В соответствии с определением, данным S. Bulun [15] в 2009 г., эндометриоз представляет собой эндометриоидную ткань, расположенную вне матки на тазовой брюшине и яичниках.

По данным эпидемиологических исследований [20, 38], распространенность эндометриоза значительно варьирует и наблюдается у 10% женщин репродуктивного возраста, что составляет более 150 млн женщин во всех странах мира.

В 1986 г. были опубликованы прямые клинические достоверные данные о связи эндометриоза и бесплодия путем сравнения результатов наступления беременности на фоне внутриматочной инсеминации у женщин с эндометриозом и без него. Показано, что у больных эндометриозом частота наступления беременности в расчете на цикл инсеминации составляет 3,6%, в контрольной группе женщин без эндометриоза - 12% [25].

В расширенном обзоре И.Ю. Шуляк и соавт. [8] проведен анализ многочисленных исследований патогенеза бесплодия при эндометриозе. По мнению авторов, эта проблема остается неясной и находится на стадии выявления и накопления отдельных фактов.

Д.В. Богуславская и D. Lebovic [1] в 2011 г. представили данные о том, что современная наука не в состоянии объективно ответить на вопрос, почему эндометриоз ведет к возникновению бесплодия. Тем не менее ими признается, что функциональные изменения эндометрия могут приводить к нарушению имплантации у женщин с эндометриозом.

Сопутствующее бесплодие у многих женщин с эндометриозом, вероятно, зависит от нескольких факторов, один из которых может быть связан с состоянием эутопического эндометрия. Известно, что у женщин с эндометриозом он менее восприимчив к имплантации эмбриона, чем у женщин без эндометриоза [21, 28]. Установленное негативное влияние клинических факторов на уменьшение эндометриальной рецептивности в период окна имплантации, несомненно, способствует снижению фертильности [40]. Другие признаки дисфункции эутопического эндометрия включают: увеличение ангиогенной активности, повышение активности ароматазы, изменение децидуализации, снижение апоптоза и дисрегуляция избыточного уровня прогестерона [9, 12, 18, 22].

Отличительной особенностью эутопического эндометрия у женщин с эндометриозом по сравнению со здоровыми женщинами является наличие высокой плотности демиелинизированного сенсорного нервного волокна в функциональном слое эндометрия (PGP 9.5) [41]. В 2001 г. K. Sharpe-Timms [39] описал различия гистологической структуры эутопического эндометрия у больных с эндометриозом, изменения в регулировании молекул адгезии, цитокинов и протеолитических ферментов, генетических изменений.

Многочисленные данные об эндометриальном биохимическом профиле эутопического эндометрия больных, страдающих эндометриозом и бесплодием, указывают на его существенные отличия от нормального эндометрия. Это, несомненно, полезно для поиска улучшенной стратегии влияния на эутопический эндометрий при бесплодии, ассоциированном с эндометриозом [3].

Известны две основные изоформы ядерных эстрогеновых рецепторов ЭР: ЭР-альфа был впервые клонирован в 1986 г. и ЭР-бета в 1996 г. Важная клиническая иллюстрация различий между двумя изоформами ЭР состоит в регуляции клеточной пролиферации, где ЭР-альфа наиболее часто проявляет пролиферативное действие, тогда как ЭР-бета - антипролиферативное [7].

ЭР-альфа и ЭР-бета экспрессированы в нормальном эндометрии в течение всего менструального цикла [29, 30], осуществляя управляемый рост эндометрия под действием эстрогенов [16]. Прогестерон вызывает децидуализацию эндометрия и готовит эндометрий для нидации эмбриона, проявляя действие через прогестероновый рецептор А и прогестероновый рецептор В (ПР-A, ПР-B соответственно), экспрессия обоих рецепторов выражена в эндометрии во всех фазах менструального цикла [33]. О различиях в экспрессии ЭР и ПР и их изоформ в эутопическом эндометрии при эндометриозе сообщалось ранее [10, 11, 30]. Кроме того, показано, что экспрессия ЭР-альфа и ПР-B в стромальных клетках эктопического эндометрия была снижена, возможно, за счет резистентности к прогестерону при эндометриозе [16].

