Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Ширшев С.В.

Лаборатория иммунорегуляции Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Некрасова И.В.

Лаборатория иммунорегуляции Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Влияние женских половых стероидных гормонов на микробицидную активность нейтрофилов

Авторы:

Ширшев С.В., Некрасова И.В.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2010;56(1): 26‑30

Просмотров: 425

Загрузок: 3

Как цитировать:

Ширшев С.В., Некрасова И.В. Влияние женских половых стероидных гормонов на микробицидную активность нейтрофилов. Проблемы эндокринологии. 2010;56(1):26‑30.
Shirshev SV, Nekrasova IV. Effect of female sex hormones on microbicidal activity of neutrophils. Problemy Endokrinologii. 2010;56(1):26‑30. (In Russ.).

?>

Эстрадиол (Е2) и прогестерон (Pr) — важные гормоны, контролирующие репродуктивную функцию женского организма. Они также способны оказывать ярко выраженное иммуномодулирующее действие [1]. Данные гормоны реализуют свои эффекты посредством связывания со специфическими рецепторами — ER и PR, которые также обнаружены на клетках иммунной системы [2, 3].

Нейтрофилы — наиболее многочисленная популяция лейкоцитов — являются основными клеточными эффекторами неспецифической защиты организма. Обладая высокой реактивностью в ответ на действие хемотаксических и других факторов, эти клетки первыми появляются в очаге поражения и определяют пусковые механизмы развития воспаления и ранних защитных реакций [4—6]. Их вклад в процессы иммунного реагирования определяется поглощением и деструкцией патогена, а также наличием ряда биологически активных соединений, в том числе ферментов, влияющих на интенсивность развития иммунного ответа. Нейтрофилы известны также как активные участники родовой деятельности [1], в связи с чем исследование изменения их функций в период гестации является актуальной проблемой иммунологии репродукции.

Цель работы — оценка влияния Е2, Pr и их комбинации на микробицидную активность нейтрофилов.

Материал и методы

В работе использовали сепарированные нейтрофилы периферической венозной крови здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста. Для выделения нейтрофилов применяли двойной градиент плотности фиколл-верографина (Pharmacia, Швеция; Спофа, Чехия). Плотности верхнего и нижнего градиентов составили 1,077 и 1,112 г/мл. Чистота популяции фракционированных нейтрофилов составила 90%; жизнеспособность клеток, определяемая в тесте с эозином, — 95—98%. Гормоны использовали в концентрациях, отражающих их уровни в крови соответственно в I и III триместрах беременности: Е2 (Sigma, США) — 1 и 10 нг/мл [7], Pr (Sigma, США) — 20 и 100 нг/мл [7]. Нейтрофилы (1·106/мл) инкубировали в течение 60 мин при температуре 37 °С с гормонами, после чего исследовали функциональную активность клеток.

Влияние гормонов на микробицидный потенциал оценивали по активности ферментов, секретируемых нейтрофилами, — эластазы и миелопероксидазы (МПО), которые определяли в клеточных супернатантах. Активность эластазы определяли с использованием синтетического субстрата N-альфа-бензол-L-аргинин-этилового эфира гидрохлорида, растворенного в ацетонитриле [8], спектрофотометрическим методом. В лунку 96-луночного плоскодонного планшета вносили 0,02 мл клеточного супернатанта, добавляли 0,15 мл прогретого до 25°С трис-буфера и 0,03 мл 0,01 М субстратного раствора ВАЕЕ. Затем ex tempore регистрировали оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре Anthos HMTL III (Labtec Instruments, Австрия) при длине волны 340 нм в течение 15 мин с интервалами 5 мин. Активность эластазы выражали в количестве гидролизованного субстрата (нМ) на 106 клеток за минуту (нМ/106 кл./мин).

