Проблема бесплодного брака приобретает в настоящее время не только медицинское, но и социально-демографическое и экономическое значение. По данным экспертов ВОЗ [1], около 100 млн супружеских пар бесплодны и их число с каждым годом увеличивается. В активном детородном возрасте в России находится 37 млн женщин, а частота бесплодия в этой группе колеблется от 10 до 15%. В отдельных регионах России этот показатель приближается к 20% - уровню, определяемому как критический и отрицательно влияющий на демографические показатели [2-4]. Разработка эффективных способов преодоления бесплодия является в настоящее время важнейшей государственной медико-социальной задачей.

В большинстве случаев причины нарушения фертильности - приобретенные. Патология репродуктивной системы, обусловленная воздействием комплекса неблагоприятных факторов, представляет одну из актуальнейших проблем современной репродуктивной медицины. По данным литературы, среди причин, приводящих к бесплодию, преобладает трубный фактор, частота которого составляет 35-40% [5, 6].

В настоящее время признано, что программа ЭКО и ПЭ является эффективным методом лечения бесплодия [1, 7-10].

Во всем мире отмечается возрастающий интерес к развитию вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), частота наступления беременности и родов после применения которых составляет соответственно 29,1 и 21,5% (данные Европейского общества репродукции человека, 2007).

Установлено, что функционирование репродуктивной системы осуществляется при тесном взаимодействии с иммунной и эндокринной системами [11, 12], но единого понимания этих механизмов нет. У женщин происходящие во время менструального цикла и беременности изменения контролируются со стороны гипоталамо-гипофизарной системы и являются прямым результатом индуцированного гормонами ремоделирования тканей яичников и эндометрия. Действие гормонов на клеточном уровне реализуется через вовлечение множества пептидных ростовых факторов, среди которых особая роль отводится цитокинам, синтезируемым иммунокомпетентными клетками (ИКК) [13, 14].

Наряду с регуляцией овариальной функции клетки иммунной системы и продуцируемые ими цитокины выполняют исключительно важную роль в подготовке эндометрия к имплантации эмбриона, а впоследствии - в сохранении беременности [15]. Тесная взаимосвязь иммунной и репродуктивной систем определяет тот факт, что наличие исходных иммунных дисфункций, а также развитие их в процессе стимуляции суперовуляции может быть серьезной причиной низкого качества ооцитов, дефекта оплодотворения яйцеклетки, нарушения развития и имплантации эмбриона и, в конечном итоге, невынашивания беременности. Признавая несомненное значение иммунной системы в реализации фертильности, ученые расходятся во мнениях о роли тех или иных иммунных факторов в генезе репродуктивных нарушений, что обусловливает отсутствие на сегодняшний день четких клинических рекомендаций по диагностике и терапии иммунных дисфункций [16-18].

Повышение эффективности ЭКО связано с исследованиями, направленными на изучение регуляторных механизмов репродуктивных процессов, прогнозирование их нарушений и определение подходов к коррекции. В этом плане одно из центральных мест занимает проблема иммунологической регуляции репродуктивной функции женщины. Известно, что ИКК (макрофаги, лимфоциты) и продуцируемые ими цитокины (интерлейкины, ростовые факторы, хемокины) принимают участие в механизмах фолликулогенеза, овуляции, формирования и функционирования желтого тела, циклических морфофункциональных изменений эндометрия, оплодотворении и имплантации. К настоящему времени получены данные об особенностях системной и локальной цитокиновой регуляции плацентации, родовой деятельности, осложнений беременности (гестоза, плацентарной недостаточности, невынашивания). Короткодистантный (ауто- и паракринный) характер действия цитокинов определяет особую актуальность изучения локальных механизмов их влияния на физиологические и патофизиологические процессы, связанные с репродукцией женщины.

Однако исследования, посвященные роли цитокинов в фолликулогенезе при стимуляции яичников гонадотропинами в циклах ЭКО и его эффективности, единичны, а их результаты часто противоречивы. Это обусловлено как особенностями дизайна разных исследований, так и свойствами самих цитокинов: их многообразием, избыточностью и полифункциональностью. В единичных работах показано, что содержание цитокинов в яичниках, эндометрии может быть информативным предиктором эффективности ЭКО и его осложнений.

На сегодняшний день наиболее изученными являются иммунные аспекты, связанные с поддержанием и нормальным протеканием беременности. Эта сфера включает изучение механизмов иммунологической перестройки, направленной на подавление реактивности иммунной системы матери по отношению к аллоантигенам плода. Вместе с тем роль иммунной системы в регуляции самых ранних этапов репродуктивного процесса - фолликулогенеза, овуляции, доимплантационных этапов развития эмбриона и его имплантации, остается существенно менее изученной [19].

