Невынашивание беременности является одной из наиболее значимых проблем практического акушерства. Частота данной патологии в структуре репродуктивных потерь составляет 15—20%, из них на I триместр приходится 75—80% наблюдений. Этиология невынашивания разнообразна, нередко имеет место сочетание нескольких причин. К факторам, влияющим на частоту невынашивания беременности, относят экстрагенитальные заболевания, состояние органов репродуктивной системы, гормональный фон, а также инфекции, лекарственные препараты и др. Известно, что частота данной патологии в популяции остается относительно стабильной. Цитогенетические исследования абортного материала показали, что ведущей причиной прерывания беременности в I триместре является хромосомная патология, на долю которой приходится примерно 60% наблюдений. Так, в первые 6—7 нед беременности аномальный кариотип имеют 60—75% абортусов, в 12—17 нед — 20—25%, в 17—28 нед — только 2—7%. Среди хромосомных аберраций у абортусов 45—55% составляют аутосомные трисомии, 20—30% — моносомия 45,Х0, 15—20% — триплоидия и 5% — тетраплоидия [1].

Стремительный прогресс в области эмбриологии последних десятилетий позволил широко применять различные вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ), благодаря чему значительное количество бесплодных пар могут иметь детей. Тем не менее до настоящего времени нет единого мнения в вопросе, отличается ли частота прерывания беременности после ВРТ от таковой у женщин с бесплодием в анамнезе, но забеременевших самостоятельно. В настоящее время лишь единичные работы посвящены изучению неразвивающейся беременности у женщин после ВРТ [2].

Анализ литературы, посвященной цитогенетическим исследованиям абортивного материала после прерывания индуцированных беременностей, показал, что при использовании ВРТ риск невынашивания беременности повышается, в том числе за счет анеуплоидий. Ряд исследований [3—5] выявил, что при использовании процедуры ИКСИ увеличивается частота анеуплоидий и аберраций по половым хромосомам, формирующихся de novo. В своих публикациях R. McKinlay и соавт. [6] указывают, что выполнение процедуры ИКСИ увеличивает общепопуляционную частоту хромосомных аномалий у детей на 1%, в связи с чем авторы рекомендуют проводить процедуру преимплантационной диагностики (ПГД). Кроме того, в ряде исследований [7, 8] выявлено увеличение частоты больших аномалий развития у детей после процедуры ИКСИ.

Вместе с тем существуют публикации [9, 10], указывающие на отсутствие риска врожденных аномалий или больших аномалий развития как после ИКСИ, так и после традиционной программы ЭКО.

В то же время цитогенетический анализ хориона при неразвивающейся беременности показал, что частота хромосомной патологии в группе индуцированной беременности выше, чем при самопроизвольной [10—12]. Полученные противоречивые результаты исследований свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения данной проблемы.

По данным ежегодного отчета Center for Disease Control (Атланта, США) за 2008 г., перенос эмбрионов в полость матки осуществляется примерно в 80% случаев, частота наступления беременности — 30—35%, live birth rate — не превышает 30% [13]. По данным Human Fertilization Embryology Authority, частота прерывания беременностей после традиционного ЭКО у женщин 30—34 лет составляет 10,5%, 35—39 лет — 13,1%, 40—42 лет — 22,7%, старше 43 лет — 40,7%. FISH-анализ (fluorescent in situ hybridization) ооцитов и эмбрионов, полученных у пациенток старшего репродуктивного возраста (женщины старше 40 лет), показал наличие анеуплоидии более чем в 50% наблюдений [14]. Вместе с тем выявлена прямо пропорциональная зависимость между частотой анеуплоидий в морфологически нормальных эмбрионах и возрастом матери.

В настоящее время в этой области проведено много эпидемиологических исследований и накоплен большой объем статистического материала, однако сравнительный анализ затруднителен, так как методы сбора материала, учета данных и методы анализа хромосом в разных лабораториях были различными.

Цель настоящего исследования — изучение частоты хромосомных аномалий при неразвивающейся беременности, наступившей после применения ВРТ, а также взаимосвязи наличия хромосомных аномалий плода и фактора бесплодия.

В исследование включены 154 пациентки с неразвивающейся беременностью на сроке 6—12 нед.

Абортивный материал был получен путем инструментального удаления плодного яйца у пациенток с подтвержденным диагнозом неразвивающейся беременности.