Активность МПО тестировали спектрофотометрически [9, 10]. Для этого 0,05 мл клеточного супернатанта помещали в лунки 96-луночного планшета, затем вносили 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из 0,04% ортофенилендиамина и 0,014% Н2О2 на фосфатцитратном буфере. По истечении 10 мин инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 10% Н2SO4. Интенсивность оптической плотности фиксировали в многоканальном спектрофотометре Anthos HMTL III при длине волны 492 нм. Результаты выражали в единицах оптической плотности (E).

В ряде проб для стимуляции активности эластазы и МПО использовали зимозан А (Sigma, США), опсонизированный пулом сывороток.

В качестве интегрального теста для определения микробицидной активности нейтрофилов исследовали люминолзависимую хемилюминесценцию (ЛЗХЛ). Активаторами фагоцитов в стимулированном варианте ЛЗХЛ служили опсонизированные бактерии Escherichia coli (штамм К-12). В лунку плоскодонного планшета вносили 0,18 мл раствора, содержащего 110 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, 2,5 мМ MgCl2, 5 мМ глюкозы и 1·10-4 М люминола. После инкубации в течение 3—5 мин при температуре 37 °С и замера фонового свечения добавляли 0,02 мл клеточной суспензии и при непрерывном перемешивании измеряли интенсивность спонтанной ЛЗХЛ. Затем в лунку добавляли 0,02 мл опсонизированных бактерий E. coli К-12 и фиксировали интенсивность стимулированной ЛЗХЛ в течение 30 мин через каждые 10 мин.

Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по степени снижения свечения люминесцентного генно-инженерного штамма бактерий E. coli lux+, которые являлись объектом фагоцитоза [11]. Для оптимального выражения результатов исследования рассчитывали индекс фагоцитарной активности (ИФА), отражающий процент гашения биолюминесценции в сравнении с исходным уровнем:

ИФА = 100 × (Х1–Х2)/Х1, где Х1 — интенсивность биолюминесценции контрольной пробы (бактерии), Х2 — опытной пробы (бактерии + нейтрофилы). Динамику фагоцитоза оценивали в течение 30 мин, производя замеры каждые 10 мин.

Измерение показателей фагоцитоза и ЛЗХЛ проводили с использованием люминометра Luminoskan Ascent (Финляндия). Результаты выражали в относительных световых единицах (related light units, RLU).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента в пакете программ Microsoft Office Excel 2003. При этом вычисляли среднее значение и стандартное отклонение (М±δ). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

При исследовании спонтанной ЛЗХЛ выявлено, что Е2 достоверно повышал ее уровень только в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности. Pr не влиял на данный показатель. Одновременное действие Е2 и Pr на продукцию активных метаболитов кислорода в разных концентрационных соотношениях также не было статистически значимым (см. таблицу).

В индуцированном E. coli варианте ЛЗХЛ Pr повышал данный показатель (рис. 1, а)

Рисунок 1. Влияние Pr (а), Е2 (б), а также их физиологических сочетаний (в) на стимулированную люминолзависимую хемилюминесценцию (ЛЗХЛ) нейтрофилов. a — p=0,03; b — p=0,02; c — p=0,04; d — p=0,01; e — p=0,04; значение р указано только для достоверных различий (р<0,05) по сравнению с контролем. RLU — относительные световые единицы.
на 10-й и 20-й минутах исследования в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности. Е2, наоборот, угнетал ЛЗХЛ нейтрофилов, что проявилось на 30-й минуте исследования (рис. 1, б). При одновременном действии гормонов в дозах, также характерных для таковых в III триместре, наблюдался выраженный стимулирующий эффект на 20-й и 30-й минутах (рис. 1, в). Таким образом, практически не влияя на фоновый окислительный потенциал, при антигенной стимуляции гормоны репродукции в дозах, характерных для III триместра беременности, усиливают активность свободнорадикального окисления в нейтрофилах.

Учитывая, что биоцидное действие нейтрофилов, направленное на внеклеточную деструкцию патогенов, осуществляется за счет выброса активных форм кислорода с последующей их трансформацией МПО в перекись водорода и галогениды, экстрацеллюлярную окислительную активность нейтрофилов оценивали как по продукции активных форм кислорода, так и по активности секретируемой МПО.