В результате стало очевидным, что прямо или опосредованно через растворимые продукты ИКК принимают активное участие в регуляции ранних стадий репродуктивного процесса. Выяснилось, что яичники не являются в строгом смысле иммунопривилегированным органом [20]. Клетки иммунной системы присутствуют в яичнике, и их количество может существенно возрастать за счет миграции рециркулирующих лейкоцитов [21, 22]. Причем многие цитокины присутствуют в фолликулярной жидкости в концентрации, существенно превышающей таковую в периферической крови, что указывает на их важность в регуляции функций яичников [23, 24]. Продуцируемые ИКК цитокины контролируют в фолликулярную фазу созревание фолликула, стимулируя рост клеток гранулезы, но ингибируя их дифференцировку. Во время пика выброса лютеинизирующего гормона (ЛГ) происходит мощный приток нейтрофилов и макрофагов и секреция провоспалительных цитокинов. Именно эти механизмы лежат в основе процесса овуляции и позволяют рассматривать разрыв фолликула как воспалительный процесс, ведущую роль в котором играют интерлейкин-1 (IL-1), фактор некроза опухолей-α (TNF-α) [19, 24, 25].

Кроме того, важной функцией плацентарных NK-клеток, макрофагов и Т-клеток является формирование и поддержание толерантности к аллоантигенам плода. Это достигается за счет преимущественной продукции иммунокомпетентными клетками Тh2/противовоспалительных цитокинов [26, 27].

Следует отметить, что некоторые системные параметры иммунитета, включая концентрацию сывороточных цитокинов и количество отдельных субпопуляций ИКК, также могут различаться в группах женщин с наступившей и ненаступившей/прервавшейся беременностью. Например, при проведении ЭКО численность активированных NK-клеток (CD56dimCD 16+CD69+) в периферической крови женщин с наступившей беременностью оказалась достоверно ниже, чем в группе с отсутствием беременности, а повышенный уровень в сыворотке интерферона-γ (IFN-γ) и растворимых рецепторов к IL-2 на 11-й день после переноса эмбрионов был сопряжен с ранним прерыванием беременности [28]. Из представленных выше данных следует, что только небольшое количество иммунологических параметров достоверно различается в зависимости от исхода ЭКО. Однако даже эти маркеры не охарактеризованы с точки зрения информативности. Многие цитокины, в частности, лимфокины (IL-4, IL-7, IL-13, IL-17), которые были недавно выявлены в фоликулярной жидкости [19], не исследованы соотносительно их прогностической ценности при различных исходах ЭКО. В литературе также полностью отсутствуют сведения о количественных изменениях естественных супрессорных клеток при различных исходах ЭКО. Между тем не исключено, что данный тип клеток наряду с цитокинопосредованной супрессией играет важную роль в развитии периферической толерантности, в том числе к аллоантигенам плода. Количество супрессорных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+ увеличено при физиологической беременности [29]. В то же время сведения об участии этих клеток в регуляции самых ранних этапов репродуктивного процесса отсутствуют.

Исследования такого рода имеют большое теоретическое и практическое значение, поскольку позволяют осмыслить новые аспекты нарушений репродуктивного процесса и патогенеза бесплодия, определяющих неудачу ВРТ, а также разработать прогностические критерии эффективности последних. Важной исследовательской задачей является попытка установить системные взаимосвязи клинико-анатомических, морфофункциональных и иммунометаболических параметров репродуктивной системы, которые в рамках генотипических особенностей формируют предпосылки повторных неудач ВРТ.

Таким образом, несмотря на достаточно интенсивные исследования в области иммунной регуляции начальных этапов репродуктивного процесса, пригодные для прогноза ЭКО иммунологические маркеры (включающие показатели иммунитета на системном и локальном уровне) до сих пор не определены.

Цель настоящего исследования - выявить иммунологические различия при беременности раннего срока после ЭКО и спонтанно наступившей.

Проведено сравнительное проспективное когортное исследование. Обследованы 75 беременных женщин. Все обследуемые были разделены на две группы, сопоставимые по возрасту, соматическому статусу.

В основную группу вошли 50 женщин, которым выполнена программа ЭКО, ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку). Группа контроля представлена 25 здоровыми женщинами, у которых беременность наступила самостоятельно.

Критерии включения в основную группу: наличие трубно-перитонеального бесплодия, возраст женщины менее 35 лет, одноплодная беременность после программы ЭКО или ЭКО+ИКСИ.

Критерии исключения - многоплодная беременность.

Всем пациенткам были проведены следующие исследования: 1) оценка иммунного статуса; 2) гормональное исследование (β-хорионический гонадотропин человека - β-чХГ, эстрадиол, прогестерон, плацентарный лактоген).

Исследования проводили в момент подтверждения факта наступившей клинической беременности с помощью ультразвукового исследования (5-6 нед беременности).

Количественное определение популяций лимфоцитов, оценку продукции внутриклеточных цитокинов IFN-γ и IL-4 в цельной крови проводили методом проточной цитофлуориметрии на анализаторе FACSCalibur («BectonDickinson», США).

Уровень IFN-γ, IL-4 в плазме определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Детекцию результатов исследования осуществляли на иммуноферментном анализаторе MultiskanMCC/340 фирмы «Labsystems» (Финляндия).

Методом ИФА определяли β-чХГ, эстрадиол, прогестерон с использованием реактивов фирмы «Abbott» (США) на анализаторе AxSYM. Плацентарный лактоген - также методом ИФА с помощью реактивов фирмы «Bioserv» (Австрия).

Статистическую обработку материала проводили на IBMPC c использованием программ Microsoft Exel 2007 для Windows 7 и Statistica 6. Для сравнения количественных показателей и оценки достоверности различий результатов в группах применялся t-критерий Стьюдента для нормально распределенных признаков. Результаты представлены как среднее значение (М) и стандартное отклонение (s). Статистически достоверными считали различия между группами при уровне значимости p<0,05.

Исследование проводилось на базе ФГБУ НИИ ОММ непосредственно автором.

Проанализированные группы не имели статистически значимых различий по возрасту пациенток (р=0,46), акушерско-гинекологическому анамнезу, результатам обследования до беременности. Установлено (см. таблицу), что в основной группе статистически значимо выше показатели лейкоцитов, выше содержание лимфоцитов, CD3, CD19 (как процентное, так и абсолютное) достоверно выше таких показателей, как CD4 и IgG.

В группе женщин со спонтанно наступившей беременностью достоверно выше следующие показатели: HСT-тест, ЦИК, IL-4 сывороточный.

У женщин после ВРТ уровень IFN-γ ст и IL-4 ст выше, чем в группе контроля. Кроме того, содержание прогестерона и эстрадиола в крови у женщин после ЭКО достоверно выше, чем в группе контроля (см. таблицу).

1. В основной группе наблюдалась активация клеточного иммунитета. Достоверно выше такие показатели, как уровень CD3 (Т-лимфоциты), процентное содержание CD19 (В-лимфоциты), абсолютное значение CD19 и CD4 (Т-хелперы).

2. В группе женщин со спонтанно наступившей беременностью преобладали показатели гуморального иммунитета (HСT-тест спонтанный, HСT-стимулированный, ЦИК, IL-4 сывороточный).

Преимущественное развитие иммунного ответа по гуморальному типу менее опасно для плода, в то время как Thl-тип иммунного ответа обусловливает потенциально враждебный для плода клеточно-опосредованный иммунный ответ.

3. Многие авторы указывают, что в ранние сроки неосложненной беременности в крови и плаценте отмечается повышение внутриклеточного синтеза цитокинов как Тh1-типа (IFN-γ), так и Тh2-типа (IL-4) при относительном преобладании Тh2-типа иммунного ответа. В настоящем исследовании было выявлено значительное повышение содержания IFN-γ и IL-4 в основной группе.

4. При нормальном течении беременности отмечается снижение содержания IgG. Мы обнаружили, что в основной группе уровень IgG был выше, чем в группе контроля.

5. Доказано, что эстрогены и прогестерон обладают свойствами физиологических иммуносупрессоров, и их содержание повышается при нормально протекающей беременности. Проведенное исследование показало, что содержание эстрадиола и прогестерона значительнее повышалось у женщин после ВРТ, что может быть объяснено гормональной нагрузкой при проведении контролируемой овариальной гиперстимуляции и поддержкой после переноса эмбрионов. Прогестерон влияет на соотношение Тh1- и Тh2-опосредованного иммунного ответа, вызывая сдвиг провоспалительной реакции в сторону Тh2, при этом вероятность сохранения беременности возрастает.

Итак, беременность, наступившая в результате ВРТ, характеризуется смещением цитокинового баланса в сыворотке крови в сторону продукции провоспалительных цитокинов. Это является неблагоприятным прогностическим признаком для сохранения беременности.