Критериями для постановки диагноза неразвивающейся беременности являлись: несоответствие предполагаемому сроку беременности размеров матки и/или плодного яйца и/или копчико-теменного размера плода при ультразвуковом исследовании, отсутствие сердцебиения и/или двигательной активности эмбриона; к дополнительным ультразвуковым критериям относили нечеткие контуры плодного яйца, его деформацию и/или неоднородную структуру содержимого плодного яйца. Кроме того, оценивали уровень хорионического гонадотропина, который был ниже нормативных показателей предполагаемого срока беременности.

В изучаемую группу были включены 87 пациенток с неразвивающейся индуцированной беременностью. Стимуляция суперовуляции по длинному протоколу проведена у 51 (58,6%) пациентки. У 73 (83,9%) женщин осуществлен перенос нативных эмбрионов, а у 14 (16,1%) — криоконсервированных.

Средний возраст женщин составил 35,2 года (27—41 год), средний возраст мужчин — 37,2 года (31—43 года).

У 47 (54,0%) женщин беременность наступила в результате ЭКО, у 40 (46,0%) — с применением технологии ИКСИ. У 27 (67,5%) женщин ИКСИ проведено в связи с патозооспермией (преимущественно астенотератозооспермией). Средняя длительность бесплодия составила 5,4±3,9 года в группе ЭКО и 4,9±3,3 года в группе ИКСИ. Среднее число ооцитов, полученных эмбрионов и число перенесенных эмбрионов в обеих группах не различались. Среднее число перенесенных эмбрионов в обеих группах составило 1,9±1,1.

Группу контроля составили 67 пациенток с неразвивающейся самопроизвольной беременностью на сроке 6—12 нед. Изучаемая и контрольная группы были сопоставимы по возрасту беременных и анамнезу.

Перед проведением процедуры ЭКО/ИКСИ оценка параметров эякулята проводилась в соответствии со стандартами, рекомендованными Всемирной организацией здравоохранения (объем, число, подвижность); характеристики сперматозоидов оценивались по морфологическим критериям Кругера [15]. При выявлении выраженных отклонений показателей (количество сперматозоидов, их морфология, подвижность) проводилась процедура ИКСИ.

Для цитогенетического исследования использовали «прямой» метод анализа кариотипа (некультивированных) спонтанно делящихся клеток цитотрофобласта хориона. Методика приготовления описана А.Н. Хохловым и О.Б. Барцевой в 1986 г. [16]. Суспензии клеток получали путем дезагрегации фиксированных (этанол — уксусная кислота, 3:1) клеток ворсинчатого хориона 60% уксусной кислотой.

Цитогенетические исследования выполняли с использованием стандартного анализа метафазных хромосом.

Статистическая обработка данных проведена на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 7.0, StatSoft Inc. (США).

В ходе исследования хромосомные нарушения выявлены у 46 (52,3%) пациенток изучаемой группы и 32 (47,8%) — в контрольной.

При анализе частоты неразвивающейся беременности в зависимости от возраста матери мы не выявили достоверных различий в изучаемой и контрольной группах (ОР=1,35; р≥0,05) (см. рисунок).

Результаты кариотипирования абортусов от пациенток с неразвивающейся беременностью представлены в табл. 1.

Наиболее частой хромосомной аномалией в подгруппах ЭКО и ИКСИ являлась анеуплоидия по аутосомам — 21 (91,3%) и 19 (82,6%) случаев соответственно. Преобладающим типом нарушения кариотипа оказалась трисомия: в группе ВРТ (ЭКО и ИКСИ) чаще всего вовлекались хромосома 22 — соответственно 5 (21,7%) и 6 (26%) случаев, и хромосома 16 — соответственно 6 (26%) и 5 (21,7%), несколько реже встречались аномалии хромосомы 15 — соответственно 2 (8,7%) и 3 (13%) случая, хромосомы 4 — соответственно 2 (8,7%) и 2 (8,7%) случая. В группе ЭКО зарегистрировано по 1 (4,3%) наблюдению трисомии по хромосомам 7, 8, 9, а в группе ИКСИ — 2 (8,7%) наблюдения трисомии по хромосоме 9. Тетраплоидии и триплоидии встречались с одинаковой частотой в группах ЭКО и ИКСИ – по 1 (4,3%)случаю. Кроме того, в группе традиционного ЭКО в 1 (4,3%) случае выявлена сочетанная трисомия по хромосомам 21 и 16.

Среди нормального кариотипа превалировал женский кариотип (61%) по сравнению с мужским (39%).

