Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Ширшев С.В.

Лаборатория иммунорегуляции Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Заморина С.А.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Роль хорионического гонадотропина в формировании иммунологической толерантности при беременности

Авторы:

Ширшев С.В., Заморина С.А.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2011;57(5): 52‑56

Просмотров: 222

Загрузок: 2

Как цитировать:

Ширшев С.В., Заморина С.А. Роль хорионического гонадотропина в формировании иммунологической толерантности при беременности. Проблемы эндокринологии. 2011;57(5):52‑56.
Shirshev SV, Zamorina SA. The role of chorionic gonadotropin in the formation of immunological tolerance during pregnancy. Problemy Endokrinologii. 2011;57(5):52‑56. (In Russ.).

?>

Беременность представляет собой физиологически обусловленное состояние толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду. В это время возрастает численность Т-регуляторных лимфоцитов (Treg), обладающих иммуносупрессивным действием [2]. Системные иммунные реакции смещаются в сторону гуморального ответа (феномен Th2-девиации) за счет преимущественной секреции противовоспалительных цитокинов [1]. Помимо этого периферическая толерантность формируется благодаря экспрессии антигенпрезентирующими клетками фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), что нарушает антифетальные клеточноопосредованные иммунные реакции матери [14].

Изучение роли гормонов беременности в качестве причин данного феномена является актуальным направлением репродуктивной иммунологии. Хорионический гонадотропин (ХГ), который продуцируется во время беременности, не только играет существенную роль в регуляции стероидогенеза в плаценте и у плода [11], но и обладает иммуномодулирующим действием [1]. Важно отметить, что максимальная концентрация ХГ в период гестации совпадает с экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости (MHC) на клеточной поверхности эмбриона (7—10 нед), распознавание которых может привести к процессам иммунного отторжения [2]. ХГ способствует Т-хелперному ответу 2-го типа (Th2) [1], непосредственно связываясь с поверхностью Т-лимфоцитов [17]. Кроме того, он регулирует активность фагоцитирующих клеток [1].

Цель работы —оценить влияние ХГ на синтез Т-лимфоцитами интерлейкина-4 (IL-4) и интерферона-γ (IFN-γ), индукцию адаптивных Treg, а также экспрессию IDO моноцитами, а также их фагоцитарную и окислительную активности.

Материал и методы

Исследование проводили на мононуклеарах периферической крови (МПК), выделенных из венозной крови здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина. ХГ применяли в концентрациях 10 и 100 МЕ/мл (соответствующих уровню гормона во II—III и I триместры беременности) [18].

МПК культивировали с ХГ в среде 199 с добавлением 10% ЭТС («Sigma», США), 10 мМ Hepes («ICN Рh.», США), 2 мМ L-глутамина («ICN Рh.», США) и 100 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения) в течение суток в условиях 5% СО2. Поскольку экспрессия транскрипционного фактора Foxp3 является основным маркером Treg, количество последних оценивали как процент CD4+CD25bright Foxp3+ клеток (Anti-Human Foxp3-Alexa Fluor 488, 206D) в гейте CD4+CD25bright лимфоцитов (PE/Cy5 anti-human CD4, OKT4; PE anti-human CD25, BC96).

Для оценки внутриклеточного синтеза цитокинов в CD3+CD4+- и CD3+CD8+-лимфоцитах использовали фикоэритрин-конъюгированные антитела к IL-4 и IFN-γ («Caltag», CША). Для стимуляции внутриклеточного синтеза использовали форболмиристацетат (PMA) (50 нг/мл, «Sigma», США,) в комбинации с иономицином (50 мкг/мл, «Sigma», США), затем применяли брефелдин А (10 мкг/мл, «ICN Рh.», США), согласно стандартной методике. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре («Becton Dickinson», США).