Однако еще меньше известно о статистически значимых различиях в экспрессии изоформ ЭР и ПР в ядрах клеточных структур эутопического эндометрия у здоровых женщин по отношению к больным эндометриозом с наступившей беременностью - ЭБ(+) и ненаступившей беременностью - ЭБ(-).

Цель исследования - изучить плотность нервного волокна (PGP 9.5), экспрессию изоформ рецепторов эстрадиола (ЭР-альфа, ЭР-бета) и рецепторов прогестерона (ПР-А+В, ПР-В) в ядрах клеток эутопического эндометрия в период окна имплантации у женщин с эндометриозом и без эндометриоза и провести анализ этих данных в зависимости от наступления беременности в спонтанном цикле в течение 12 мес после хирургического и гормонального лечения.

Под наблюдением находились 38 женщин в возрасте 27-37 лет с перитонеальной формой эндометриоза, диагностированного во время лапароскопии, и бесплодием. Подбор и рандомизация больных осуществлялись совместно с Т.Е. Самойловой и М.А. Шороховой. Клиническая характеристика больных была представлена нами ранее [5]. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Информированное согласие на участие больных в исследовании было получено у всех пациенток.

Критерии включения в исследование: женщины репродуктивного возраста (от 27 до 37 лет); перитонеальная форма эндометриоза I-III стадии согласно классификации Американского общества репродуктивной медицины [37], бесплодие, отсутствие приема других гормональных препаратов для лечения наружного генитального эндометриоза на протяжении 3 мес перед началом исследования. Клинические проявления наружного генитального эндометриоза: нарушение менструальной функции (мено- и метроррагии), боли в нижних отделах живота и поясничной области различной интенсивности, диспареуния, бесплодие.

Критерии исключения: возраст пациентки старше 37 лет, наружный генитальный эндометриоз IV стадии, аллергические реакции на гозерелин ацетат, беременность, лактация, средняя и тяжелая экстрагенитальная патология.

Всем пациенткам были выполнены оперативные вмешательства путем лапароскопии с использованием оборудования фирмы «Karl Stors» (Германия): иссечение и/или коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза, разделение спаек в области малого таза, сальпингоовариолизис. В процессе операции с целью исключения внутриматочной патологии производилась жидкостная гистероскопия с помощью жесткого гистероскопа с микрогистероскопической насадкой и наружным диаметром 88 мм («Karl Stors», Германия), а также диагностическое выскабливание слизистой матки.

Согласно дизайну исследования, для проведения консервативной терапии после лапароскопии больные получали в послеоперационном периоде курс терапии антагонистом ГнРГ (гозерелин ацетат) по 3,6 мг ежемесячно, подкожно в течение 3 мес, интервал между введением препарата составлял 28-30 дней. По окончании консервативного лечения больные наблюдались на протяжении 12 мес. В течение этого срока у 17 женщин наступила беременность - ЭБ(+), а у 21 не наступила беременность - ЭБ(-). Наступление беременности наблюдалось в нормальных овуляторных циклах, без индукции овуляции или применения методов ВРТ.

Контрольную группу составили 20 пациенток, которым производилась стерилизация с использованием лапароскопического доступа. Эндометриоз в этой группе исключался после тщательного исследования висцеральной и париетальной брюшины на наличие гетеротопических эндометриоидных очагов. Ультразвуковое и гистероскопическое исследования матки позволили исключить у пациенток этой группы наличие аденомиоза.

Ультразвуковое исследование органов малого таза у больных проводилось до оперативного лечения и после окончания курса терапии с помощью аппарата Aloka SSD-2000 с использованием трансвагинального датчика с частотой 7,5 МГц.

Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром до операции, а также после окончания курса медикаментозной терапии (через 3 мес). Образцы сыворотки хранились при -70 °С до момента исследования. Все образцы биопсии эндометрия были получены на 7-й день после пика (±2 дня), исходя из ежемесячной оценки фазы менструального цикла и дня менструального цикла образцов эндометрия согласно стандартным критериям [34].

Иммуногистохимический анализ. Иммуногистохимическое окрашивание для ЭР и ПР было выполнено в стандартных условиях, как это описано нами ранее [12, 32]. Использовались следующие первичные антитела: мышиные моноклональные античеловеческие антитела ЭР-альфа, кроличьи поликлональные античеловеческие антитела ЭР-бета, мышиные моноклональные античеловеческие антитела ПР-A+B, мышиные моноклональные античеловеческие антитела ПР-B. Все моноклональные антитела имели класс IgG1. Соответствующий класс иммуноглобулина использовался как отрицательный контроль. Вторичные антитела: биотинизированные лошадиные антимышиные и лошадиные антикроличьи.

Оценка экспрессии ЭР, ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-А+В, ПР-В и соответствующее распределение по клеточным элементам выполнены при использовании полуколичественной системы гистологической шкалы (HSCORE) [31]: Σ Pi(i+1), где i = интенсивность окрашивания (от 0 - слабое окрашивание до 3 - самое интенсивное окрашивание), Pi - процент окрашивания эпителиальных или стромальных клеток для каждой интенсивности от 0 до 100%. Доказано, что система HSCORE является надежным инструментом оценки экспрессии эндометриальных белков по отношению к количественному определению методом RT-qPCR [36]. Учет результатов осуществлялся 2 исследователями (В.А. Бурлев и Н.А. Ильясова).

Нервные микроволокна PGP 9.5. Окрашивание эутопического эндометрия проводилось в условиях стандартного протокола. Оценка результатов осуществлялась по наличию или отсутствию специфического окрашивания нервных микроволокон (NF) в ткани эутопического эндометрия, исходя из плотности PGP 9.5 на 1 мм², как это описано ранее [3].

Анализ сыворотки крови. Определение половых и стероидных гормонов проводилось при использовании Immulite 1000 («Siemens Healthcare Diagnostics», Deerfield, IL, США) согласно инструкциям изготовителя. Концентрация в сыворотке интерлейкина (IL)-6 и С-реактивного белка (CRP) определялась при использовании иммуноферментного анализа, согласно инструкциям изготовителя (IL-6 Quantikine, R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, Объединенное королевство) и Hs-CRP CAN-CRP-4360 (IBL-America, Inc., Minneapolis, MN, США). Содержание CA-125 определялось при использовании анализатора 2010 Elecsys («Roche Diagnostics», Basel, Швейцария).

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы IBM SPSS Statistics 20. Результаты исследования представлены как средние±стандартное отклонение (М±SD). В зависимости от конкретных условий применялись: ANOVA, критерий Вилкоксона, U-критерий Манна-Уитни. Различия между группами считались достоверными при p<0,05.

Клинические данные у обследованных больных с перитонеальной формой эндометриоза с наступившей ЭБ(+) и ненаступившей беременностью ЭБ(-) представлены в табл. 1.

Содержания в крови половых пептидных и стероидных гормонов, IL-6, hsCRP и CA-125 в норме и у больных с перитонеальной формой эндометриоза с наступившей и ненаступившей беременностью. Как следует из табл. 2, различий в содержании в крови половых пептидных и стероидных гормонов, IL-6 и hsCRP в норме и у больных перитонеальной формой эндометриоза с наступившей и ненаступившей беременностью не установлено.

Плотность нервных микроволокон. Плотность нервных микроволокон в эутопическом эндометрии в контрольной группе для PGP 9.5 в 1 мм² составила 1,2±1,1, у больных эндометриозом - 11,15±4,9, различия статистически высокозначимы (p<0,001). Случаев отсутствия положительной реакции на PGP 9.5 не было. Следовательно, у всех больных с перитонеальной формой эндометриоза, диагностированного во время проведения лапароскопии, и бесплодием в исследованных образцах эутопического эндометрия выявлена избыточная плотность нервных микроволокон, что является наиболее характерным патогномоничным иммуногистохимическим признаком эндометриоза в эутопическом эндометрии [3]. Наблюдаются статистически значимые различия между плотностью нервных микроволокон у больных ЭБ(+) и ЭБ(-) за счет высоких значений у больных ЭР(-).

Экспрессии ядерных рецепторов эстрогена и прогестерона в эутопическом эндометрии в норме и у больных с перитонеальной формой эндометриоза с наступившей и ненаступившей беременностью

Из табл. 3 и 4 следует, что экспрессия в эутопическом эндометрии ЭР, ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-A+B, ПР-B выявляется в ядрах поверхностного эпителия, эпителия желез и стромальных клетках в норме, у больных ЭБ(+) и ЭБ(-).

Статистически значимых различий в экспрессии ЭР, ЭР-бета в ядрах поверхностного эпителия, эпителия желез и стромальных клетках между изученными группами не установлено (см. табл. 3).

Отмечается максимальное и статистически значимое повышение экспрессии ЭР-альфа в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез у больных эндометриозом и ненаступившей беременностью по отношению к контрольным значениям. Это статистически значимое различие экспрессии ЭР-альфа в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез наблюдается и у больных ЭБ(+) по отношению к контрольной группе. В клетках стромы нет отличительных особенностей.

Установлено, что максимальная экспрессия ЭР, ЭР-альфа и ЭР-бета наблюдается в поверхностном эпителии эутопического эндометрия и в эпителии желез, а минимальная - в клетках стромы. Это распределение экспрессии характерно для всех трех групп женщин, находившихся под наблюдением, за исключением группы контроля и экспрессии ЭР-альфа. Так, у них наблюдались максимальные и статистически значимые показатели экспрессии в поверхностном эпителии по отношению к эпителию желез и строме.

Экспрессия ПР-A+B была снижена в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез у больных эндометриозом и ненаступившей беременностью по отношению к контрольной группе и больным эндометриозом с наступившей беременностью. В клетках стромы различий не установлено (см. табл. 4).

Наибольшие статистически значимые различия установлены для ПР-B в ядрах поверхностного эпителия, эпителия желез и клетках стромы. Экспрессия была снижена у больных эндометриозом и ненаступившей беременностью по отношению к контрольной группе и больным эндометриозом с наступившей беременностью.

Установлено, что максимальная экспрессия ПР-A+B и ПР-B наблюдается в ядрах поверхностного эпителия эутопического эндометрия и в эпителии желез, а минимальная - в ядрах клеток стромы. Это распределение экспрессии характерно для женщин контрольной группы с сохраненной репродуктивной функцией. В то же время у больных в группе ЭБ(-) экспрессия ПР-A+B была не только снижена, но и не имела признаков распределения от максимального значения в ядрах поверхностного эпителия и минимального в ядрах стромы. Экспрессия ПР-B в клеточных элементах эутопического эндометрия в группах ЭБ(+) и ЭБ(-) не имела статистически значимых различий по отношению к контрольной группе, где экспрессия была максимальной в поверхностном эпителии и минимальна в строме.

Следовательно, у больных эндометриозом группы ЭБ(-) по отношению к группе ЭБ(+) и нормативным значениям наблюдается повышение экспрессии ЭР-альфа и снижение экспрессии ПР-A+B, ПР-B в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез. Между экспрессией ПР-A+B, ПР-B в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез у больных ЭБ(+) и контрольными показателями у здоровых женщин без эндометриоза таких различий не наблюдалось, за исключением ЭР-альфа. Установлен градиент изученных ядерных рецепторов, который в норме снижается от максимального значения в поверхностном эпителии и в железах к минимальной экспрессии в строме. У больных ЭБ(+) этот градиент сохраняется для ЭР, ЭР-альфа, ЭР-бета по отношению к контрольным значениям и изменяется для ПР-B. У больных группы ЭБ(-) характерно полное изменение этого градиента для ПР-A+B и ПР-B и его сохранение для ЭР, ЭР-альфа, ЭР-бета.

Регулирование функциональной активности эндометрия для подготовки этой ткани для нидации бластоцисты и наступления беременности у больных эндометриозом является сложным процессом с вовлечением различных молекулярных механизмов (up-regulation, down-regulation) [32]. Рецепторы эстрогена и прогестерона с момента их открытия были объектами для многочисленных исследований в эутопическом эндометрии у женщин с эндометриозом и без эндометриоза.

Так, B. Lessey и соавт. [27] в 2006 г. показали повышение экспрессии ЭР-альфa в эпителиальных клетках эутопического эндометрия в середине секреторной фазы у женщин с бесплодием и эндометриозом по сравнению с фертильными женщинами без эндометриоза. Наши исследования [32] подтверждают эти данные. Кроме этого, увеличение активности ароматазы или повышение уровня IL-6 в эндометрии может приводить к локальному повышенному синтезу эстрогена, стимулируя экспрессию ЭР-альфа [27]. В то же время G. Hudelist и соавт. [24] и R. Hearns-Stokes и соавт. [23] не нашли различий экспрессии ЭР-альфа в эндометрии у больных эндометриозом и здоровых фертильных женщин, используя иммуногистохимические методы или методы на основе mRNA-анализа [26]. Это вполне объяснимо тем, что в процессе экстракции mRNA она выделяется при гомогенизации из всех клеточных структур одновременно, а распределение mRNA по отдельным кластерам клеток не учитывается. E. Enmark и соавт. [19], A. Brandenberger и соавт. [13] показали преобладающую экспрессию ЭР и их изоформ в нормальном эндометрии и при эндометриозе. В то же время экспрессия ЭР-альфа после лечения у больных эндометриозом является благоприятной для наступления беременности.

Полученные нами данные об экспрессии ЭР-бета свидетельствуют об отсутствии различий между их уровнем у женщин с эндометриозом и без эндометриоза. Это подтверждают предыдущие данные иммуногистихимических исследований, устанавливающие отсутствие различий в железах в секреторную фазу у больных эндометриозом по отношению к здоровым женщинам [23]. Исследования rtPCR ER-бета в эндометрии также показывают отсутствие различий в их уровне у больных эндометриозом и здоровых женщин [26].

Существуют различия между результатами экспрессии ПР в эутопическом эндометрии и эктопическом эндометрии [17]. Показано, что ПР-A и ПР-B экспрессируются преимущественно в эутопическом эндометрии у больных эндометриозом, но у больных с наступившей беременностью уровень экспрессии не отличался от такового у больных с ненаступившей беременностью [10]. Дополнительно анализ эутопического эндометрия с использованием иммуноблоттинга у больных эндометриозом показал равное количественное присутствие ПР-A и ПР-B, преобладающее в стромальных клетках [14].

Pro et contra. В проведенных нами исследованиях удалось как подтвердить результаты, описанные в литературе, так и их уточнить. В дополнение к данным литературы представлены результаты с использованием современных высокоспецифичных антител к изоформам ядерных стероидных рецепторов в образцах эутопического эндометрия с высокой плотностью нервных микроволокон для PGР 9.5 в 1 мм². Кроме этого, в уже опубликованных работах не уточняется локализация экспрессии рецепторов, а именно - на мембранах, в цитозоле или в ядрах клеток. В наших исследованиях фиксировались значения экспрессии в ядрах. Показано, что у больных эндометриозом и с ненаступившей беременностью по отношению к больным с наступившей беременностью и здоровым женщинам наблюдается снижение экспрессии ПР-A+B, ПР-B (down-regulation) и повышение экспрессии ЭР-альфа (up-regulation) (см. схему).

К числу патологических стимулов, изменяющих фенотипические свойства эутопического эндометрия, можно отнести хронический эндометрит. Учитывая, что эндометриоз является заболеванием, связанным с увеличением инфламаторной активности в брюшной полости, на брюшине и в эутопическом эндометрии, эти изменения объективно снижают шанс наступления беременности [35] и, следовательно, полученные результаты вполне объяснимы. Тем не менее у обследованных больных отсутствовали клинические и патоморфологические признаки хронического эндометрита, но наличие гетеротопий и спаек на брюшине не позволяет полностью исключить инфламаторный процесс в эутопическом эндометрии, так как брюшная полость и полость матки сопряжены анатомически.

Имеются прямые данные о снижении экспрессии рецепторов к стероидным гормонам в эндометрии у женщин, страдающих бесплодием на фоне хронического эндометрита, причем наибольшие изменения отмечены со стороны рецепторов к прогестерону в раннюю стадию фазы секреции. Степень выраженности воспалительного процесса в эндометрии обратно пропорциональна уровню экспрессии рецепторов к стероидным гормонам [6]. Эти результаты согласуются и с нашими данными о влиянии воспалительного стресса (ангиогенно-воспалительный стресс, воспалительно-ангиогенный стресс) на функциональную активность эндометрия и фертильность [2, 3].

Так, перестройка сосудов матки и эндометрия в ответ на хроническое воспаление и нормализация параметров гемодинамики в малом тазу на фоне проводимой импульсной электротерапии за счет устранения повреждений сосудистых терминалей и ишемии ткани приводят к уменьшению тканевой гипоксии, а маточная беременность в течение 1 года после терапии наступает у 37% пациенток [4]. Следует отметить, что в наших наблюдениях у больных эндометриозом беременность наступала в течение 1 года после лечения (хирургическое+гормональное) в 44,7% случаев. Сопоставление частоты наступления беременности (37 и 44,7%) показывает отсутствие статистически значимых различий (р<0,05), несмотря на различия в лечении. Следовательно, именно фенотипические особенности эндометрия при эндометриозе, хроническом эндометрите, хроническом сальпингоофорите, бесплодии трубного происхождения или других патологических состояниях и об­условливают наступление беременности.

Таким образом, проведенные исследования экспрессии ЭР, ЭР-альфа, ЭР-бета, ПР-A+B, ПР-B в ядрах поверхностного эпителия, эпителия желез и стромальных клетках эндометрия показали, что у больных эндометриозом и с ненаступившей беременностью по отношению к больным с наступившей беременностью и в норме наблюдается увеличение плотности нервного волокна PGP 9.5, снижение экспрессии ПР-A+B, ПР-B (down-regulation) и повышение экспрессии ЭР-альфа (up-regulation). Между экспрессией ПР-A+B, ПР-B в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез у больных эндометриозом и с наступившей беременностью и контрольными показателями у здоровых женщин без эндометриоза таких различий не наблюдалось, а экспрессия ЭР-альфа была повышена (up-regulation). Установленные изменения, несомненно, могут влиять на рецептивность эндометрия и приводить к развитию субфертильности при эндометриозе. Определение плотности нервного волокна PGP 9.5, уровня экспрессии изоформ ЭР-альфа, ПР-А+В и ПР-B в ядрах поверхностного эпителия и эпителия желез эутопического эндометрия перед назначением лечения у больных эндометриозом могут служить дополнительными показателями в оценке эффективности лечения и фертильности.

Благодарности. Выражаем благодарность professor Matts Olovsson и сотрудникам Department of Women's and Children's Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за участие в обсуждениях и поддержку. Финансовая, научная, правовая и политическая помощь осуществлялась Шведской королевской академией наук, Шведским медицинским исследовательским советом (проект №8683), Университетом Уппсалы, Швеция, Российской академией медицинских наук, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России и Министерством здравоохранения России.