.В. Уваровой, к.м.н. В.Д. Чупрыниным, д.м.н., проф. Е.Г. Хилькевич.

Характеристика образцов ткани. Образцы эутопического и эктопического эндометрия получены, как это было описано нами ранее [6]. Верификацию гистологических диагнозов в эутопическом и эктопическом эндометрии осуществляли в Академической больнице г. Уппсала, Швеция. Образцы эктопического эндометрия при перитонеальной форме эндометриоза у исследуемых основной и сравнительной групп содержали эндометриальный железистый эпителий, окруженный клетками стромы и сосудами. При глубоком инфильтративном эндометриозе у пациенток сравнительной группы выявлена фиброзная ткань с включением сосудов, отдельных немногочисленных компонентов эндометриального железистого эпителия и стромы.

Сокращения названий обследованных групп для исследования тканей: ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контроль, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью.

Иммуногистохимический анализ. Иммуногистохимическое окрашивание эутопического и эктопического эндометрия проводилось в условиях стандартного протокола, как это описано нами ранее [6]. Неспецифического окрашивания не было. Серия образцов изучена как минимум дважды.

Экспрессия VIPR1 и VIP в тканях эутопического и эктопического эндометрия. Оценку результатов экспрессии в эутопическом и эктопическом эндометрии для VIP осуществляли в сосудах, VIPR1 — в сосудах, железистом эпителии, клетках стромы. Для визуализации применяли поликлональные антитела к VIP (AB982; EMD Millipore Corp., США) с системой EnVision G|2 System/AP, Permanent Red (Dako/Agilent Technologies, Дания/США); для VIPR1 — кроличьи моноклональные антитела (SP234, Sigma-Aldrich Corporation, США). Интенсивность иммуногистохимического окрашивания в баллах (SCORE) оценивалась в 5 предлежащих областях при увеличении ×400: 0 — сравнима с негативным контролем, 1 — при слабом окрашивании (едва видно, но не более), 2 — между слабым и сильным окрашиванием, 3 — сильное окрашивание. Уровень SCORE не зависел от экспериментальных данных.

Оценка плотности VIP в тканях эутопического и эктопического эндометрия. Определение плотности VIP в эктопическом и эутопическом эндометрии проводили, как описано ранее [6], в стандартных условиях с использованием иммуногистохимического метода и последующей цифровой обработкой данных с помощью программы Image-Pro Plus. Для визуализации микрососудов использовали кроличьи поликлональные антитела к VIP (AB982; EMD Millipore Corp., США) с системой визуализации EnVision G|2 System/AP, Permanent Red (Dako/Agilent Technologies, Дания/США) в соответствии с рекомендациями производителя. Показатель плотности VIP выражали как среднюю интенсивность окрашивания: ×% от площади на мм².

Проведение вестерн-блоттинг (WB) анализа для VIPR1 и VIP. Суммарный белок из эутопического эндометрия женщин контрольной группы, эутопического и эктопического эндометрия больных с эндометриозом без боли и с болью, сравнительной группы с болью выделяли и анализировали, как это описано нами ранее [6]. Использовали образцы белка в концентрации 20 мкг, предварительно окрашенный стандартный белок SeeBlue Plus2 (Thermo Fisher Scientific, США) и положительный контроль VPAC1 (h): лизат 293 т: sc-116969, Biotechnology Inc., США, а для VIP — положительный контроль: SK-N-SH Cell Lysate (sc-2410 Biotechnology Inc., США). Применяли: для VIP — поликлональные антитела (AB982; EMD Millipore Corp., США); для VIPR1 — кроличьи моноклональные антитела (SP234, Sigma-Aldrich Corporation, США), для Actinβ (C4) — мышиные моноклональные антитела (sc-47778, Biotechnology Inc., США). Анализ электрофореграмм проводили с помощью Image Studio Lite Software производства LI-COR Biosciences, США. Проведение вестерн-блоттинга осуществляли совместно с E. Davey.

Проведение дегликозилирования нативных белков, полученных из эутопического и эктопического эндометрия. Суммарный белок из эутопического эндометрия женщин контрольной группы, эутопического и эктопического эндометрия больных с эндометриозом без боли и с болью, сравнительной группы с болью выделяли и анализировали, как это описано нами ранее [6]. Полученные образцы стандартизовали по содержанию белка и проводили дегликозилирование, как это описано ранее [3]. Лизаты тканей эндометрия подвергали мягкой денатурации в присутствии 0,2% поверхностно-активного вещества SF Rapigest (Waters, 186001861) и DTT (5 мМ) 5 мин при 95°C. Добавляли йодацетамид (15 мМ) и инкубировали в течение 30 мин в темноте, ферментативное расщепление осуществляли путем инкубации с 1 мкг/образец N-Glycosidase F (PNGase F, Roche, 11365169001) в течение 2 ч при 37°C. По окончании анализировали с помощью WB на наличие гликозилированных и дегликозилированных форм VIPR1. После проведения WB относительный уровень белка рассчитывали по отношению к Actinβ. Анализ электрофореграмм проводили с помощью Image Studio Lite Software (LI-COR Biosciences, США).