Активность IDO определяли спектрофотометрически по изменению концентрации кинуренина — первого стабильного метаболита триптофана [6]. Поскольку IDO продуцируется только антиген-презентирующими клетками, которые в МПК представлены моноцитами, полученные результаты интерпретировали как продукцию IDO моноцитами. МПК, стимулированные IFN-γ (10 нг/мл, «Вектор Бест», Россия) или липополисахаридом (ЛПС) — 100 нг/мл («Sigma», США), культивировали в растворе Хенкса, содержащем 100 мкM триптофана («Sigma», США) в течение 4 ч. Затем к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30% трихлоруксусной кислоты, встряхивали на вортексе и центрифугировали в течение 5 мин. В лунки 96-луночного планшета вносили 75 мкл супернатанта, смешивали с равным объемом реактива Эрлиха. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре Biohit BP 800 (США).

Фагоцитарную активность моноцитов определяли после часовой инкубации с ХГ по степени снижения свечения люминесцентного генно-инженерного штамма фагоцитируемых бактерий E.coli lux+ с использованием люминометра Luminoskan Ascent (Финляндия). Результаты оценивали по индексу фагоцитарной активности (ИФА), отражающего процент гашения биолюминесценции в сравнении с исходным уровнем. ИФА=100×(Х1–Х2)/Х1, где Х1 — интенсивность биолюминесценции контрольной пробы (бактерии), Х2 — то же опытной пробы (бактерии+фагоциты) [3].

Окислительную активность моноцитов определяли в тесте люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). Для этого после часовой инкубации с ХГ измеряли интенсивность спонтанной ЛЗХЛ. Активаторами фагоцитов в стимулированном варианте ЛЗХЛ (20 мин) служили опсонизированные бактерии E.coli (штамм К-12). Для измерений использовали люминометр Luminoskan Ascent (Финляндия). Результаты выражали в относительных световых единицах — RLU (related light units).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Учитывая значение баланса IFN-γ и IL-4, продуцируемых Т-лимфоцитами, для сохранения беременности [2], в начале исследовали влияние ХГ на способность CD3+CD4+ и CD3+CD8+ Т-лимфоцитов продуцировать данные цитокины. Как видно на рис. 1,

Рисунок 1. Влияние ХГ на внутриклеточный уровень цитокинов (IL-4 и INF-γ) в лимфоцитах периферической крови женщин in vitro (n=9). 1 — CD4+ IFN-γ+, 2 — CD4+IL-4+, 3 — CD8+ IFN-γ+, 4 — CD8+IL-4+. Здесь и на рис. 2: * — p<0,05 по отношению к контролю.
суточная инкубация МПК (100 МЕ/мл) с ХГ приводила к повышению процента IL-4-позитивных CD3+CD4+T-клеток. В то же время гормон не влиял на внутриклеточную продукцию IFN-γ и IL-4 CD3+CD8+Т-лимфоцитами, равно как и на продукцию IFN-γ CD3+CD4+T-клетками. Таким образом, в концентрации, характерной для I триместра беременности, ХГ может являться одним из факторов, способствующих формированию иммунного ответа по Тh2-типу.

Далее установлено, что суточная инкубация МПК с ХГ (10 и 100 МЕ/мл) увеличивает процент CD4+CD25brightFoxp3+ клеток в культуре (рис. 2).

Рисунок 2. Влияние ХГ на экспрессию Foxp3 в гейте CD4+CD25bright лимфоцитов периферической крови женщин in vitro (n=9).
Так как результат оценивался после суточной инкубации, а для пролиферации естественных Treg требуется от 4 до 7 сут [8], стимулирующий эффект ХГ можно интерпретировать как способность увеличивать долю только адаптивных Treg.

Во время беременности пул Treg в периферической крови возрастает как за счет пролиферации естественных Treg, так и за счет индукции адаптивных Treg (экспрессия молекулы Foxp3) [10]. Важно отметить, что в механизме передачи сигнала участвует цAMФ [2], повышение уровня которого приводит к экспрессии молекулы Foxp3 [5]. Не исключено, что увеличение относительного количества Treg в периферической крови на ранних сроках нормальной беременности [10] связано именно с действием ХГ.

Спонтанная активность IDO в нормальных МПК практически не определяется, поэтому при оценке влияния ХГ на активность данного фермента мы использовали стандартные индукторы — ЛПС и IFN-γ [13]. ХГ (100 МЕ/мл) достоверно усиливал активность IDO в ЛПС-стимулированных МПК и не влиял на ее активность при стимуляции клеток IFN-γ (табл. 1).

Взаимодействие ЛПС с Toll-подобным рецептором 4 (TLR-4) вовлекает МАРК-киназный (митоген-активированная протеинкиназа) каскад с последующей активацией ядерного транскрипционного фактора NF-κB [13]. По-видимому, ХГ является коактиватором TLR4-зависимой индукции IDO.

При оценке фагоцитарной активности установлено, что ХГ угнетает фагоцитоз E.coli lux+ моноцитами периферической крови (рис. 3).

Рисунок 3. Влияние ХГ на фагоцитарную активность моноцитов женщин в отношении E. coli lux+ (n=8). a — p<0,05 в отношении эффекта высокой дозы ХГ, b — то же в отношении низкой его дозы.
Данный эффект зависел от концентрации гормона. Так, в малой концентрации (10 МЕ/мл) ХГ угнетал фагоцитарную активность только в первые 15 мин, после чего моноциты восстанавливали свою функциональную активность, а в концентрации 100 МЕ/мл (соответствующей I триместру беременности) гормон подавлял фагоцитоз на протяжении всего исследуемого периода.

В отношении спонтанной ЛЗХЛ моноцитов, которая отражает исходный уровень окислительного метаболизма клеток, установлено, что только высокая концентрация ХГ (100 МЕ/мл) угнетает продукцию активных форм кислорода. В то же время на ЛЗХЛ стимулированных E. coli моноцитов ХГ не влиял (табл. 2).

Таким образом, ХГ подавлял фагоцитарную и окислительную активность моноцитов, оказывая более выраженный эффект в концентрации 100 МЕ/мл, соответствующей I триместру беременности. Возможно, что снижение функциональной активности моноцитов определяет один из механизмов предупреждения антифетальных реакций и защиты собственных тканей от повреждения в этот период гестации.

На рис. 4

Рисунок 4. Роль ХГ в формировании иммунологической толерантности при физиологически протекающей беременности. ЦТЛ — цитотоксические лимфоциты.
представлена гипотетическая схема, суммирующая полученные результаты. Гормон избирательно активирует синтез IL-4 T-клетками, настраивая их функциональную активность по Th2-цитокиновому типу. К этому присоединяется способность ХГ увеличивать пул адаптивных Treg, одновременно костимулируя TLR-индуцированную активность IDO моноцитов. Известно, что при контакте молекул CTLA-4, представленных на Treg, с лигандами В7.1/2, которые экспонированы на антигенпрезентирующих клетках (моноцитах), экспрессия IDO в последних усиливается [9]. В свою очередь, клетки, экспрессирующие повышенные уровни IDO, способствуют генерации адаптивных Treg из CD4+CD25–-лимфоцитов [7]. В то же время активация IDO может приводить к гибели цитотоксических лимфоцитов вследствие дефицита необходимой для их активности аминокислоты и выделения токсичных продуктов ее деградации, таких как кинуренин [15]. Важно отметить, что наиболее выраженными эффектами обладает концентрация ХГ (100 МЕ/мл), которая наблюдается в I триместре беременности, т.е. в период экспрессии антигенов MHC I класса на клеточной поверхности эмбриона, распознавание которых может привести к его отторжению.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ХГ является одним из факторов, способствующих поддержанию иммунологической толерантности при беременности.

Выводы

1. ХГ в концентрации сопоставимой с его уровнем в I триместре беременности (100 МЕ/мл) достоверно увеличивает процент CD3+CD4+T-лимфоцитов, содержащих молекулы IL-4.

2. Гормон не оказывает влияния на внутриклеточную продукцию IFN-γ и IL-4 в субпопуляции CD3+CD8+Т-лимфоцитов, равно как и на продукцию IFN-γ CD3+CD4+T-клетками.

3. Независимо от концентрации ХГ достоверно повышает процент CD4+CD25brightFoxp3+ клеток in vitro, одновременно повышая активность индоламин-2,3-диоксигеназы в ЛПС-стимулированных мононуклеарных клетках периферической крови.

4. Гормон угнетает фагоцитоз E. coli lux+ моноцитами и подавляет спонтанную продукцию активных форм кислорода в реакции люминолзависимой хемилюминесценции.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail