Преэклампсия (ПЭ) — распространенное многофакторное осложнение беременности, характеризующееся полиорганной недостаточностью, влекущей за собой целый ряд сложных акушерских проблем, вплоть до летального исхода матери и плода. ПЭ развивается у 8—15% беременных женщин [1].

Этиопатогенез ПЭ еще окончательно не расшифрован. Как и при любой многофакторной патологии, в основе развития ПЭ лежит генетическая уникальность организма, проявляющаяся особенностями индивидуальных реакций на окружающую среду. С этой точки зрения ПЭ следует рассматривать как патологическое состояние, проявляющееся в период беременности у носительниц определенных наследуемых генетических изменений (полиморфизмов) в виде функциональной дезадаптации организма в стремлении обеспечить жизненно важные потребности плода. Идентификация женщин с наследственной предрасположенностью к развитию ПЭ еще до наступления беременности или в самых ранних ее сроках могла бы способствовать своевременному проведению специфических превентивных мероприятий, доступных на современном уровне развития медицины. В связи с этим актуальность приобретают исследования, направленные на выявление генетических маркеров наследственной предрасположенности к ПЭ, чему и посвящено настоящее исследование.

Стратегия поиска генов, вовлеченных в структуру наследственной предрасположенности к ПЭ, строилась путем выбора наиболее вероятных генов-кандидатов на основании имеющихся знаний по основным фенотипическим (клиническим) проявлениям ПЭ, таким как повышение уровня артериального давления, развитие окислительного стресса плаценты и эндотелиальной дисфункции сосудов в системе кровообращения «мать—плацента—плод». Нам представилось целесообразным изучить роль полиморфизма ключевых генов ренин-ангиотензиновой системы, прооксидантно-антиоксидантной системы и фактора роста эндотелия сосудов VEGF в развитии ПЭ, возможно, обусловливающих эти клинические проявления [2—4].

Цель исследования — определить значимость полиморфных вариантов генов ренин-ангиотензиновой системы (rs5186 гена AGTR1; rs11091046 гена AGTR2), прооксидантно-антиоксидантной системы (s1049255 (A640G) гена CYBA; rs2333227 (G463A) гена MPO; rs4880 (V16A) гена SOD2) и фактора роста эндотелия сосудов (rs3025039 (C936T) и rs699947 гена VEGF-A) как генетических предикторов развития ПЭ.

Материал и методы

Исследованию подверглись 197 беременных женщин в возрасте 17—40 лет (средний возраст 29,01±2,25 года), включенные в 2 сравниваемые группы: основную (97 беременных, страдавших ПЭ средней и тяжелой степени) и контрольную (100 пациенток с физиологически протекающей беременностью).

Критериями включения пациенток в основную группу являлись клинически верифицированный диагноз ПЭ, возраст беременной от 17 до 40 лет, одноплодная беременность, согласие женщины на участие в исследовании и разрешение этического комитета. В контрольную группу включены женщины с физиологически протекающей беременностью методом «случай—контроль» по тем же критериям. В исследование не включали беременных, в анамнезе которых значились сопутствующие системные аутоиммунные и эндокринные заболевания, аномалии развития плода, Rh-конфликт, специфические инфекции, черепно-мозговые травмы, нейродегенеративные и онкологические заболевания.

Молекулярно-генетические исследования проводили в лаборатории молекулярно-генетической диагностики НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» ФМБА России (Москва, Россия).

В качестве биологических образцов использовалась венозная кровь беременных. ДНК выделяли методом стандартного протокола фенол-хлороформной экстракции.

Определение аллельного состояния однонуклеотидных полиморфных маркеров генов ренин-ангиотензиновой системы, прооксидантно-антиоксидантной системы и VEGF проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с использованием специфичных праймеров и соответствующих рестриктаз производства НПО «СибЭнзим» (Россия) (табл. 1).