Экспрессия мРНК VIPR1 в эндотелиальных клетках линии EA.hy926. Работу с клетками линии EA.hy926 проводили в Rudbeck laboratory, Women’s and Children’s Health, Rudbeck laboratory, Уппсала, Швеция. Изучение влияния VIP в концентрациях 0,01 нмоль/л,10,0 нмоль/л и 1000 нмоль/л на эндотелиальные клетки линии EA.hy926 осуществляли в условиях ингибирования гликозилирования. Для этих целей использовался Vasoactive Intestinal Peptide (VIP, V3628, Sigma-Aldrich Corporation, США). Для ингибирования O-цепей использовали бензил-2-ацетамидо-2-дезокси-α-D-галактопиранозид (Sigma-Aldrich Corporation, США, B4894) (BG), для N-цепей — свейнсонин (Sigma-Aldrich Corporation, США, S9263) (SW). Клетки культивировали в соответствии с оригинальным протоколом согласно рекомендациям производителя ATCC (EA.hy926 ATCC CRL-2922™ Homo Sapiens Somatic Cell Hybrid). EA.hy926-клеточная линия пупочной вены человека получена путем слияния первичных клеток пупочной вены человека с резистентным к тиогуанину клону А549 под воздействием полиэтиленгликоля. Выбор клеточной культуры, ингибиторов гликозилирования и условий проведения культивирования осуществляли после обсуждения с Professor M. Olovsson, PhD Th. Kunovac Kallak, E. Davey и PhD M. Ziganshina.

Суммарную мРНК из эндотелиальных клеток линии EA.hy926 выделяли и анализировали, как это описано нами ранее [6]. Экстрагировали мРНК с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) после разрушения образцов клеток в TissueLyser II (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Использовались праймеры Thermo Fisher Scientific (США) для VIPR1 Hs00910459_g1 и для человеческого β-actin (ACTB; 4326315E) как эндогенного контроля VIPR1. Относительные изменения экспрессии генов проанализированы с использованием метода 2-ΔΔT, как это описано ранее [6]. Выделение мРНК из клеточной культуры и проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени осуществляли совместно с PhD Th. Kunovac Kallak, E. Davey.

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы IBM SPSS Statistics 20. Результаты исследования представлены как среднее значение и стандартное отклонение (М±SD). В зависимости от конкретных условий применяли: ANOVA, критерий Уилкоксона, U-критерий Манна—Уитни. Различия между группами считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Описание больных основной и сравнительной групп. У 58 больных перитонеальной формой эндометриоза основной группы анализ анамнестических и клинических данных по сравнению с женщинами контрольной группы показал наличие характерных признаков: это бесплодие, хронические тазовые боли, метроррагии, диспареуния. При лапароскопии наблюдались гетеротопии на брюшине различной локализации. Возраст и индекс массы тела в группе больных с эндометриозом без боли и с болью статистически значимо не различались. Статистически значимо дисменорея наблюдалась чаще у женщин группы без боли, а сочетание дисменореи и диспареунии — чаще у пациенток группы с болью. У больных перитонеальной формой эндометриоза интенсивность боли составляла до 5 баллов по визуально-аналоговой шкале (ВАШ). Статистически значимые различия в распространенности эндометриоза на брюшине (согласно критериям rASRM) между группами отсутствовали. Расширенная клиническая характеристика больных не противоречила ранее представленным данным [6].

В сравнительную группу включены 10 женщин репродуктивного возраста с глубоким инфильтративным эндометриозом и хронической тазовой болью, как это описано нами ранее [6], а также 5 девочек-подростков в возрасте 14—16 лет с перитонеальной формой эндометриоза и хронической тазовой болью.

Отличительной особенностью явилось статистически значимое различие интенсивности боли между пациентками основной и сравнительной групп: у пациенток основной группы интенсивность боли составляла до 5 (3,6±1,2) баллов, у пациенток сравнительной группы — более 5 (6,5±0,9) баллов по ВАШ.

Сравнение экспрессии VIPR1 и VIP, плотности VIP на мм² в эутопическом эндометрии женщин контрольной группы без боли (ЭУК/Б–) и в эутопическом эндометрии больных с перитонеальной формой эндометриоза без боли (ЭУЭ/Б–) и с болью (ЭУЭ/Б+). Как следует из данных, приведенных в табл. 1, экспрессия VIPR1 в эпителии желез, клетках стромы и микрососудах эутопического эндометрия была наименьшей в группе контроля ЭУК/Б– (женщины без эндометриоза) и статистически значимо повышалась в образцах эутопического эдометрия больных с эндометриозом без боли, достигая наибольших и статистически значимых значений в группе с болью — ЭУЭ/Б+. Статистически значимая разница между группами ЭУЭ/Б– и ЭУЭ/Б+ не установлена.

Таблица 1. Экспрессия VIPR1 и VIP, плотность VIP на мм² в эутопическом эндометрии у женщин контрольной группы и у больных с перитонеальной формой эндометриоза (основная группа) в зависимости от наличия или отсутствия тазовой боли по данным иммуногистохимического анализа (SCORE)

Table 1. Expression of VIPR1 and VIP, VIP density per mm2 in eutopic endometrium in women in the control group and in patients with peritoneal form of endometriosis (main group) depending on pelvic pain according to immunohistochemical analysis (SCORE).

Примечание. VIP — вазоактивный интестинальный пептид; VIPR1 — первый рецептор к VIP; ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контроль, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью. Значения оценены с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни и выражены как среднее значение и стандартное отклонение (M±SD).

Плотность VIP на мм² в ткани эутопического эндометрия также статистически значимо возрастала в группе ЭУЭ/Б+ и не имела статистически значимых различий в группах ЭУЭ/Б– и ЭУЭ/Б+. Экспрессия VIP в сосудах была статистически значимо выше в группе ЭУЭ/Б+ и наименьшей в группе контроля ЭУК/Б–. Статистически значимых различий между ЭУЭ/Б– и ЭУЭ/Б+ не установлено.

Следовательно, в группе ЭУЭ/Б+ в ткани эутопического эндометрия больных эндометриозом наблюдается накопление VIPR1 и VIP, достигающее наибольших значений.

Сравнение экспрессии VIPR1 и VIP, плотности VIP на мм² в эктопическом эндометрии больных с перитонеальной формой эндометриоза и в эутопическом эндометрии больных перитонеальной формой эндометриоза без боли (ЭУЭ/Б–) и с болью (ЭУЭ/Б+). Как следует из данных, приведенных в табл. 2, в отличие от данных табл. 1 наблюдается статистически значимое увеличение изученных показателей в группе с болью (ЭКЭ/Б+). Эти изменения характерны как для VIPR1 в эпителии желез, клетках стромы и в сосудах в группе ЭКЭ/Б+, так и для плотности VIP на мм² и для экспрессии VIP в микрососудах.

Таблица 2. Экспрессия VIPR1 и VIP, плотность VIP на мм² в эктопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза (основная группа) в зависимости от наличия или отсутствия тазовой боли по данным иммуногистохимического анализа (SCORE)

Table 2. Expression of VIPR1 and VIP, VIP density per mm2 in ectopic endometrium in patients with peritoneal form of endometriosis (main group) depending on pelvic pain according to immunohistochemical analysis (SCORE).

Примечание. VIP — вазоактивный интестинальный пептид; VIPR1 — первый рецептор к VIP; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью. Значения оценены с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни и выражены как среднее значение и стандартное отклонение (M±SD).

Анализ показателей, отраженных в табл. 1 и табл. 2, дает основание сделать вывод о том, что по сравнению с эутопическим эндометрием в эктопическом эндометрии наблюдаются более выраженные изменения. Наибольших статистически значимых уровней экспрессия VIPR1 и VIP достигает в группе ЭКЭ/Б+.

Сравнение относительных уровней белка VIPR1 и VIP по данным вестерн-блоттинг (WB) анализа в эутопическом эндометрии женщин контрольной группы без боли (ЭУК/Б–), в эутопическом эндометрии больных с перитонеальной формой эндометриоза без боли (ЭУЭ/Б–) и с болью (ЭУЭ/Б+). Результаты представлены в табл. 3. Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее низкие значения экспрессии общего белка VIPR1 и VIP получены в эутопическом эндометрии женщин контрольной группы (ЭУК/Б–). При эндометриозе с отсутствием хронической тазовой боли величина экспрессии белков статистически значимо возрастает (ЭУЭ/Б–), а сочетание эндометриоза и хронической тазовой боли (ЭУЭ/Б+) приводит к дальнейшему росту и статистически значимому увеличению экспрессии белков VIPR1 и VIP в эутопическом эндометрии. Приведенные результаты дополняют данные иммуногистохимического анализа (см. табл. 1).

Анализ результатов в зависимости от дегликозилированного (dgVIPR1) и гликозилированного белка (gVIPR1) показал, что если принять уровень общего белка VIPR1 за 100%, то распределение в группе ЭУК/Б– составит для dgVIPR1 47,5%, а для gVIPR1 — 52,5%, однако эта разница статистически незначима. В группе ЭУЭ/Б– dgVIPR1 составляет 39,2%, а gVIPR1 — 60,8% (см. табл. 3), разница также статистически незначима. Наиболее выраженные статистически значимые различия наблюдаются в группе ЭУЭ/Б+: доля dgVIPR1 составляет 32,7%, доля gVIPR1 — 67,3%. Следовательно, уровень белка dgVIPR1 в зависимости от группы обследованных больных не изменяется. Однако для белка gVIPR1 эта величина статистически значимо возрастает в группе ЭУЭ/Б+.