В ходе исследования было выявлено увеличение спонтанной активности МПО под действием Pr в дозе, характерной для таковой в III триместре беременности, что согласуется с имеющимися в литературе данными о росте окислительной активности МПО в ходе гестации [12]. Pr повышал уровень стимулированной МПО в дозе, соответствующей таковой в I триместре беременности. Е2 не давал самостоятельный эффект, а при одновременном воздействии гормонов на клетки стимулирующее действие Pr сохранялось как в спонтанном, так и в стимулированном варианте (см. таблицу). Известно, что сама МПО, а также гипохлорит способны активировать коллагеназу [13], которая наряду с эластазой участвует в процессе дилатации шейки матки перед родами [14].

Pr как самостоятельно, так и в комбинации с Е2, в дозе, соответствующей таковой в I триместре беременности, усиливал спонтанную активность эластазы, которая участвует в процессе инвазивного роста синцитиотрофобласта [15]. Е2, напротив, не влияя на данный показатель в спонтанном варианте, при стимуляции нейтрофилов зимозаном угнетал активность эластазы в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности. Однако при одновременном с Pr воздействии на клетки этот депрессивный эффект Е2 отменялся (см. таблицу). Таким образом, стимуляция спонтанной активности эластазы, с одной стороны, способствует повышению неспецифической резистентности организма матери при беременности, а с другой, необходима для ремоделирования тканей в процессе роста синцитиотрофобласта.

При исследовании фагоцитарной активности нейтрофилов установлено ее снижение под действием Pr в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности, на 30-й минуте (рис. 2, а).

Рисунок 2. Влияние Pr (а), Е2 (б), а также их физиологических сочетаний (в) на фагоцитарную активность нейтрофилов. a, b, c, d: p=0,04; значение р указано только для достоверных различий (р<0,05) в сравнении с контролем. RLU — относительные световые единицы.
Е2 угнетал данный показатель в дозе, характерной для таковой в I триместре беременности, уже на 1-й мин измерения, а в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности — на 10-й минуте (рис. 2, б). В ряде работ также подтверждается супрессорное действие эстрогенов только в отношении фагоцитарной активности лейкоцитов свиней [16]. При одновременном действии гормонов в дозе, характерной для таковой в III триместре беременности, фагоцитарная активность нейтрофилов также снижалась на 10-й минуте (рис. 2, в). По-видимому, данный эффект стероидов определяется в большей степени негеномным действием Е2. Имеются данные о том, что сыворотка беременных обладает способностью супрессировать фагоцитоз микроорганизмов, включая E. coli [17].

Анализируя полученные данные, можно полагать, что гормоны репродукции в дозе, соответствующей таковой в I триместре беременности, способствуют успешной имплантации и последующей плацентации, повышая спонтанную активность МПО и эластазы. При этом в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности, комбинация Е2 и Pr стимулирует окислительную активность нейтрофилов, что, возможно, обусловлено участием НАДФ-оксидазного комплекса и МПО данных клеток в индукции родовой деятельности.

Выводы

1. Гормоны репродукции в дозах, характерных для таковых в для I триместре беременности, стимулируют спонтанную ферментативную активность эластазы нейтрофилов.

2. Е2 и Pr повышают как спонтанную, так и индуцированную активность МПО, при участии которой образуется такой важный бактерицидный агент, как гипохлорная кислота.

3. Комбинация исследуемых гормонов не влияет на спонтанную ЛЗХЛ нейтрофилов, тогда как на индуцированную E. coli продукцию кислородных метаболитов нейтрофилами оказывает активирующий эффект в дозе, соответствующей таковой в III триместре беременности.

4. Одновременно стероиды угнетают фагоцитарную активность нейтрофилов, что, возможно, нивелируется повышением их окислительного потенциала.

Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail