Клинико-генетические параллели формирования истмико-цервикальной недостаточности при одноплодной беременности, наступившей в результате использования вспомогательных репродуктивных технологий

Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) выходят на первый план в системе оказания помощи бесплодным парам. По данным отечественных и зарубежных авторов [1, 2], ежегодно все большему количеству супружеских пар требуется применение методов ВРТ.

Женщины, у которых беременность наступила в результате использования различных методов ВРТ, входят в группу высокого риска возникновения гестационных осложнений [3—5], в том числе поздних самопроизвольных прерываний беременности и сверхранних преждевременных родов. По данным зарубежных авторов [6], отношение шансов (ОШ) преждевременных родов составляет 1,26 при 95% доверительном интервале — ДИ 1,12—1,43.

Невынашивание беременности во II триместре и сверхранние преждевременные роды могут быть связаны с не установленной вовремя и некорригированной истмико-цервикальной недостаточностью (ИЦН). По данным отечественных авторов [7], частота ИЦН при беременности после экстракорпорального оплодотворения составляет 20,6%, тогда как после спонтанной беременности — 4,4%.

ИЦН вызывается структурными и функциональными изменениями истмического отдела матки. Известно, что шейка матки является динамической анатомической структурой, которая при беременности выступает как барьер между плодом и его внутриутробной средой и влагалищем. Она состоит преимущественно из коллагена и претерпевает серьезные структурные изменения при вынашивании беременности и подготовке к родам [8].

Патогенез ИЦН изучен недостаточно. В последние десятилетия все больше авторов отводят важную роль дисплазии соединительной ткани (ДСТ) как одному из факторов риска развития ИЦН [9]. ДСТ — нутрициально и генетически детерминированное состояние, обусловленное нарушениями метаболизма соединительной ткани в эмбриональном и постэмбриональном периодах [10].

Разнообразные точечные мутации, сопровождающиеся заменой даже одной аминокислоты, вызывают изменения биологических свойств коллагена, что в свою очередь приводит к проградиентности соединительнотканных нарушений на уровне тканей и организма. Расстройство процессов ремоделирования соединительной ткани может быть обусловлено мутацией генов, кодирующих синтез и пространственную организацию коллагена и ответственных за формирование компонентов экстрацеллюлярного матрикса, а также ферментов, принимающих участие в процессах фибриллогенеза [11].

ДСТ играет определенную роль в вынашивании беременности, наступившей в результате применения ВРТ [12].

Однако работ по поиску клинических и генетических предикторов ИЦН у беременных после ВРТ на настоящий момент недостаточно, что и обусловило цель исследования.

Цель исследования — определить анамнестические и генетические предикторы формирования ИЦН при одноплодной беременности, наступившей в результате использования ВРТ.

Проведено проспективное исследование с участием 72 пациенток, у которых беременность наступила в результате использования ВРТ. Основная группа — 31 пациентка с ИЦН; контрольная группа — 41 пациентка без формирования ИЦН. Проведены анализ акушерско-гинекологического, соматического анамнеза и балльная оценка степени выраженности маркеров недифференцированной дисплазии соединительной ткани (нДСТ) по модифицированной шкале, разработанной Н.Е. Канн и соавт. [13].

Всем пациенткам проводили молекулярно-генетическое типирование полиморфных вариантов генов, кодирующих белки, которые участвуют в формировании соединительной ткани (COL1A1: –1997C>A, COL1A1: –1546G>T) и регуляции ангиогенеза (VEGF-A: –2578C>A, VEGF-A: +936C>T). ДНК выделяли из 0,5 мл венозной крови, взятой в пробирку с этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) в качестве антикоагулянта; использовали реагенты Проба ГС-Генетика (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Для оценки количества выделенной геномной ДНК применяли набор реагентов контроля взятия материала для метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Для исследования брали не менее 1,0 нг геномной ДНК на реакцию. Генотипирование образцов по аллельным вариантам исследуемых генов проводили методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени со снятием кривых плавления продуктов амплификации. Анализ результатов ПЦР проводили в автоматическом режиме программного обеспечения детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Исследование одобрено комитетом по этике ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздрава России (Екатеринбург).

Статистический анализ данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0. Различия между непараметрическими переменными определяли при помощи критерия Пирсона χ². Относительный риск оценивали по показателю ОШ; 95% Д.И. Нулевая гипотеза отвергалась при р≤0,05.

Тест на соответствие распределения генотипов закону Харди—Вайнберга в обеих выборках проводили с помощью критерия χ² с использованием программы Hardy—Weinberg Equilibrium.

Средний возраст пациенток основной группы составил 36±4,58 года, контрольной — 32±3,81 года. Хотя статистически значимых различий между группами не получено (р>0,05), следует отметить, что 64% пациенток основной группы находились преимущественно в старшем репродуктивном возрасте — от 35 лет до 41 года. Средний индекс массы тела у пациенток основной группы составил 22,9±4,12 кг/м², контрольной — 23,1±4,15 кг/м² (р>0,05).

Повторнородящими были 38,7% пациенток основной группы и 24% — контрольной (p>0,05). Большинство женщин основной группы имели аборты в акушерском анамнезе; причем в 9,7% случаев их было 3 и более, что чаще, чем у пациенток контрольной группы (p<0,05).

Пациентки основной группы значительно чаще, чем пациентки контрольной группы, имели в анамнезе потери беременности во II триместре (12,9 и 2,4% соответственно; p<0,05). В 2 случаях произошло позднее самопроизвольное прерывание беременности на 18—19-й неделе и 20—21-й неделе, в 1 случае — сверхранние преждевременные роды на 24—25-й неделе и ранние преждевременные роды на 26—27-й неделе, что может свидетельствовать о формировании ИЦН во время предыдущих беременностей.

Первобеременными были 29% пациенток основной группы и 46% — контрольной (p=0,05).

При анализе структуры причин бесплодия обнаружено, что статистически значимо чаще выявлялось бесплодие неясного генеза (у пациенток основной группы оно встречалось в 19,3% случаев, тогда как у пациенток контрольной группы — в 4,9% (p<0,05). Структура факторов, вызывающих развитие бесплодия в исследуемых группах, представлена на рис. 1.

При балльной оценке степени выраженности фенотипических маркеров нДСТ у пациенток обеих групп статистически значимых различий не выявлено; однако обнаружена следующая тенденция: у 25% пациенток основной группы оценка составила более 10 баллов, что в 3 раза выше, чем у пациенток контрольной группы (7%).

Таким образом, для выявления групп риска развития ИЦН недостаточно определения клинико-анамнестических предикторов. Необходимы дополнительные критерии для большей эффективности прогнозирования этого осложнения беременности.

Результаты молекулярно-генетического типирования полиморфных вариантов генов, кодирующих белки, которые участвуют в формировании соединительной ткани (COL1A1: –1997C>A, COL1A1: –1546G>T) и регуляции ангиогенеза (VEGF-A: –2578C>A, VEGF-A:+936C>T), свидетельствуют, что характер распределения аллелей и генотипов по полиморфным вариантам гена коллагена и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в обеих группах соответствует равновесию Харди—Вайнберга.

Анализ распределения генотипов по полиморфным маркерам исследуемых генов не выявил статистически значимых различий между пациентками основной и контрольной групп (рис. 2).

Распределение частот аллелей по полиморфным локусам исследуемых генов (табл. 1)

Различий в частоте аллелей по полиморфному маркеру –1546G>T этого же гена в исследуемых группах не выявлено.

При сравнительном анализе распределения частот аллелей по полиморфным маркерам VEGF-A: –2578C>A и +936C>T гена VEGF у женщин основной группы выявлена статистически значимо большая, чем у женщин контрольной группы, частота полиморфизма VEGF-A: –2578C>A (p<0,04; OР 2,57 при 95% ДИ 1,04—6,39). Частота генотипов и аллелей по полиморфным локусам VEGF-A:+936C>T были сходными у пациенток обеих исследуемых групп (см. табл. 1).

Полученные результаты распространенности полиморфных аллелей генов COL1A1 и VEGF-A у женщин контрольной группы совпали с соответствующими данными базы NCBI (db SNP) (табл. 2).

Для оценки возможного влияния генотипа на риск формирования ИЦН использована доминантная модель распределения частот генотипов по исследуемым полиморфным маркерам изучаемых генов у пациенток основной и контрольной групп.

Полученные результаты анализа распределения генотипов выявили значимость полиморфного маркера COL1A1: –1997C>A в риске формирования ИЦН: вариантный аллель –1997A можно расценивать как аллель «риска» развития данной патологии, так как его присутствие в генотипе в гомо- или гетерозиготном состоянии увеличивает шанс формирования ИЦН (p<0,03; ОР 4,40 при 95% ДИ 1,11—17,44). Генотип COL1A1: –1997CС, наоборот, дает протективный эффект в отношении ИЦН (p<0,03; ОР 0,23 при 95% ДИ 0,90—0,06) (табл. 3).

Ген COL1A1 кодирует аминокислотную последовательность цепи альфа-1 белка коллагена I типа. Молекула коллагена I типа состоит из трех полипептидных цепей (альфа-цепи). Мономер коллагена имеет структуру тройной спирали, которая придает коллагену I типа многие из его уникальных свойств. Мутации, которые влияют на образование стабильной тройной спирали, не позволяют коллагену организовываться в волокна, что приводит к функциональным дефектам соединительной ткани.

Полиморфизм в регуляторной области гена COL1A1 –1997А>C приводит к изменению соотношения цепей альфа-1 и альфа-2 и к нарушению структуры коллагена. Установлено, что вариант аллеля –1997C ведет к повышению уровня транскрипции гена COL1A1 и гиперпродукции цепи α₁, что приводит к дезорганизации соединительной ткани [14].