Экспрессия VIP характеризуется статистически значимым увеличением уровня белка VIP от группы ЭУК/Б– к группе ЭУЭ/Б– и далее к группе ЭУЭ/Б+, наибольшего значения он достигает в группе ЭУЭ/Б+.

На рис. 1 представлены электрофореграммы вестерн-блоттинга (WB), показывающие, что белок gVIPR1 имеет молекулярную массу 58 кДа, а dgVIPR1 — 47 кДа. Белок VIP представлен молекулярной массой 20 кДа, а внутренний контроль Actin — 43 кДа. Эти данные подтверждают данные табл. 3 и свидетельствуют о наличии двух изоформ VIPR1 в эутопическом эндометрии: это гликозилированная форма — gVIPR1 и дегликозилированная форма — dgVIPR1 у женщин контрольной группы и у больных с перитонеальной формой эндометриоза.

Рис. 1. Относительные уровни белка VIPR1 и VIP в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с перитонеальной формой эндометриоза в зависимости от наличия или отсутствия тазовой боли.

Вестерн-блоттинг использовали для определения уровней экспрессии белка VIP и VIPR1. ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контроль, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью; gVIPR1 — гликозилированный VIPR1; dgVIPR1 — дегликозилированный VIPR1; актин (Actin) — внутренний контроль; VIP — вазоактивный интестинальный пептид; 58 kDa, 47 kDa, 43 kDa, 20 kDa — молекулярная масса белков в килодальтонах.

Fig. 1. Relative levels of VIP and VIPR1 protein in eutopic and ectopic endometrium in women with peritoneal endometriosis depending on pelvic pain.

Таблица 3. Относительные уровни белка VIPR1 и VIP по данным вестерн-блоттинг анализа в эутопическом эндометрии у женщин контрольной группы и у больных с перитонеальной формой эндометриоза (основная группа) в зависимости от наличия или отсутствия тазовой боли

Table 3. Relative levels of VIP and VPAC1 protein according to Western blotting (WB) analysis in eutopic endometrium in the control group and in patients with peritoneal form of endometriosis (main group) depending on pelvic pain.

Примечание. VIP — вазоактивный интестинальный пептид; VIPR1 — первый рецептор к VIP; beta-actin — актин — внутренний контроль; ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контроль, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью. Вестерн-блоттинг использовали для определения уровней экспрессии белка VIP и VIPR1; gVIPR1 — гликозилированный VIPR1; dgVIPR1 — дегликозилированный VIPR1. Значения оценены с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни и выражены как среднее значение и стандартное отклонение (M±SD).

Сравнение относительных уровней белка VIPR1 и VIP по данным вестерн-блоттинг (WB) анализа в эктопическом эндометрии у больных следующих групп: перитонеальная форма эндометриоза, основная группа, без боли (ЭКЭ/Б–), перитонеальная форма эндометриоза, основная группа, с болью (ЭКЭ/Б+), глубокая инфильтративная форма эндометриоза, сравнительная группа, с болью (ЭКЭ/Б+), перитонеальная форма эндометриоза, сравнительная группа, девочки-подростки, с болью (ЭКЭ/Б+). Результаты представлены в табл. 4. Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее низкие значения экспрессии общего белка VIPR1 и VIP получены в эктопическом эндометрии при перитонеальной форме эндометриоза в основной группе без боли (ЭКЭ/Б–). При перитонеальной форме эндометриоза в основной группе с болью (ЭКЭ/Б+) величина экспрессии белков статистически значимо возрастает; а при глубокой инфильтративной форме эндометриоза в сравнительной группе с болью (ЭКЭ/Б+) и при перитонеальной форме эндометриоза в сравнительной группе девочек-подростков с болью (ЭКЭ/Б+) достигает наибольших значений и статистически значимого увеличения экспрессия белков VIPR1 и VIP в ткани эктопического эндометрия. Приведенные результаты дополняют данные иммуногистохимического анализа для основной группы (см. табл. 2).

Таблица 4. Относительные уровни белка VIPR1 и VIP по данным вестерн-блоттинг анализа в эктопическом эндометрии у больных с перитонеальной формой эндометриоза (основная группа), у больных с глубоким инфильтративным эндометриозом (сравнительная группа), у девочек-подростков с перитонеальной формой эндометриоза (сравнительная группа) в зависимости от наличия или отсутствия тазовой боли

Table 4. Relative protein levels VPAC1 and VIP according to Western blotting (WB) analysis in ectopic endometrium in patients with peritoneal form of endometriosis (main group), in patients with deep infiltrative endometriosis (comparative group), in patients with peritoneal form of endometriosis in adolescent girls (comparative group) depending on pelvic pain.

Примечание. VIP — вазоактивный интестинальный пептид; VIPR1 — первый рецептор к VIP; beta-actin — актин — внутренний контроль; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, перитонеальная форма эндометриоза (основная группа), без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, перитонеальная форма эндометриоза (основная группа), с болью; ЭКЭ/Б+ — глубокая инфильтративная форма эндометриоза, сравнительная группа, с болью; ЭКЭ/Б+ — перитонеальная форма эндометриоза, сравнительная группа, девочки-подростки, с болью. Вестерн-блоттинг использовали для определения уровней экспрессии белка VIP и VIPR1. gVIPR1 — гликозилированный VIPR1; dgVIPR1 — дегликозилированный VIPR1. Значения оценены с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни и выражены как среднее значение и стандартное отклонение (M±SD).

Анализ результатов в зависимости от уровня дегликозилированного белка (dgVIPR1) и гликозилированного белка (gVIPR1) показал, что если принять общий белок VIPR1 за 100% (см. табл. 4), то распределение в группе ЭКЭ/Б– (перитонеальная форма эндометриоза, основная группа, без боли) составит для dgVIPR1 28,5%, а для gVIPR1 — 71,5%, причем эта разница статистически значима. В группе ЭКЭ/Б+ (перитонеальная форма эндометриоза, основная группа, с болью) dgVIPR1 составляет 16,6%, а gVIPR1 — 83,4%, причем эта разница статистически значима. В группе ЭКЭ/Б+ (глубокая инфильтративная форма эндометриоза, сравнительная группа, с болью) dgVIPR1 составляет 19,1%, а gVIPR1 — 80,9%, причем эта разница статистически значима. В группе ЭКЭ/Б+ (перитонеальная форма эндометриоза, сравнительная группа, девочки-подростки, с болью) dgVIPR1 составляет 15,4%, а gVIPR1 — 84,6%, причем эта разница статистически значима.

Сравнение между группами (см. табл. 4) показало, что уровень общего белка VIPR1 статистически значимо ниже при перитонеальной форме эндометриоза (основная группа, без боли) по сравнению с другими группами больных. Наиболее выраженные статистически значимые различия наблюдались между уровнями dgVIPR1 и gVIPR1. Так, уровень dgVIPR1 был наименьшим при перитонеальной форме эндометриоза (основная группа, без боли) по сравнению с другими группами, в которых эта величина снижена. В то же время уровень gVIPR1 при перитонеальной форме эндометриоза (основная группа, с болью), при глубокой инфильтративной форме эндометриоза (сравнительная группа, с болью), при перитонеальной форме эндометриоза (сравнительная группа, девочки-подростки, с болью) был статистически значимо повышен. Следовательно, доля белка dgVIPR1 в группах обследованных больных снижается с развитием болевого синдрома, а доля белка gVIPR1 возрастает.

Экспрессия VIP характеризуется статистически значимым увеличением белка VIP от группы ЭКЭ/Б– к группам ЭКЭ/Б+, достигая наибольшего значения в группе с глубокой инфильтративной формой эндометриоза (сравнительная группа, с болью).

На рис. 2 представлены электрофореграммы WB, показывающие, что белок gVIPR1 имеет молекулярную массу 58 кДа, dgVIPR1 — 47 кДа, а внутренний контроль Actin — 43 кДа. Эти данные подтверждают результаты, приведенные в табл. 4, и свидетельствуют о наличии двух изоформ VIPR1 в эутопическом и эктопическом эндометрии — гликозилированной формы — gVIPR1 и дегликозилированной формы — dgVIPR1 при перитонеальной форме эндометриоза (сравнительная группа, девочки-подростки, с болью) и при глубокой инфильтративной форме эндометриоза (сравнительная группа, с болью). Если для эутопического и эктопического эндометрия в группах без боли характерно наличие только двух изоформ с молекулярной массой 58 и 47 кДа, то для группы эктопического эндометрия и наличия боли установлено появление атипичных изоформ белка с различными молекулярными массами от 47 до 58 кДа. Количество этих изоформ достигает четырех, и они четко идентифицируются на электрофореграммах.

Рис. 2. Относительные уровни белка VIPR1 в эутопическом и эктопическом эндометрии у девочек с перитонеальной формой эндометриоза и у женщин с глубокой инфильтративной формой эндометриоза в зависимости от наличия или отсутствия тазовой боли.

Вестерн-блоттинг использовали для определения уровней экспрессии белка VIPR1 и VIP. ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контроль, без боли; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью; gVIPR1 — гликозилированный VIPR1; dgVIPR1 — дегликозилированный VIPR1; актин (Actin) — внутренний контроль; 58 kDa, 47 kDa, 43 kDa — молекулярная масса белков в килодальтонах.

Fig. 2. Relative levels of VIPR1 protein in the eutopic and ectopic endometrium in girls with peritoneal endometriosis and in women with deep infiltrative endometriosis, depending on the presence or absence of pelvic pain.