Частота нарушений по половым хромосомам составила в группе ЭКО и ИКСИ соответственно 2 (8,7%) и 3 (13%) случая. Во всех случаях выявлены моносомии 45, Х0. В группе пациенток с ИКСИ был проведен углубленный анализ кариотипа абортуса в зависимости от результатов спермиологического исследования эякулята (табл. 2).

В группе ИКСИ с патозооспермией хромосомные аномалии встречались в 1,72 раза чаще, чем в группе ИКСИ без патозооспермии (p=0,003, ОР= 1,32, 95% ДИ=1,092—2,141).

Анализ распределения частоты неразвивающейся беременности в зависимости от срока беременности показал, что большинство случаев приходится на срок 6—10 нед гестации при любом способе достижения беременности (ЭКО/ИКСИ/самопроизвольная беременность) (табл. 3).

Нами был проведен корреляционный анализ для наиболее часто встречающихся трисомий (22 и 16). Между частотой трисомии 16 и сроком беременности выявлена достоверная отрицательная корреляционная зависимость (r=–0,52, р≤0,05), в то время как для трисомии 22 значение коэффициента корреляции (r=–0,47, р≥0,05) было недостоверно. Однако нужно отметить, что наблюдали достоверную положительную корреляцию трисомии 22 и возраста матери (r=0,38, р≤0,05).

В целом мы не получили достоверных различий в частоте хромосомных аномалий при неразвивающейся индуцированной и спонтанной беременности. Однако особый интерес представляет анализ внутри подгруппы ИКСИ, где отмечается рост хромосомных аномалий в случаях, когда технология ИКСИ выполнена в связи с мужским фактором бесплодия.

Впервые хромосомные аберрации при неразвивающейся беременности после программы ИКСИ описаны в 1995 г. [17, 18]. P. In’t Veld и соавт. [18] впервые сообщили, что в 33% случаев при индуцированной беременности после ИКСИ встречаются хромосомные аномалии, которые они выявили в ходе ПГД. Следует отметить, что все выявленные авторами аномалии были связаны с половыми хромосомами. Такой относительно высокий риск анеуплоидий заставил провести дальнейшие исследования [17]. Полученные результаты показали, что частота хромосомной патологии при индуцированной беременности составляет 1%, при этом в 5 из 6 случаев диагностировались дефекты в половых хромосомах. Кроме того, ряд исследователей [3, 5, 6, 19] в дальнейшем опубликовали результаты, свидетельствующие о более высокой частоте хромосомных аберраций после процедуры ИКСИ. После процедуры ИКСИ частота анеуплоидий встречается чаще [3], чему способствует ряд факторов. Во-первых, во время процедуры не исключено воздействие на ооплазму и веретено деления, контаминация с биологическим материалом, попадание чужеродной ДНК. Кроме того, возможно введение сперматозоида с аномальным кариотипом или со структурными дефектами. В нашем исследовании в структуре патозооспермии преобладала астенотератозооспермия. Не исключено, что сам ооцит может нести генетические дефекты [4]. В связи с указанными фактами исследования в этой области ведутся достаточно активно [9, 10].

В нашей работе на достаточном количестве материала продемонстрировано отсутствие достоверных различий в аномальном кариотипе при индуцированной и спонтанной беременности, однако в группе беременности после ИКСИ эти показатели несколько выше, чем в группе традиционного ЭКО.

Известно, что ранние эмбриональные потери в значительном проценте случаев связаны с хромосомным дисбалансом, при этом на долю трисомий приходится около 30%, вклад полиплоидии и моносомии Х оценивается примерно по 10% [20].

В большинстве работ, посвященных ранним репродуктивным потерям, крайне редко выявляются трисомии по хромосомам 1 и 19, а самыми частыми оказываются трисомии по хромосомам 16 и 22 [21, 22]. Такая закономерность отмечена и в нашей работе.

Различия в выявляемой частоте и структуре хромосомной патологии при кариотипировании абортусов могут зависеть от ряда факторов. Согласно материалам ВОЗ, к числу наиболее значимых факторов относятся: сроки прерывания беременности; средний возраст беременных женщин в популяции; неустановленные индуцированные аборты; отбор образцов для исследования по сроку беременности, тяжести нарушения развития и качеству материала; методы культивирования тканей; контаминация культур тканей клетками матери [23—25].