Полученные нами результаты ассоциации риска формирования ИЦН с вариантным аллелем COL1A1 –1997C позволяют предполагать наличие генетической предрасположенности к ДСТ как фактора риска развития ИЦН при беременности.

Центральная роль в регуляции ангиогенеза принадлежит семейству близких между собой по структуре белков — VEGF. Наиболее изученным представителем этого семейства является VEGF-A, который контролирует морфогенез кровеносных сосудов, в то время как VEGF-D и VEGF-C ответственны за образование лимфатических сосудов.

Экспрессия гена VEGF-A регулируется различными факторами. По данным ряда исследователей, полиморфизм промоторного региона гена VEGF-A в позиции –2578A>C ассоциирован с уровнем экспрессии VEGF-A. Аллель –2578C связан с высоким уровнем экспрессии продукта. По данным Л.М. Комиссаровой, генотип 2578СC является протективным в отношении формирования нДСТ, в то время как генотип АА ассоциирован с повышением риска развития нДСТ [15]. Выполненные нами исследования возможной взаимосвязи полиморфных маркеров гена VEGF-A: –2578C>A и +936C>T с риском формирования ИЦН выявили ассоциацию вариантного аллеля –2578A гена VEGF-A с данной патологией. Альтернативный аллель –2578C дает протективный эффект в отношении формирования ИЦН.

1. Клинико-анамнестическими предикторами ИЦН у беременных после применения вспомогательных репродуктивных технологий с одноплодной беременностью являются: 3 медицинских аборта и более в анамнезе, указание в анамнезе на потери беременности во II триместре, бесплодие неясного генеза

2. Генетическим предиктором риска формирования истмико-цервикальной недостаточности при одноплодной беременности, наступившей в результате применения вспомогательных репродуктивных технологий, является вариантный аллель –1997А полиморфного локуса –1997C>A гена COL1A1, так как его присутствие в генотипе в гомо- или гетерозиготном состоянии увеличивает шанс формирования истмико-цервикальной недостаточности (p≤0,05; ОР 3,27 при 95% ДИ 1,01—10,79). Генотип COL1A1: –1997CС, наоборот, дает протективный эффект в отношении истмико-цервикальной недостаточности (p<0,03; ОР 0,23 при 95% ДИ 0,9—0,06).

3. Статистически значимым фактором риска формирования истмико-цервикальной недостаточности является полиморфизм –2578C>A гена фактора роста эндотелия сосудов: у пациенток основной группы частота аллеля –2578A выше, чем у пациенток контрольной (p<0,04; ОР 2,57 при 95% ДИ 1,04—6,39).

4. Для выявления риска формирования истмико-цервикальной недостаточности при одноплодной беременности, наступившей после применения вспомогательных репродуктивных технологий, целесообразно оценивать клинико-анамнестические данные пациентки, фенотипические маркеры дисплазии соединительной ткани у беременной и рекомендовать молекулярно-генетическое типирование полиморфных вариантов генов: локуса –1997C>A гена COL1A1 и локуса –2578C>A гена VEGF-A.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г. М., А.Ф., Т.Т.

Сбор и обработка материала — А.Ф., И.Д., Е.В.

Статистическая обработка — А.Ф., Н.Р.

Написание текста — Г. М., А.Ф., Т.Т., Н.Р.

Редактирование — Г. М., А.Ф., Т.Т., Н.Р.

Сведения об авторах

Мальгина Галина Борисовна — д.м.н., зам. дир. ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздрава России по научно-исследовательской работе, Екатеринбург, Россия. Тел.: +7(343)3710878;

https://orcid.org/0000-0002-5500-6296; e-mail: galinamalgina@mail.ru

Фассахова Айгуль Фаритовна — мл.н.с. отд. антенатальной охраны плода, аспирант ФГБУ«Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздрава России, Екатеринбург, Россия. Тел: +7(343)3710878;

https://orcid.org/0000-0001-5574-4849; e-mail: aigylishna@yandex.ru

Третьякова Татьяна Борисовна — к.м.н., ст.н.с. отд. биохимических методов исследования с группой генетики ФГБУ«Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздрава России, Екатеринбург, Россия. Тел.: +7(343)3710878; https:/orcid.org/0000-0002-5715-7514

Рукосуев Никита Евгеньевич — мл.н.с. отд. биохимических методов исследования с группой генетики ФГБУ«Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздрава России,. Екатеринбург, Россия. Тел.: +7(343)3710878;

https://orcid.org/0000-0001-7456-5790

Данькова Ирина Владимировна — к.м.н., ст.н.с. отд. сохранения репродуктивной функции женщин ФГБУ«Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздрава России, Екатеринбург, Россия.Тел.: +7(343)3710878;

https://orcid.org/0000-0002-7893-4722

Винокурова Елена Александровна — к.м.н., зав. консультативно-диагностическим отд. ФГБУ«Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздрава России, Екатеринбург, Россия. Тел.: +7(343)3710878;