Проведение дегликозилирования нативных белков, полученных из эутопического и эктопического эндометрия. Для проведения дегликозилирования суммарный белок выделяли из эутопического эндометрия женщин контрольной группы, эутопического и эктопического эндометрия больных с эндометриозом без боли и с болью, сравнительной группы с болью, как это описано нами ранее [6]. Все полученные образцы строго стандартизовали по содержанию белка и подвергали дегликозилированию в стандартных условиях по методу N. Boggavarapu и соавт. [3]. После проведения дегликозилирования и WB-анализа установлено, что белок dgVIPR1 с массой 47 кДа во всех образцах не изменял своего содержания, молекулярной массы и представлен одной фракцией. Белок gVIPR1, имеющий молекулярную массу 58 кДа, претерпевал изменения в сторону количественного снижения, но не изменял молекулярной массы. Эти данные подтверждают результаты, приведенные на рис. 1, для эутопического эндометрия у женщин контрольной группы и больных с перитонеальной формой эндометриоза, свидетельствуя о наличии после дегликозилирования двух изоформ VIPR1 в эутопическом эндометрии: это гликозилированная форма — gVIPR1 и дегликозилированная форма — dgVIPR1. При дегликозилировании VIPR1 наблюдается сохранение гликозилированной формы gVIPR1, но с уменьшением белка gVIPR1, что свидетельствует о недостаточной глубине дегликозилирования в заданных условиях, которые не влияют на молекулярную массу белка, приводя к его потере или глубокой модификации.

Дегликозилирование белка VIPR1 в эутопическом и эктопическом эндометрии у женщин с глубокой инфильтративной формой эндометриоза и у девочек с перитонеальной формой в зависимости от наличия или отсутствия тазовой боли показало, что аномальные изоформы VIPR1 с молекулярной массой между 47 и 58 кДа (см. рис. 2) претерпевают значительные изменения и не выявляются на электрофореграммах после проведения WB. Однако свойства основных изоформ с молекулярной массой 47 и 58 кДа сохраняются.

Следовательно, под действием дегликозилирования аномальные изоформы VIPR1 изменяются и не обнаруживаются, являются нестабильными и теряют основные свойства. Свойства основных белков VIPR1 с молекулярной массой 47 и 58 кДа сохраняются.

Влияние VIP в концентрациях 0,01 нмоль/л, 10,0 нмоль/л и 1000 нмоль/л на относительную экспрессию мРНК VIPR1 эндотелиальных клеток линии EA.hy926 в условиях ингибирования гликозилирования. Как следует из данных, приведенных на рис. 3, экспрессия гена VIPR1 на фоне изменения концентрации VIP в культуральной среде (0,01—10,0—1000 нмоль/л) статистически значимо возрастает и, следовательно, является дозозависимой. В то же время влияние ингибиторов гликозилирования при концентрациях VIP 0,01 и 10,0 нмоль/л статистически незначимо влияло на экспрессию гена VIPR1. Однако при концентрации VIP 1000 нмоль/л это влияние становилось статистически значимым. Так, подавление экспрессии O-терминального конца во внутриклеточном домене белка VIPR1 было статистически менее значимо, чем подавление N-терминального конца белка VIPR1, находящегося во внеклеточном домене рецептора. Эти результаты подтверждают данные литературы и свидетельствуют о том, что N-терминальный конец белка VIPR1 во внеклеточном домене и именно его гликозилированные структуры являются наиболее функционально активными при взаимодействии с VIP [7, 11, 12].

Рис. 3. Влияние VIP в концентрациях 0,01 нмоль/л, 10,0 нмоль/л и 1000 нмоль/л на относительную экспрессию мРНК VIPR1 эндотелиальных клеток линии EA.hy926 в условиях ингибирования гликозилирования.

Контроль — культуральная среда; VIP+O — ингибирование O-цепей; VIP+N — ингибирование N-цепей; VIP — различные концентрации нативного VIP; концентрации VIP в культуральной среде от 0,01 до 1000 нмоль/л.

Fig. 3. Effect of VIP at concentrations of 0.01 nmol/l, 10.0 nmol/l, and 1000 nmol/l on the relative expression of VIPR1 mRNA in EA.hy926 endothelial cells under conditions of glycosylation inhibition.

Блок-схема влияния оксидативного стресса, нитрозативного стресса, окислительно-восстановительной сигнализации (redox signaling), воспаления микроокружения, нейрогенного воспаления, эстрогенного воспаления на изменение гликозилирования VIPR1 в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с эндометриозом. На рис. 4 представлен патогенетический вариант проявления и усиления основных патологических эффектов при эндометриозе. В норме гликозилирование VIP осуществляется на одном сайте N-концевого домена, а гликозилирование VIPR1 наблюдается на трех сайтах N-концевого внеклеточного домена и одном сайте во второй внеклеточной петле [7]. Это распределение гликозилирования соотносится с неустойчивостью к протеолизу VIP во внеклеточной среде, устойчивостью VIPR1 на поверхности клеток к внеклеточной среде и изменчивостью к внутриклеточной среде. Однако под действием внутриклеточных факторов, влияющих на гликозилирование VIPR1, таких как оксидативный стресс, нитрозативный стресс [13], redox signaling [14], воспаление микроокружения [6], нейрогенное воспаление [15] и эстрогенное воспаление [16], изменяется уровень гликозилирования VIPR1, что приводит в эутопическом и эктопическом эндометрии к повышению экспрессии VIPR1 и VIP в эпителии желез, строме, микрососудах, нервных волокнах (IHC), увеличению синтеза VIPR1 и VIP (WB), усилению экспрессии mRNA VIPR1 и VIP. Следствием этих процессов является увеличение содержания VIPR1 и VIP в перитонеальной жидкости и в крови.

Рис. 4. Влияние оксидативного стресса, нитрозативного стресса, воспаления микроокружения, нейрогенного воспаления, эстрогенного воспаления на изменение гликозилирования VIPR1 в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с эндометриозом (блок-схема).

VIP — вазоактивный интестинальный пептид; VIPR1 — первый рецептор к VIP; WB — вестерн-блоттинг; RT-PCR — полимеразная цепная реакция в реальном времени; ELISA — иммуногистохимический анализ.

Fig. 4. The effect of oxidative stress, nitrosative stress, microenvironment inflammation, neurogenic inflammation, and estrogenic inflammation on changes in VIPR1 glycosylation in the eutopic and ectopic endometrium in patients with endometriosis (block scheme).

Полученные результаты позволяют предполагать, что изменение гликозилирования VIPR1 в эутопическом и эктопическом эндометрии осуществляется в N-терминальном домене (WB), и это не противоречит данным литературы. Однако если при развитии перитонеальной формы эндометриоза у женщин репродуктивного возраста отмечается только нарастание гликозилированных форм VIPR1, то при перитонеальной форме эндометриоза у девочек-подростков и глубоком инфильтративном эндометриозе у женщин репродуктивного возраста появляются аномальные гликозилированные формы VIPR1 с различной молекулярной массой.

Наиболее обоснованным объяснением усиления гликозилирования и появления аномальных изоформ VIPR1 при эндометриозе служат факты, что образование белка VIPR1 осуществляется в эндоплазматическом ретикулуме, где происходит синтез → усложнение → сборка белка; только часть вновь образованного VIPR1 за счет внутриклеточной сортировки достигает необходимой конформации, которая позволяет встраивать его на клеточную поверхность. Оценка качества незрелого VIPR1 осуществляется посредством посттрансляционного контроля качества [11].

Нарушение механизмов контроля активных VIPR1 под действием факторов стресса и воспаления приводит к участию незрелых VIPR1 в реализации функциональной активности клеток и, следовательно, к патологическому процессу. Возможно, имеет место мутагенез генов VIPR1, однако опубликованных работ об этом нет. Несомненно, что исследования в этом направлении будут продолжены.

Учитывая, что VIP является одним из основных факторов регуляции клеточного и внеклеточного метаболизма, изменение состояния VIPR1 за счет неадекватного гликозилирования влияет на синхронизацию внутриклеточных и внеклеточных функций. На примере эндометриоза — это проявление патологии в раннем возрасте у девочек-подростков, далее в репродуктивном возрасте (перитонеальная форма) и при продолжительном течении заболевания (глубокая инфильтративная форма). Для всех этих форм характерно наличие болевого синдрома и нарушения менструального цикла, а в репродуктивном периоде — бесплодия.

Полученные первые экспериментальные данные о влиянии VIP в концентрациях 0,01 нмоль/л, 10,0 нмоль/л и 1000 нмоль/л на относительную экспрессию мРНК VIPR1 эндотелиальных клеток линии EA.hy926 в условиях ингибирования гликозилирования указывают на перспективность поиска агонистов и антагонистов VIP или VIPR1 в условиях этой модели для создания целевых терапевтических средств лечения эндометриоза.

Обсуждение

VIP широко распространен в центральной и периферической нервной системе, он модулирует многие физиологические процессы, в том числе экзо- и эндокринную секрецию, синтез гормонов, наступление беременности, развитие эмбриона и плода, иммунный ответ. Применение препаратов, содержащих VIP, может оказать благотворное влияние при воспалительных и нейродегенеративных заболеваниях, к числу которых относится и эндометриоз [16].

Человеческий рецептор VIPR1 для VIP и пептида гипофиза, активирующего аденилатциклазу (PACAP), относится к семейству II класса G-белок-связанных рецепторов с семью трансмембранными сегментами, но внеклеточный N-концевой домен человеческого рецептора VIPR1 играет доминирующую роль в распознавании пептидных лигандов VIP [17].