Таблица 1. Основные детерминанты специфичности полимеразной цепной реакции и условий генотипирования полиморфных маркеров исследуемых генов

Для косвенной проверки качества генотипирования проводили сопоставление распределения частот аллелей исследуемых локусов в смешанной выборке (основная+контрольная группы) с равновесным популяционным распределением частот этих же аллелей согласно правилу равновесного наследования мутаций Харди—Вайнберга [5], а также с данными проекта «1000G» [6, 7].

Статистический анализ проводили стандартными методами с помощью пакетов прикладных программ Statistica for Windows 6.0 и Microsoft Excel 2007. Для проверки статистической значимости различий частот генотипов в основной и контрольной группах по каждому локусу использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали статистической значимыми при значениях p<0,05.

Результаты и обсуждение

Значимость полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы

Определялись аллельные варианты генов рецепторов ангиотензина II (rs5186 гена AGTR1 и rs11091046 гена AGTR2). В этой части исследования использовались биологические образцы крови, полученные от 49 беременных с ПЭ (основная группа) и 48 беременных без ПЭ (контрольная группа). Следует отметить, что в соответствии с данными проекта «1000G» [7] частоты редких аллелей обоих локусов (rs5186 гена AGTR1 и rs11091046 гена AGTR2) в европейской популяции составляют 27,2% аллель «C» в rs5186 и 45,1% аллель «C» в rs11091046, это позволяет проводить статистический анализ на относительно небольших выборках.

Результаты сравнительного анализа распространенности генотипов в локусах rs5186 в гене AGTR1 и rs11091046 в гене AGTR2 в группе женщин с ПЭ и контрольной группе представлены в табл. 2, 3.

Таблица 2. Частота генотипов rs5186 (A1166C) в гене AGTR1 в сравниваемых группах

Примечание. Различия статистически значимые при p<0,05.

Таблица 3. Частота генотипов rs11091046 (A8169C) в гене AGTR2 в сравниваемых группах

Примечание. * — различия статистически значимые при p<0,05.

Как можно видеть в табл. 2, частоты аллелей A и C локуса rs5186 в суммарной смешанной группе исследования (97 беременных основной и контрольной групп) составили f_A=73,2%, f_C=26,8%, что, по данным проекта «1000G» [7], близко соответствует частотам этих аллелей в европейской популяции (f_A=72,8% и f_C=27,2%). Распределение генотипов AA:AC:CC в суммарной смешанной группе составляет 53:36:8, что практически соответствует равновесию Харди—Вайнберга — 52:38:7 и косвенно свидетельствует о достаточном качестве генотипирования всей смешанной выборки.

Статистически незначимые различия между основной и контрольной группами свидетельствуют об отсутствии связи rs5186 в гене AGTR1 с развитием ПЭ.

Как можно видеть в табл. 3, частоты аллелей A и C rs11091046 в суммарной смешанной группе (97 беременных основной и контрольной групп) составили f_A=57,4%, f_C=42,6%, что, по данным проекта «1000G» [7], близко соответствует частотам этих аллелей в европейской популяции (f_A=54,9% и f=45,1%). При этом распределение генотипов в суммарной смешанной группе AA:AC:CC (40:33:24) значительно отличается от равновесного (29:48:20) в европейской популяции женщин.

В результате сравнительного анализа частоты генотипов rs11091046 оказалось, что в основной группе частота генотипа AA ниже, чем в контрольной (22,4 и 60,4% соответственно, p>0,005), частота генотипа AC в основной группе примерно такая же, как в контрольной группе (36,7 и 31,3% соответственно), а частота генотипа CC в основной группе значительно превышает таковую в контрольной группе (40,8 и 12,5% соответственно, p=0,009), что свидетельствует о статистически значимой связи аллеля C в гомозиготном состоянии с ПЭ.

Таким образом, статистически значимые различия относительных частот генотипа «CC» в локусе rs11091046 между основной и контрольной группами позволяют отнести гомозиготных носительниц аллеля «C» в локусе rs11091046 к группе повышенного риска развития ПЭ.

