Существуют данные, что беременные женщины более восприимчивы к инфицированию вирусом папилломы человека (ВПЧ, HPV — Human papillomavirus), чем небеременные. Количество случаев выявления ВПЧ у беременных женщин (соотношение инфицированных и неинфицированных 42:1) достаточно велико, чтобы иметь основания для максимально подробного изучения не только характеристики вирусного спектра, но и взаимодействия его с влагалищным биоценозом [1]. Исследователи [2] показывают, что до 30% женщин без признаков поражений шейки матки являются носительницами ВПЧ. При этом авторы отмечают, что не наблюдается ассоциации Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis с ВПЧ, судя по данным метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Нет единого мнения относительно сосуществования вирусной микстинфекции и биотопа влагалища. Датские исследователи [3], изучавшие популяцию женщин, живущих с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), полагают, что ВПЧ и бактериальный вагиноз (БВ) не являются предиктором в отношении выделения ВИЧ. В других работах [4—6] указывается, что вирусная инфекция является важным фактором риска развития БВ. В частности, есть данные, что БВ связан с заболеваниями, передающимися половым путем (ЗППП), или такими патогенами, как вирус иммунодефицита человека, ВПЧ, вирус простого герпеса 1-го и 2-го типов и Neisseria gonorrhoeae.

Говоря об инфицировании ВПЧ, все чаще обращают внимание, что геном хозяина отвечает изменением экспрессии генов различных сигнальных путей. Показано, что эти процессы лежат в основе канцерогенеза. Проведена оценка изменения экспрессии генов, участвующих в неопластическом прогрессировании цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN — Cervical Intraepithelial neoplasia) [7].

С использованием анализа микрочипов проведено крупномасштабное профилирование экспрессии генов на HPV16-CIN2, HPV16-CIN3 в нормальных кератиноцитах шейки матки, полученных из двух очагов HPV16-CIN2, двух — HPV-CIN3 и двух нормальных тканей шейки матки соответственно. Идентифицировано 37 генов-кандидатов с постоянно увеличивающейся или уменьшающейся экспрессией во время прогрессирования CIN. Изучение экспрессии генов позволило рекомендовать дополнительный маркер потенциального прогрессирования CIN — ген фосфоглицератдегидрогеназы [7].

Цель исследования — изучение экспрессии генов, детерминирующих клеточную пролиферацию и апоптоз у беременных с ВПЧ, и оценка влияния вирусной инфекции на состояние биоценоза влагалища у этих женщин.

Исследование проводили в 2013—2014 гг. на базе кафедры акушерства, гинекологии и репродуктивной медицины медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов». В нем приняли участие 82 беременные женщины в возрасте от 23 лет до 31 года, являвшихся носительницами ВПЧ. Все женщины состояли на учете в женской консультации и обследованы в соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.11.12. № 572н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология (за исключением использования вспомогательных репродуктивных технологий)» (с изменениями и дополнениями) [8].

Все участницы дали информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии включения: беременные женщины, инфицированные ВПЧ. Критерии исключения: угроза прерывания беременности, при которой требуется соответствующее лечение; острые и подострые инфекционно-воспалительные заболевания, при которых необходима системная антибиотикотерапия; наличие ЗППП; злокачественные заболевания шейки матки.

Всем женщинам, включенным в исследование, проведены количественный анализ биоценоза влагалища и определение серотипов ВПЧ (набор реагентов Фемофлор, «ООО «ДНК-технология», Россия). В клетках эпителия цервикального канала определяли уровень экспрессии матричной РНК (мРНК) генов VEGFA, TGFb, BCL-2, BAG1, BAX методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени (реактивы и детектирующий амплификатор производства «ООО «ДНК-Технология», Россия).

Во избежание деградации мРНК взятие материала проводилось в пробирки со средой для стабилизации РНК в биопробах (набор реагентов Стор-экс, «ООО «ДНК-Технология», Россия). Выделение РНК проводили с использованием набора Проба Н.К. («ООО «ДНК-Технология», Россия). Принцип метода основан на лизисе клеток, осаждении РНК изопропанолом в присутствии соосадителя, последующих отмывках и элюции РНК. В реакции использовали олигонуклеотиды, специфичные в отношении транскриптов генов и не отжигающиеся на матрице геномной ДНК, поэтому обработка образцов дезоксирибонуклеазой не требовалась. Реакцию обратной транскрипции ставили при температуре 40 °C в течение 30 мин с последующей инактивацией обратной транскриптазы в течение 5 мин при температуре 95 °С. В реакции обратной транскрипции использовалась смесь специфических олигонуклеотидов всех исследуемых генов. Амплификация осуществлялась в режиме реального времени с измерением уровня флюоресценции по каналу FAM на каждом цикле при температуре отжига праймеров 64 °C. Реализацию «горячего старта» обеспечивали использованием Taq-полимеразы, активность которой блокировалась антителами и восстанавливалась при прогреве 94 °C в течение 5 мин. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки. Уровень экспрессии мРНК измеряли в относительных единицах, нормировку уровня экспрессии мРНК исследуемых генов проводили методом сравнения пороговых циклов (метод ΔCр) относительно референсных генов B2M, TBР, GUSB, HPRT1.

Статистический анализ полученных данных осуществляли при помощи пакета программ Statistica for Windows 6.0. Пользовались методами описательной статистики и рядом непараметрических критериев для проверки статистической значимости различий. Количественные показатели представляли в виде Ме (25% Q;75%Q), где Мe — медиана, а (25% Q—75%Q) — интерквартильный размах показателя. Закон распределения признаков оценивали при помощи критерия Колмогорова—Смирнова, он оказался отличным от нормального. Для показателей, характеризующих качественные признаки, указывали абсолютное число и относительную величину в процентах (%) [9]. Проверку статистической значимости различий количественных показателей, отличающихся от нормального распределения, проводили при помощи непараметрических критериев. Анализ различий в независимых выборках выполняли с помощью U-критерия Манна—Уитни. Различия качественных признаков анализировали при помощи критерия χ² [10].

Средний возраст обследованных пациенток составил 29,2±3,3 года. Они находились в I триместре гестации (срок беременности составил в среднем 10,3±0,9 нед и колебался в пределах от 8 до 14 нед). Общая клиническая характеристика обследованных пациенток представлена в табл. 1.

Изучен спектр вирусных серотипов (табл. 3).

Из ВПЧ ВКР наиболее часто выделялись серотипы 16, 52 и 56. Обнаружена корреляция ряда вирусных серотипов и отдельных представителей микробного биотопа влагалища (табл. 4):

Вычислены уровни нормализованных экспрессий генов, детерминирующих процессы роста или апоптоза (табл. 5),

В целом по выборке экспрессии изучаемых генов выявлены статистически значимые различия с показателями группы контроля в выраженности экспрессии генов VEGFA, TGFb, BCL-2 и BAG1 (см. табл. 6). В случае выделения подгруппы с отдельным серотипом вируса обнаружена разница в степени пенетрантности изучаемых генов в зависимости от серотипа, за исключением экспрессии гена BAX: уровень его экспрессии статистически значимо не различался в зависимости от серотипа с показателями контроля. С использованием непараметрического критерия Манна—Уитни проведен сравнительный анализ выраженности экспрессии генов в зависимости от результата цитологического исследования у беременных носительниц ВПЧ (табл. 7).

Ряд исследователей [11] полагают, что БВ и аэробный вагинит могут быть сопряжены с повышением уровня ВПЧ. Нами выявлена ассоциация концентрации возбудителей БВ и ряда штаммов ВКР ВПЧ. В работе K. Nam и соавт. [12] отмечено отсутствие статистически значимых различий в характеристиках пациентов в группах, разделенных по наличию Б.В. При этом частота возникновения CIN была значительно выше у пациентов с БВ (р=0,043), однако наличие инфекции ВПЧ как таковой не имело статистически значимой связи с БВ.

В настоящем исследовании обнаружено, что носительство ВПЧ изменяет ряд показателей экспрессии генов, детерминирующих апоптоз и пролиферацию. Показано, что на фоне ВПЧ повышается экспрессия TGF-b, что препятствует эффективному подавлению вируса [13]. Эти данные согласуются с полученными нами. Есть мнение, что повышение уровня экспрессии BCL-2 на фоне ВПЧ может служить предиктором развития предраковых процессов и рака цервикального канала [14]. Нами также отмечена разница в экспрессии этого гена при сравнении таковой у пациенток с HSIL с контрольными показателями. Кроме того, у носительниц ВКР ВПЧ экспрессия BCL-2 повышена по сравнению с показателями у пациенток группы контроля.

Таким образом, в настоящем исследовании показана ассоциация ВКР ВПЧ и ряда возбудителей Б.В. Выявлена способность ВПЧ изменять экспрессию генов, ответственных за апоптоз. У беременных носительниц ВПЧ ВКР отмечен более высокий уровень экспрессии генов VEGFA, TGFb, BCL-2 и BAG1.

Выявлена способность вирусов папилломы человека изменять экспрессию генов, ответственных за апоптоз. У беременных носительниц вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска отмечен более высокий уровень экспрессии генов VEGFA, TGFb, BCL-2 и BAG1. Вирусы папилломы человека высокого канцерогенного риска ассоциированы с наличием ряда возбудителей бактериального вагиноза.

Финансирование. Публикация подготовлена при поддержке Программы ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки России«5−100».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Б.В.

Сбор и обработка материала — Т.Н.

Статистический анализ данных — Б.В.

Написание текста — Т.Н.

Редактирование — Т.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

ИНФОМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:

Бебнева Т.Н. — к.м.н., доц. кафедры акушерства, гинекологии и репродуктивной медицины факультета повышения квалификации медицинских работников Медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки России; врач ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава России, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0003-1095-2008; e-mail: bebn@mail.ru

Шилов Б.В. — к.м.н., доц. кафедры биоинформатики МБФ ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия; e-mail: borisshilov@gmail.com

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Бебнева Т.Н., Шилов Б.В. Изменения экспрессии ряда генов и микробиома на фоне папилломавирусной инфекции у беременных женщин. Проблемы репродукции. 2019;25(6):-111. https://doi.org/10.17116/repro201925061

Автор, ответственный за переписку: Бебнева Т.Н. —
e-mail: bebn@mail.ru