Мужское бесплодие и/или патозооспермию следует рассматривать, с одной стороны, как интегральный показатель нездоровья мужчин репродуктивного возраста, а с другой — как лимитирующий фактор суммарного коэффициента рождаемости. Доля мужского фактора бесплодия составляет не менее 50%. Среди причин мужского бесплодия неизвестной этиологии (30—40%) упоминаются активные формы кислорода (ROS), генетические, эпигенетические факторы и эндокринные дизрапторы (endocrine disruptors — EDs) [1—4].

На сегодняшний день значение эндокринных дизрапторов в регуляции деятельности систем жизнеобеспечения и размножения изучено недостаточно. К наиболее известным нестойким убиквитарным эндокринным дизрапторам относятся: фталаты, ВРА, триклозан и 4-нонилфенол.

ВРА входит в состав полимерных материалов, которые применяются для производства широчайшего круга изделий: детских игрушек, пластиковых контейнеров, внутренних покрытий металлических банок для продуктов питания и напитков, материалов для зубных пломб и пр. Загрязнение продуктов питания и питьевой воды происходит за счет миграции ВРА из материалов, упаковки, пластиковых бутылок и внутренних покрытий консервных банок. По данным литературы [5—8], в образцах мочи ВРА обнаруживается в 85—100% случаев.

Связь между уровнем ВРА в образцах мочи и мужским репродуктивным здоровьем подробно изучена во многих исследованиях [6—13]. Однако обращает на себя внимание тот факт, что результаты этих исследований носят противоречивый характер. Вместе с тем в доступной нам литературе [14] имеется единственная работа по изучению влияния ВРА, находящегося в семенной жидкости, на концентрацию стероидных гормонов и качество спермы у мужчин. Т. Geens и соавт. [15] показали, что BPA, триклозан и 4-нонилфенол неодинаково накапливаются в тканях организма человека, и поэтому измерение уровня этих соединений в образцах мочи не может отражать их истинного влияния на репродуктивные органы и репродуктивное здоровье человека в целом. Практически совсем не изучена в эксперименте связь между концентрацией ВРА в тканях яичка c его морфофункциональным состоянием и функцией.

Цель исследования — изучить зависимость герминативной и эндокринной функций яичек у мужчин и экспериментальных животных от концентрации бисфенола, А (ВРА) в семенной жидкости и ткани яичка.

В обсервационном одноцентровом одномоментном (поперечном) исследовании, которое проведено в ООО «ДНК клиника» (Челябинск) с ноября 2017 г. по июнь 2018 г. приняли участие 53 мужчины молодого возраста. Пациенты обратились в клинику для выполнения спермиологического анализа в связи с бесплодием в браке, невынашиванием беременности партнершей, а также планированием беременности или донорством спермы. При оценке качества 53 образцов эякулята мужчины разделены на две группы: 1-я группа (n=19) — мужчины с нормозооспермией, планирующие беременность в супружеской паре и доноры спермы; 2-я группа (n=34) — мужчины с патозооспермией, с идиопатической формой бесплодия. Спермиологическое исследование проводили согласно рекомендациям ВОЗ (2010) с учетом оценки количества сперматозоидов, их подвижности и морфологии, а также индекса фрагментации ДНК сперматозоидов [16]. Заключение по спермограмме «нормозооспермия или патозооспермия» основывалось на критериях, изложенных в тех же рекомендациях ВОЗ (2010) [16]. Для оценки индекса фрагментации ДНК сперматозоидов использовали метод дисперсии хроматина спермы (sperm chromatin dispersion — SCD) с помощью набора GoldCyto DNA Assist Kit («MTM laboratories AG», Германия). Референсным значением степени фрагментации ДНК сперматозоидов считали 15% и менее (низкий риск нарушения фертильности). ВРА в семенной жидкости определяли на газовом хроматографе с масс-спектрометром Shimadzu GCMS-QP2010Ultra («Shimadzu Corporation», Япония). Данные обрабатывали с помощью программы GCMSsolution 4,3 («Shimadzu Corporation», Япония). Оценку уровня общего тестостерона и эстрадиола плазмы крови проводили на приборе Immulite 1000 («Siemens Healthcare Diagnostics Inc.», США).

С целью оценки морфофункциональных изменений в герминативном и эндокринном аппаратах яичек, обусловленных действием ВРА, выполнена экспериментальная часть работы на белых половозрелых лабораторных крысах-самцах Wistar (n=20). Экспериментальные животные разделены на две группы исследования: 1-я группа — контрольная (n=10) и 2-я группа — опытная (n=10). Крысы опытной группы в течение 2 мес ежедневно получали с пищей ВРА со степенью гомогенности >97% («Sigma—Aldrich», США) в количестве 200 мг на 1 кг массы тела. Работа с лабораторными животными выполнена в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения СССР № 755 от 12.08.77 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».

После взвешивания яичек зрелые сперматозоиды получали из придатка по общепринятой методике с оценкой общего количества сперматозоидов в 1 мл с подсчетом их атипических форм и количества фертильных сперматозоидов [17—20]. Серийные срезы яичек окрашивали гематоксилином и эозином. Морфометрические измерения выполняли при помощи лицензированного программного обеспечения Видео Тест-Морфология 5.0. Проводили измерение диаметра и площади извитых семенных канальцев, площади паренхимы и стромы яичек, толщины сперматогенного эпителия, общего количества канальцев и количества канальцев со слущенным эпителием, а также осуществляли подсчет общего количества и площади клеток Лейдига с их ядерно-цитоплазматическим отношением (ЯЦО) в 10 полях зрения (площадь одного поля зрения — 8,8·10⁵ мкм²) с вычислением средних значений.

С целью измерения концентрации исследуемого эндокринного дизраптора в тканях яичек левое яичко полностью гомогенизировали в стеклянно-тефлоновом гомогенизаторе, а затем подвергали центрифугированию при ускорении 700 × g в течение 10 мин при температуре 4 °C, чтобы удалить детрит и ядра. Образовавшаяся в результате надосадочная жидкость использована для измерения концентрации ВРА методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией (GC-MS). Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью программы IBM SPSS Statistics v.21 («IBM Corp.», Armonk, NY, США). Проверку нормальности распределения переменных проводили с учетом объема выборки с использованием критерия Колмогорова—Смирнова. Результаты исследования представлены как медиана с интерквартильным размахом Me (Q₁; Q₃) или как средняя со стандартным отклонением (M±σ) при нормальном распределении. Для определения статистически значимых различий между группами использовали U-критерий Манна—Уитни. Для установления связи между показателями вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Различия между группами считали статистически значимыми при р<0,05.

Средний возраст пациентов составил 30,8±3,6 года, средний индекс массы тела (ИМТ) — 25,4±2,9 кг/м², при этом 42% мужчин имели избыточную массу тела (ИМТ 25—30) и 11% — ожирение I степени (ИМТ>30 кг/м²). Группы сравнительного анализа сопоставимы по возрасту, периоду воздержания от семяизвержений, ИМТ, курению и приему алкоголя (табл. 1).

В 100% образцов эякулята обнаружен ВРА со срединной концентрацией 0,15 (0,06—0,31) нг/мл. У мужчин 2-й группы частота тератозооспермии составила 30% (n=16), астенотератозооспермии — 22,5% (n=12), олиготератозооспермии — 7,5% (n=4), олигоастенотератозооспермии (ОАТ-синдром) — 4% (n=2).

Группы пациентов, включенных в исследование, статистически значимо различались по концентрации ВРА в семенной жидкости (р<0,001), а также индексу фрагментации ДНК сперматозоидов (р=0,001). Так, у мужчин с нормозооспермией концентрация ВРА в семенной жидкости оказалась меньше 0,05 (0,04—0,08) нг/мл, чем у мужчин с патозооспермией 0,21 (0,14—0,47) нг/мл, то же самое справедливо и в отношении индекса фрагментации ДНК сперматозоидов — 14,0% (8,5—17) по сравнению с 19% (16—25) (рис. 1, 2).

С помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена между концентрацией ВРА в семенной жидкости и параметрами эякулята, а также уровнем общего тестостерона и эстрадиола плазмы крови установлены определенные корреляционные связи (табл. 2).

В экспериментальной части работы обнаружено статистически значимое различие концентрации ВРА (р<0,001) в тканях яичек крыс опытной и контрольной групп. Полученные результаты свидетельствуют о снижении абсолютной массы яичек у крыс опытной группы по сравнению с группой контроля. У крыс опытной группы, подвергшихся воздействию ВРА, отмечено снижение общего количества сперматозоидов с увеличением их атипичных форм и уменьшением количества фертильных сперматозоидов (прогрессивно и слабоподвижные категории) по сравнению с животными контрольной группы (табл. 3).

С помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена между концентрацией ВРА в тканях яичка и морфометрическими показателями сперматогенеза и клетками Лейдига обнаружили следующие корреляционные связи: обратная, высокой тесноты (по шкале Чеддока) с диаметром извитых семенных канальцев (r= –0,870; р=0,001); с толщиной сперматогенного эпителия (r= –0,870; р=0,001); с долей прогрессивно подвижных сперматозоидов (r= –0,870; р=0,001), а также с площадью клеток Лейдига и их ЯЦО (r= –0,731; р=0,001) (табл. 5).

Вместе с этим установлено, что исследуемый дизраптор имеет склонность накапливаться в тканях яичек, так концентрация ВРА в тканях яичка в среднем в 9 раз превышала таковую у подопытных животных по сравнению с животными контрольной группы.

В данном исследовании обнаружены корреляционные связи между концентрацией ВРА в семенной жидкости и параметрами эякулята (общее количество, концентрация, подвижность, морфология и фрагментация ДНК сперматозоидов), а также концентрацией общего тестостерона в крови у мужчин.

Кроме того, в эксперименте установлено, что исследуемый эндокринный дизраптор вызывает нарушение генеративного (уменьшение размеров яичек, диаметра извитых семенных канальцев, толщины сперматогенного эпителия, ухудшение параметров спермы), а также эндокринного аппаратов (уменьшение количества и размеров клеток Лейдига и снижение их ЯЦО) и яичек половозрелых крыс.

J. Vitku и соавт. [14] в ходе исследований влияния ВРА, находящегося в семенной жидкости, на качество эякулята и репродуктивные гормоны обнаружили отрицательные статистически значимые корреляционные связи с концентрацией, количеством и морфологией сперматозоидов, а также уровнем общего тестостерона плазмы крови, тогда как с уровнем эстрадиола связь оказалась статистически незначимой. Полученные чешскими исследователями [7, 9—11] данные совпадают с отдельными результатами нашего исследования, что также отчасти согласуется с результатами других работ, но вместе с тем противоречит ряду некоторых данных [8, 12]. В отношении связи ВРА с высокой фрагментацией ДНК сперматозоидов результаты нашего исследования согласуются с данными J. Meeker и соавт. [7], однако А. Goldstone и соавт. [12] в своей работе показали снижение фрагментации ДНК сперматозоидов, связанное с высоким уровнем ВРА в моче. Это противоречие может быть связано с измерением ВРА в разных биологических средах — моче и семенной жидкости и неодинаковым накоплением фенольных соединений в тканях организма человека [15]. По этой же причине некоторые исследователи [6, 11] обнаруживают положительную связь ВРА с уровнем тестостерона в крови, что противоречит как нашим результатам, так и данным С. Desdoits-Lethimonier и соавт. [21] о статистически значимом дозозависимом снижении тестостерона от уровня концентрации ВРА в культуре ткани яичка. Отрицательная связь между ВРА и уровнем тестостерона крови продемонстрирована во многих экспериментальных исследованиях на животных [21—28]. Кроме того, в ряде работ убедительно показано негативное влияние ВРА на гистоморфологию яичек и параметры спермы у крыс [25—33]. Однако J. Ashby и соавт. [34], проведя серию исследований с ВРА на крысах, не обнаружили нарушений в ежедневной продукции спермы, что авторы объяснили различной генетически обусловленной чувствительностью линий крыс к ВРА.

Впервые в данном исследовании оценена концентрация ВРА непосредственно в семенной жидкости мужчин и яичках животных и показано их влияние на качество спермы. По нашему мнению, обнаружение ВРА именно в семенной жидкости и тканях яичка в условиях эксперимента может отражать прямое и токсическое действие данного эндокринного дизраптора на сперматогенез и эндокринную функцию яичка. Ранее нами установлена точка разделения (cut off) уровня концентрации ВРА в семенной жидкости между нормозооспермией и патозооспермией у мужчин с идиопатической формой бесплодия [35].

Бисфенол, А в семенной жидкости нарушает сперматогенную и эндокринную функции яичка у мужчин и половозрелых крыс, что подтверждено снижением параметров спермы и ухудшением гистоморфологических характеристик яичек, а также снижением уровня общего тестостерона крови у мужчин и общего количества и площади клеток Лейдига и их ядерно-цитоплазматического отношения. Кроме того, отмечено повышение индекса фрагментации ДНК сперматозоидов.

Вместе с тем показано избирательное накопление репротоксиканта бисфенола, А в тканях яичка в эксперименте и семенной жидкости у мужчин, что создает необходимые условия для его прямого и длительного токсического действия. Таким образом, анализ полученных результатов позволяет рассматривать повышенный уровень концентрации бисфенола, А в семенной жидкости как один из причинных факторов идиопатической формы инфертильности или субфертильности у мужчин. В связи с этим данный показатель, на наш взгляд, можно рекомендовать для включения в алгоритм диагностического поиска причин при идиопатической форме бесплодия.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — С.Ч., Г. Б.

Сбор и обработка материала — С.Ч.

Статистическая обработка — С.Ч.

Написание текста — С.Ч.

Редактирование — Г. Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Чигринец Станислав Владимирович — аспирант кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии Южно-Уральского государственного медицинского университета Минздрава России, врач центра лечения бесплодия ДНК клиники, Челябинск, Россия. Адрес: 454092, Челябинск, ул. Воровского, 64 (ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России); 454090, Челябинск, Яблочкина, 3 (ООО «ДНК клиника»); тел.: +79120840484; e-mail: chigrinstas@gmail.com; SPIN-код: 2278-8992; https://orcid.org/0000-0002-7072-8289

Брюхин Геннадий Васильевич — д.м.н., проф., заведующий кафедрой гистологии, эмбриологии и цитологии Южно-Уральского государственного медицинского университета Минздрава России. Адрес: 454092, Челябинск, ул. Воровского, 64 (ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России); тел.: + 79222375820; e-mail: bgenvas@mail.ru; SPIN-код: 7691-8383; https://orcid.org/0000-0002-3898-766X

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Чигринец С.В., Брюхин Г.В. Влияние эндокринного дизраптора бисфенола А на функцию яичек (экспериментально-клиническое исследование). Проблемы репродукции. 2019;25(3):-121; https://doi.org/10.17116/repro201925021

Автор, ответственный за переписку: С.В. Чигринец — Южно-Уральский государственный медицинский университет;
e-mail: chigrinstas@gmail.com