Значимость полиморфизма генов прооксидантно-антиоксидантной системы

Определяли аллельные варианты генов прооксидантно-антиоксидантной системы: rs1049255 (A640G) и rs4673 (C242T) гена прооксиданта — никотинамид динуклеотид фосфата (CYBA); rs2333227 (G463A) гена прооксиданта — миелопероксидазы (MPO); rs4880 (V16A) гена антиоксиданта — митохондриальной супероксиддисмутазы (SOD2).

В этой части исследования также использовались биологические образцы крови, полученные от 49 беременных с ПЭ (основная группа) и 48 беременных без ПЭ (контрольная группа).

В табл. 4 представлены результаты генотипирования беременных на носительство rs1049255 (A640G) 3’-нетранслируемой области гена прооксиданта — NAD(P)H oxidase (CYBA) в сравниваемых выборках.

Таблица 4. Частота генотипов rs1049255 (A640G) в гене NAD(P)H oxidase p22phox (CYBA) в сравниваемых выборках

Примечание. * — различия статистически значимые при p<0,05.

Как можно видеть в табл. 4, частоты аллелей A и G в локусе rs1049255 в суммарной смешанной группе исследования (97 беременных) составили f_A=47,4%, f_G=52,6%, что, по данным проекта «1000G» [7], близко соответствует частотам этих аллелей в европейской популяции (f_A=49,3%, f_G=50,7%). Распределение генотипов в суммарной смешанной группе AA:AG:GG (23:46:28) близко соответствует равновесию Харди—Вайнберга с частотами аллелей A и G в локусе rs1049255 (25:48:24), это косвенно свидетельствует о достаточном качестве генотипирования всей смешанной выборки.

Статистически значимые различия между частотами генотипов в основной и контрольной группах отсутствуют, что свидетельствует об отсутствии связи локуса rs1049255 с повышенным или сниженным риском развития ПЭ.

В табл. 5 представлены результаты генотипирования беременных на носительство rs4673 гена прооксиданта миелопероксидазы (CYBA). Следует отметить, что в локусе rs4673 частоты аллелей C и T в суммарной смешанной группе (97 беременных женщин) составляют f_C=52,1%, f_T=47,9%, что, по данным проекта «1000G» [7], не соответствует равновесным частотам этих аллелей в европейской популяции (f_C=65,8%, f_T=34,2%). Распределение генотипов в суммарной смешанной группе составляет CC:CT:TT (21:59:17) и практически соответствует равновесию Харди—Вайнберга с частотами аллелей в локусе rs4673 в смешанной выборке (26:49:22), что косвенно свидетельствует о достаточном качестве генотипирования всей смешанной выборки.

Таблица 5. Частота rs4673 (C242T) в гене NAD(P)H oxidase p22phox (CYBA) в сравниваемых выборках

Примечание. Различия статистически значимые при p<0,05.

Что же касается данных сравнительного анализа, то статистически значимые различия в распространенности генотипов в локусе rs4673 между беременными основной и контрольной групп не выявлены, что свидетельствует об отсутствии связи локуса rs4673 с повышенным или сниженным риском развития ПЭ.

В табл. 6 представлены результаты сравнительного анализа распространенности rs2333227 (G463A) в гене белка-прооксиданта — миелопероксидазы (MPO) в сравниваемых группах. Относительно высокая популяционная частота редкого аллеля T rs2333227 (G463A) в гене MPO (23,8%), по данным проекта «1000G» [7], позволила ограничиться небольшими по численности выборками пациенток в основной и контрольной группах.

Таблица 6. Частота генотипов rs2333227 (G463A) в гене миелопероксидазы MPO в сравниваемых выборках

Примечание. * — различия статистически значимые при p<0,05.

Частота аллелей T и C в локусе rs2333227 в суммарной смешанной группе (97 беременных женщин) составила f_T=24,2%, f=75,8%, что, по данным проекта «1000G» [7], близко соответствует частотам этих аллелей в европейской популяции (f_T=23,8%, f_C=76,2%). Распределение генотипов TT:CT:CC в локусе rs2333227 в суммарной смешанной группе составляет 8:31:58, близко соответствуя равновесию Харди—Вайнберга (6:35:56), что косвенно свидетельствует о достаточном качестве генотипирования всей смешанной выборки.