Как и для большинства трансмембранных белков, трансляция рецепторов, связанных с G-белком (GPCRs) мРНК, имеет место в эндоплазматическом ретикулуме, где они находятся, синтезируются, усложняются и собираются. Молекулярные механизмы, участвующие в процессе переноса GPCR от ER до плазматической мембраны, мало изучены. С помощью биохимических, фармакологических методов и флуоресцентной микроскопии показано, что только часть вновь синтезированного VIPR1 за счет внутриклеточной сортировки белков должным образом достигает необходимой конформации, которая позволяет встраивать VIPR1 на клеточную поверхность. Состояние свернутого или незрелого VIPR1 осуществляется посредством совместного и посттрансляционного контроля качества, включающего в себя: калнексинзависимое (при участии кальцийзависимых шаперонов) сворачивание белков через гликанозависимый механизм, BiP-зависимый (binding immunoglobulin protein, или heat shock 70 kDa protein) фолдинг, протеасомозависимую деградацию неправильных белков и проверку качества белков после транслокации в цитоплазму. Эти данные свидетельствуют о том, что пути экспрессии/переноса VIPR1 находятся под контролем сложных и точных молекулярных механизмов, которые гарантируют достижение поверхности клетки и участие в выполнении специфических функций только правильных VIPR1 [11].

Рецепторы VIP, в частности VIPR1, являются очень многообещающими мишенями для разработки терапевтических молекул, предназначенных для лечения различных патологических состояний, в том числе астмы, хронических воспалительных заболеваний (болезни Крона, ревматоидного артрита, рассеянного склероза и т.д.), септического шока, диабета, стресса, остеопороза, нейродегенеративных расстройств, шизофрении. В то время как новые пептидные производные VIP специфически нацелены на VIPR1, в настоящее время доступны различные подтипы рецепторов, однако короткий период их полураспада затрудняет использование в терапии. Недавний прогресс в структурных знаниях сайта связывания VIPR1 должен повлиять на конструирование новых агонистов и/или антагонистов для этого рецептора, что будет представлять собой важный этап в лечении многих заболеваний человека. Использование различных подходов, таких как направленный мутагенез, фотоаффинная маркировка, ядерно-магнитный резонанс (ЯМР), молекулярное моделирование и молекулярно-динамическое моделирование, привело к демонстрации того, что N-концевой эктодомен (N-ted) VIPR1 играет ключевую роль во взаимодействии с VIP [12].

Заключение

Таким образом, проведенные исследования позволили доказать, что VIPR1 при эндометриозе активно экспрессируется в эутопическом и эктопическом эндометрии клетками железистого эпителия. Установленная высокая экспрессия VIPR1 связана с изменением гликозилирования и избыточным накоплением гликозилированных форм VIPR1 при перитонеальной форме эндометриоза у женщин репродуктивного возраста в эутопическом и эктопическом эндометрии. При глубоком инфильтративном эндометриозе у женщин репродуктивного возраста и при перитонеальной форме у девочек-подростков в эктопическом эндометрии выявляются аномальные гликозилированные формы VIPR1 с различной молекулярной массой. Полученные данные раскрывают ранее неизвестный механизм повреждения VIPR1 при эндометриозе. WB-анализ позволяет выявлять гликозилированные формы VIPR1, сочетающиеся с умеренной тазовой болью (оценка по визуально-аналоговой шкале менее 5 баллов). Разработан метод вестерн-блоттинг анализа, идентифицирующий аномальные формы VIPR1 сочетающиеся с выраженной тазовой болью (оценка по визуально-аналоговой шкале более 5 баллов). Сформированная экспериментальная модель с участием клеточной культуры позволяет на ее основе тестировать модифицированные или синтетические агонисты/антагонисты VIPR1 с целью поиска новых лекарственных форм для лечения эндометриоза.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минздрава России «Разработка подходов для неинвазивной диагностики эндометриоза на основе омиксных технологий», номер госрегистрации: АААА-А19-119021490132-9 на период 01.01.2019—31.12.2021.

Благодарности. Выражаем благодарность Professor M. Olovsson, PhD C. Moberg, PhD Th. Kunovac Kallak, E. Davey (Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden), Professor V. Tolmachev (Department of Immunology, Genetics and Pathology, Uppsala University, Uppsala, Sweden), Professor A. Orlova (Department of Medicinal Chemistry Uppsala University, Uppsala, Sweden), Professor P.G. Lalitkumar (Division of Obstetrics and Gynecology, Department of Women’s and Children’s Health, Karolinska Institutet/Karolinska University Hospital, Stockholm, Sweden) за участие в обсуждениях и поддержку. Работа выполнена по теме «Изучение ассоциации между эндометриальными маркерами эутопического и эктопического эндометрия и тазовой болью у женщин с эндометриозом», учетный номер Минобрнауки России в НТИМИ 0431/01/15. Финансовая, научная, правовая и политическая поддержка осуществлялась Шведской Королевской Академией наук, Шведским Медицинским исследовательским советом (гранд №8683), Фондом планирования семьи в Уппсале, Университетом Уппсалы, Швеция, Rudbeck Laboratory, The Human Protein Atlas, ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России и Минздравом России.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Бурлев В.А.

Сбор и обработка материала — Бурлев В.А., Ильясова Н.А.

Статистическая обработка — Бурлев В.А., Ильясова Н.А.

Написание текста — Бурлев В.А.

Редактирование — Бурлев В.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.