Частота спонтанных геномных и хромосомных мутаций в хорионе при неразвивающейся беременности коррелирует со сроком беременности. В I триместре она составляет примерно 8—10%, а затем начинает постепенно снижаться и во II триместре не превышает 5%. При этом структура геномных и хромосомных мутаций у эмбрионов и плодов на более поздних стадиях развития сохраняется. Однако спектр хромосом, вовлеченных в геномные мутации, резко сужается и соответствует таковому при прогрессирующей беременности — после 10-й недели развития доминирует трисомия 21, за ней следуют трисомии 18 и 13, численные аномалии в системе половых хромосом и, наконец, триплоидия. У новорожденных хромосомные аберрации встречаются сравнительно редко — примерно у 0,5—0,9% [26].

Установлено, что риск хромосомной патологии у плода положительно коррелирует с возрастом матери. В нашем исследовании выявлено достоверное влияние возраста матери на частоту трисомий по хромосоме 22 у плода.

Важным показателем, отражающим величину генетического груза в популяции, является соотношение полов. Первичное соотношение полов, возникающее при оплодотворении, неизвестно. Вторичное соотношение полов, которое устанавливается у новорожденных, т.е. после пренатального естественного отбора, равно 1,05—1,07 [27, 28]. По данным разных авторов [29, 30], соотношение полов у спонтанных абортов варьирует от 1,32 до 0,34.

Соотношение женских и мужских кариотипов в нашем исследовании соотносится как 1,7: 1, при выявлении аномального кариотипа соотношение мужского и женского пола составляло 1:1, что в целом согласуется с данными [4], представленными ранее. Так, в частности, соотношение полов среди аномального кариотипа в группе традиционного ЭКО составило 0,8, в группе ИКСИ — 0,85 и в контрольной группе — 0,77.

Наиболее часто встречалась трисомия по аутосомам во всех трех группах, при этом их частота была примерно одинаковой. И все же анеуплоидия по половым хромосомам диагностировалась чаще при беременности после ИКСИ по сравнению с традиционным ЭКО, что согласуется с данными других авторов [4, 12].

Ряд исследований [9, 31—33] указывает на более высокую частоту аномалий половых хромосом у мужчин с нарушенным сперматогенезом. Установлено, что у мужчин с бесплодием при наличии нормального кариотипа и аномальном сперматогенезе увеличен риск формирования сперматозоида с анеуплоидией, что особенно актуально в отношении половых хромосом. Результаты указанных исследований согласуются с увеличением частоты аномалий половых хромосом в группе ИКСИ. В нашей работе аномалии половых хромосом в группе ИКСИ встречались в 1,5 раза чаще, чем в группе ЭКО. Однако до конца не установлено, действительно ли увеличение частоты аномалий половых хромосом обусловлено непосредственно технологией ИКСИ. В предыдущих работах ряд авторов [5, 34] отмечают, что хромосомные аномалии чаще регистрируются при более выраженных степенях нарушения сперматогенеза, чем за счет самой процедуры ИКСИ.

Проводя дальнейшие исследования по изучению этого вопроса, М. Bonduelle и соавт. [5] предположили, что число анеуплоидий увеличивается за счет анеуплоидий сперматозоидов, в то время как, согласно точке зрения A. Calogero и соавт. [35], анеуплоидии в сперматозоидах отрицательно коррелируют с их концентрацией. Наличие нормального отцовского кариотипа не исключает возможности анеуплоидий у плода, так как нарушение интратестикулярного микроокружения повреждает не только сперматогенез, но и механизмы, контролирующие сегрегацию (расхождение) хромосом во время прохождения мейоза [35]. В подтверждение указанной теории мы проанализировали группу ИКСИ в зависимости от отсутствия или наличия патозооспермии. В последнем случае хромосомные аномалии диагностировались в 1,72 раза чаще.

Учитывая данные литературы и результаты нашего исследования, можно сделать вывод, что частота хромосомных аномалий при неразвивающейся беременности, наступившей с помощью ВРТ, достоверно не превышает аналогичный показатель при самопроизвольной беременности.

Дополнительный сравнительный анализ выявленных хромосомных аномалий плода при неразвивающейся беременности после ИКСИ (при наличии у супругов пациенток выраженной формы патозооспермии) показал, что при выраженном нарушении сперматогенеза частота аномалий половых хромосом выше не только по сравнению со спонтанной беременностью, но и по сравнению с группой традиционного ЭКО.

Пациенткам с двумя и более неразвивающимися беременностями после ВРТ необходимо проведение ПГД с помощью FISH-метода, чтобы минимизировать вероятность последующей неразвивающейся беременности.