Статистически значимые различия в распределении гомозигот TT в локусе rs2333227 между основной и контрольной группами свидетельствуют о возможном снижении риска развития ПЭ при наличии аллеля T в гомозиготном состоянии в локусе rs2333227.

В табл. 7 представлены результаты сравнительного анализа распространенности rs4880 (V16A) гена белка-антиоксиданта митохондриальной супероксиддисмутазы (SOD2) среди беременных исследуемой и контрольной групп.

Таблица 7. Частота генотипов rs4880 (T74690C, V16A) в гене митохондриальной супероксиддисмутазы (SOD2) в сравниваемых выборках

Примечание. * — различия статистически значимые при p<0,05.

Частоты аллелей T и C в локусе rs4880 в суммарной смешанной группе (97 беременных) составили f_T=58,2%, f_C=41,8%, что, по данным проекта «1000G» [7], близко соответствует частотам этих аллелей в европейской популяции (f_T=53,4%, f_C=46,6%). Распределение генотипов TT:CT:CC в суммарной смешанной группе составляет 32:49:16, что, по данным «1000G», также близко соответствует равновесию Харди—Вайнберга с частотами аллелей в локусе rs4880 — 28:48:21, это косвенно свидетельствует о достаточном качестве генотипирования всей смешанной выборки.

Статистически значимые различия в распространенности гомозигот CC и TT в локусе rs4880 между основной и контрольной группами беременных (см. табл. 7) свидетельствуют о возможной связи аллеля C с повышенным риском развития ПЭ.

Значимость полиморфизма гена фактора роста эндотелия сосудов

Определялись аллельные варианты rs3025039 C936T и rs699947 в гене VEGF-A. В этой части исследования использовались биологические образцы крови, полученные от 97 беременных с ПЭ (основная группа) и 100 беременных без ПЭ (контрольная группа).

Результаты сравнительного анализа распространенности генотипов rs3025039 C936T гена VEGF-A у беременных основной и контрольной групп представлены в табл. 8.

Таблица 8. Частота генотипов rs3025039+936C→T в гене VEGF-А в сравниваемых группах

Примечание. * — различия статистически значимые при p<0,05.

Из табл. 8 явствует, что носительницами гомозиготного генотипа «CC» локуса rs3025039 гена VEGF-A являются 26,8% беременных с ПЭ и 58% беременных контрольной группы; носительницами гетерозиготного генотипа «CT» — 59,8% беременных с ПЭ и 42% беременных контрольной группы; носительницами гомозиготного генотипа «TT» — 13,4%, беременных с ПЭ, в контрольной группе носительниц генотипа «TT» не было (все различия статистически значимы при p<0,05). Таким образом, 72,3% беременных с ПЭ являются носительницами аллеля «T» в локусе rs3025039 в гене VEGF-A (59,8% гетерозиготных и 13,4% гомозиготных носительниц). В контрольной группе 100% женщин являются носительницами аллеля C локуса rs3025039 в гене VEGF-A (58% гомозиготных и 42% гетерозиготных носительниц).

Согласно данным международного банка однонуклеотидных полиморфизмов dbSNP, частота встречаемости аллеля T в локусе rs3025039 составляет 13,36% (по данным проекта 1000 Genomes). Минимальная популяционная частота аллеля T составляет 8,4% (в африканской популяции), максимальная — 22,77% (в смешанной американской популяции) [8].

По данным нашего исследования, в образцах крови, полученных от 197 беременных, присутствует ДНК из 394 хромосом (по 2 хромосомы, содержащие ген VEGF-A), среди которых обнаружено 126 хромосом с аллелем T, что соответствует частоте 31,98% и значительно превышает средние частоты распространенности аллеля T в локусе rs3025039 в разных популяциях мира. Принимая во внимание, что в основной группе частота аллеля T составляет 43,3%, превышая в 2 раза максимальную популяционную частоту, а в контрольной группе — 21%, полностью соответствуя популяционной частоте, возникает статистически обоснованное предположение о наличии этиологической связи аллеля T локуса rs3025039 гена VEGF с развитием ПЭ во время беременности. Отсутствие гомозигот по аллелю T локуса rs3025039 в контрольной группе нарушает правило равновесного наследования мутаций Харди—Вайнберга и позволяет предположить наличие отсекающего (отрицательного) отбора носителей гомозигот «TT». Наличие же 13,4% гомозигот по аллелю T в локусе rs3025039 у пациенток основной группы и отсутствие таковых у женщин контрольной группы позволяет предположить, что гомозиготное носительство аллеля T в локусе rs3025039 свидетельствует об этиологической связи гомозиготного носительства аллеля T локуса rs3025039 с ПЭ.

Данные о распространенности генотипов промоторного региона rs699947 гена VEGF-A в точке полиморфизма — 2578 A⇒C в основной и контрольной группах представлены в табл. 9, из которой следует, что в основной группе распространенность генотипа «AA» в 2 раза ниже, чем в контрольной группе (12,4 и 26% соответственно при p<0,05); распространенность генотипа «AC» является практически одинаковой (52,6 и 57% соответственно); распространенность же генотипа «CC» среди женщин с ПЭ в 2 раза превышает таковую среди женщин контрольной группы (35 и 17% соответственно, p<0,05).

Таблица 9. Частота генотипов rs699947–2578 A→C в гене VEGF-А в сравниваемых группах

Примечание. * — различия статистически значимые при p<0,05.

По данным международного банка однонуклеотидных полиморфизмов dbSNP, частота встречаемости аллеля A в локусе rs699947 гена VEGF-A составляет 32,45% (по данным проекта «1000 Genomes») и 36,48% (по данным проекта клинических генотипирований TOPMED). Минимальная частота аллеля A локуса rs699947 составляет 16,5% (в африканской популяции), максимальная — 49,5% (в европейской популяции) [9].

По данным нашего исследования, в образцах крови, полученных от 197 беременных, присутствует ДНК из 394 хромосом (по 2 хромосомы, содержащие ген VEGF-A), среди которых обнаружено 146 хромосом с аллелем A в локусе rs699947, что соответствует частоте 37%. В контрольной же группе средняя частота встречаемости аллеля A в локусе rs699947 гена VEGF-A составляет 41,5%, что близко к европейской популяционной частоте аллеля A и находится внутри измеренного диапазона встречаемости аллеля A в локусе rs699947. При этом наблюдается статистически значимая разница между частотами гомозигот по аллелю A и C в основной и контрольной группах. При статистически незначимой частоте гетерозигот в основной и контрольной группах в основной группе присутствует примерно в 2 раза больше гомозиготных носителей аллеля C в локусе rs699947 и в 2 раза меньше носителей аллеля A в локусе rs699947. Эти данные свидетельствуют о протективном действии аллеля A в гомозиготном состоянии, уменьшающего риск развития ПЭ примерно в 2 раза. Вместе с тем гомозиготное носительство аллеля C в локусе rs699947 указывает на повышенный риск развития ПЭ примерно в 2 раза. При этом гетерозиготность локуса rs699947 никак не влияет на риск развития ПЭ. Таким образом, по локусу rs699947 в точке полиморфизма — 2578 A⇒C гена VEGF-A статистически значимой связи с ПЭ не выявлено.

Выводы

Генотипическими предикторами развития преэклампсии являются гомозиготное носительство аллеля «C» rs11091046 в гене рецептора ангиотензина II (AGTR2), гомо- и гетерозиготное носительство аллеля «C» rs4880 (A16V) в гене митохондриальной супероксиддисмутазы (SOD2) и гомозиготное носительство аллеля «T» rs3025039 (C936T) в гене фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.