Стратегии генной терапии можно разделить на два основных подхода, таких как прямая доставка нормально функционирующего гена в клетку или исправление генного дефекта на уровне соматических или половых клеток. В настоящее время существует три типа систем доставки генов (кДНК/РНК): вирусные, невирусные и комбинированные гибридные [1]. Благодаря Марио Капекки, Оливер Смитис и Мартин Эванс в 80-х годах ХХ века были разработаны методы избирательного нокаута на основе введения специфических генных модификаций посредством эмбриональных стволовых клеток, за которые вышеуказанные исследователи впоследствии получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2007 г. [2].

Применение подобных технологий, безусловно, продолжает оказывать важное влияние на понимание механизмов патологических процессов, затрагивающих структуру и функционирование всего генома человека в равной степени, как и отдельных генов. Развитие методов секвенирования создало предпосылки для разработки методов целевого воздействия на единичные гены для изменения экспрессии последних. В настоящее время применяется несколько способов нокаутов генов. Одним из стандартных методов является использование антисмысловых олигонуклеотидов (ACO) [1]. Казалось, что применение АСО стало идеальной стратегией для внедрения совершенствующихся знаний о человеческом геноме для разработки новых лекарственных средств [3]. В 1967 г. Д.Г. Кнорре и Н.И. Гринева впервые выдвинули идею о ген-направленном воздействии олигонуклеотидов, которые могут специфически связываться и образовывать комплексы с комплементарными им нуклеотидными последовательностями [4]. В 1978 г. американские молекулярные биологи P. Zamecnik, M. Stephenson [5] показали эффект воздействия АСО на биологические мишени. В исследовании они продемонстрировали подавление развития вируса саркомы Рауса с помощью специфической последовательности олигонуклеотидов. В данной работе впервые было показано, как синтетический олигонуклеотид, состоящий из 13 нуклеотидов, комплементарный РНК вируса саркомы Рауса, при добавлении к тканевым культурам фибробластов куриного эмбриона, инфицированным вирусом саркомы Рауса, вызывает подавление репликации вируса, тем самым не допуская дальнейшего развития опухоли. Так, впервые было доказано, что АСО могут специфично ингибировать экспрессию генов [5].

Необходимо отметить, что на данный момент известно три вида антисмысловых технологий: применение АСО, рибозимов (ферментативных рибонуклеиновых кислот) и РНК-интерференция. Использование вышеуказанных средств позволяет выполнять подавление экспрессии гена на стадиях транскрипции, трансляции, деаденилирования или деградации мРНК [6]. Вышеперечисленные молекулы имеют разные механизмы действия, но всех их объединяет общий принцип: антисмысловой эффект развивается после связывания с РНК-мишенью.

Исследования по применению рибозимов стали выполняться одновременно с таковыми по использованию АСО, но рибозимы, к сожалению, не нашли широкого применения из-за их нестабильности при попадании в плазму крови [7].

Еще один вид антисмысловых технологий основан на использовании малых интерферирующих РНК (siRNA), действующих на основе принципа РНК-интерференции. В сравнении с рибозимами и АСО малые интерферирующие РНК имеют ряд преимуществ, заключающихся в высокой специфичности действия и эффективности подавления экспрессии генов [8]. Вместе с тем проблема применения малых интерферирующих РНК — быстрое разрушение под действием РНКаз и затруднительная доставка в клетки [9, 10].

Для эффективного связывания АСО должны состоять не менее чем из 11 оснований, большинство применяемых в экспериментальной медицине АСО содержит 15—25 нуклеотидов. Безусловным преимуществом применения данной технологии является возможность ингибировать уникальные мишени с высокой специфичностью, что используется в конечном итоге для блокирования синтеза широкого спектра белков [11].

Условие эффективного функционирования АСО — успешное проникновение в клетки-мишени [12]. Интересно, что даже на сегодняшний день точные механизмы проникновения олигонуклеотидов остаются недостаточно ясными. Установлено, что проникновение происходит посредством активного транспорта, который в свою очередь зависит от температуры, структуры и концентрации олигонуклеотида и типа клеток. В настоящее время считается, что адсорбционный эндоцитоз и пиноцитоз в жидкой фазе — ключевые механизмы интернализации олигонуклеотидов, зависящие от их концентрации. При относительно низкой концентрации АСО интернализация, вероятно, происходит путем взаимодействия с рецептором, находящимся на мембране клетки. При относительно высокой концентрации олигонуклеотида после связывания со всеми доступными рецепторами включается процесс пиноцитоза [13].

Во многих исследованиях показано, что немодифицированные олигонуклеотиды плохо проникают в клетки независимо от того, заряжены они или нет. Такие АСО, как правило, локализуются в эндосомах/лизосомах, где они не могут выполнять свои основные задачи и разрушаются нуклеазами в дальнейшем. Нуклеиновые кислоты без различных модификаций слабо связываются с белками плазмы, очень быстро фильтруются почками и выводятся с мочой, в то время как для реализации своих эффектов непременным условием является проникновение АСО в ядро клетки [12].

Первым из разработанных средств доставки были липосомы, которые представляют коллоидные везикулы, т.е. мелкодисперсные взвеси, состоящие из фосфолипидов и холестерина. Липосомы могут быть нейтрально или положительно заряженными в зависимости от природы фосфолипидов. Нуклеиновые кислоты можно легко инкапсулировать во внутреннюю водорастворимую часть липосомы или связать с поверхностью липосомы посредством электростатических взаимодействий. Липосомы из-за своего положительного заряда имеют высокое сродство к клеточным мембранам, которые в физиологических состояниях отрицательно заряжены [14].

Другим способом доставки является применение катионных полимеров, таких как поли-L-лизин, полиалкилцианакрилатные наночастицы и полиэтиленимин [15, 16]. Нуклеиновые кислоты взаимодействуют с этими средствами доставки через электростатические взаимодействия. Катионные полимеры обеспечивают проникновение АСО в клетки посредством эндоцитоза [12]. Поскольку эти пептиды положительно заряжены, они обладают высоким сродством к клеточным мембранам, которые в физиологических условиях заряжены отрицательно. Их ковалентное связывание с АСО способствует проникновению последнего в цитоплазму клетки и, следовательно, в конечном счете в ядро. Эффективность была продемонстрирована в различных клеточных линиях и моделях лабораторных животных, но, к сожалению, эти полиамины токсичны и используются реже катионных липосом.

Еще один подход к интернализации олигонуклеотидов состоит в том, чтобы создать пермеабилизацию плазматической мембраны и позволить свободным олигонуклеотидам проникать в клетки путем диффузии [17]. Такой подход включает образование так называемых пор в мембране, индуцированных путем изменения проницаемости мембраны клетки под воздействием стрептолизина-O, механическим путем с помощью микроинъекций или под действием электоромагнитного поля. Все эти способы в определенных обстоятельствах могут позволить заряженным или незаряженным олигонуклеотидам быстро проникать в клетки и достигать ядра, где они осуществляют ингибирование функции целевого гена. Вместе с тем они опасны для применения in vivo в виду кумуляции таких АСО в печени и почках, реализуя таким образом выраженную нефро- и гепатотоксичность. В связи с этим их использование для поставленной цели ограничено [17].

Следовательно, несмотря на то что АСО обладают возможностью связываться с определенными генами-мишенями, достижение целевой молекулы представляется не всегда успешным и требует оптимизации подходов для эффективной доставки АСО.

Одним из первых клинически разрешенных препаратов, основанных на применении технологии АСО, является патисиран, специфически связывающийся с мРНК белка транстиретина (TTR) [18].

На 2020 г. зарегистрировано всего 10 препаратов на основе олигонуклеотидов, которые одобрены к применению регуляторами в области безопасного использования лекарственных средств в различных странах [19] (см. таблицу).

Одобренные к применению на 2020 г. антисмысловые олигонуклеотидные препараты

Примечание. FDA — управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. EMA — Европейское агентство по лекарственным средствам. OMIM — медицинская база данных, в которой собирается информация об известных заболеваниях с генетическим компонентом и генах, ответственных за их развитие.

Стоит отметить, что список олигонуклеотидов, отклоненных для дальнейшего использования в качестве биомедицинских препаратов, все же продолжает расти. На это есть множество причин, например, трудности в проникновении АСО в клетку, нефротоксичность, неправильно подобранная нуклеотидная последовательность ACO (когда подобранный АСО некомплементарен участку гена при патологии), недостаточный для терапии достигнутый уровень нокдауна, офф-таргетная активность ACO и, что наиболее важно, терапевтический индекс, ограничивающий лечение. На практике получается, что информации о функционировании отдельных клеток или органов недостаточно, чтобы сконструировать некое универсальное средство для лечения даже отдельной болезни. Данный факт является причиной того, что широкий ряд ДНК-фрагментов, содержащий иногда набор различных модификаций, не доходит даже до самой ранней стадии клинических испытаний, оставаясь в химической лаборатории в качестве новых соединений, но не биомедицинских препаратов. Химический синтез терапевтических олигонуклеотидов нетривиален, и комбинированные эффекты нескольких модификаций часто непредсказуемы. При выборе модификаций и их положений во фрагменте нуклеиновой кислоты необходимо руководствоваться эмпирическим тестированием [30]. Кроме того, из-за их нефротоксичности у пациентов, получающих длительное лечение АСО, требуется регулярно контролировать функцию почек [31].

Однако ряд исследований показывает эффективность и сохраняющуюся перспективность использования АСО. Известно, что развитие лекарственной устойчивости, характерной для меланомы, частично объясняется сверхэкспрессией антиапоптотического белка BCL-2. В исследовании, выполненном канадскими исследователями C. Cresce, J. Koropatnick [32], показано действие двух АСО к bcl-2. Их применение вызывало снижение экспрессии молекулы-мишени в исследуемых тканях при диссеминированных формах меланомы и рака предстательной железы. В другой работе было определено, что ингибирование bcl-2 и bcl-xL в первичных клетках меланомы на основе АСО сопровождается активацией апоптоза и снижением экспрессии этих генов-мишеней [33]. Другим веществом для ингибирования bcl-2 на основе АСО является облимерсен натрия, состоящий из 18 нуклеотидов. Облимерсен подавляет экспрессию белка bcl-2 и увеличивает индуцированный химиотерапией апоптоз в ксенотрансплантатах рака кожи человека.

Другой молекулой-мишенью АСО является белок сурвивин, который обладает способностью ингибировать апоптоз и стимулирует пролиферацию опухолевых клеток [31]. Сурвивин — один из наиболее специфичных онкобелков и сверхэкспрессируется почти при всех злокачественных новообразованиях, в том числе при раке кожи [34]. В 2008 г. была выявлена эффективность АСО LY2181308 к ингибированию сурвивина. В соответствующем исследовании осуществлялось взятие ксенотрансплантатов у 20 пациентов с раком прямой кишки, у которых наблюдалась повышенная экспрессия сурвинина в опухолевой ткани. Применение АСО к сурвивину по результатам выполненного исследования приводило к значительной задержке роста опухоли [35]. Другое проведенное рандомизированное открытое исследование II фазы было выполнено с участием 16 пациентов с острым миелоидным лейкозом, в котором оценивались эффективность, безопасность, фармакокинетика и фармакодинамика этого же вещества. Исследование определило эффективность LY2181308 подавлять экспрессию сурвивина, вызывать остановку клеточного цикла и индуцировать апоптоз опухолевых клеток. LY2181308 хорошо переносился, а уровни сурвивина снижались только у пациентов с его высокой экспрессией. В целом применение LY2181308 в сочетании с химиотерапией приводило к полному ответу у 4 из 16 пациентов, у 1 из 16 пациентов был неполный ответ. 9 пациентов умерли во время исследования: 6 из них получали АСО в качестве монотерапии, 3 — в комбинации с другими противоопухолевыми средствами. В результате проведенного исследования были сделаны выводы, что LY2181308 достаточно хорошо переносится, а токсические эффекты обусловлены либо средствами стандартной химиотерапии, либо прогрессированием заболевания. LY2181308 в комбинации с цитостатическими препаратами цитарабином и идарубицином не вызывает дополнительных токсических изменений и демонстрирует некоторый клинический эффект, требующий дополнительного подтверждения клиническими исследованиями [36].

Другое клиническое исследование с применением противоопухолевой терапии на основе АСО осуществлено у пациентов с метастатическим уретральным раком. В рандомизированном открытом клиническом исследовании II фазы применялся АСО OGX-427 в комбинации с доцетакселом. В данном исследовании приняли участие 200 пациентов, у которых наблюдалось неблагоприятное течение заболевания на фоне стандартной терапии доцетакселом. Пациенты были разделены на две группы, первая группа получала терапию доцетакселом, вторая — доцетаксел в комбинации OGX-427 (Apatorsen). Целевой мишенью данного АСО является белок теплового шока Hsp27, который участвует в ингибировании апоптоза и регуляции роста и дифференцировки клеток. Результаты данного исследования показали, что снижение экспрессии Hsp27 посредством воздействия на него АСО повышает выживаемость пациентов по сравнению со стандартной терапией доцетакселом. Смертность больных на фоне терапии АСО составила 78,77%, тогда как в контрольной группе — 85,15%. Однако в этом же исследовании выявлено, что у 56,7% больных, получавших комбинированную терапию, регистрировались серьезные побочные эффекты, такие как тяжелая анемия, печеночная и почечная недостаточность, в то время как у больных при монотерапии частота развития осложнений составила 44,55% [37].

Другим АСО, находящимся на этапе клинических испытаний, является венетоклакс (ABT-199/GDC-0199). Это специфический ингибитор, мишенью которого также является bcl-2. В этом исследовании приняли участие 32 человека. Было показано, что блокирование bcl-2 у пациентов с острым миелобластным лейкозом позволяет в значительной степени снизить устойчивость к химиотерапии из-за влияния на опухолевые стволовые клетки [38]. На данный момент исследование эффективности ингибирования bcl-2 на основе АСО также проводится при хроническом лимфолейкозе, где предполагается установить их терапевтический эффект в качестве монотерапии и при комбинированной терапии с ритуксимабом [39].

Стоит отметить, что АСО активно исследуются не только для лечения злокачественных заболеваний. Так, в данное время выполняется активное исследование II фазы подкожного введения АСО инклисирана в дозе 300 мг, мишенью которого является гидролитический фермент семейства пропротеиновых конвертаз PSK9. Предполагается, что ингибирование PSK9 может приводить к снижению уровня холестерина более чем на 50% в течение 6 мес с незначительными побочными эффектами. Если эффективность и безопасность будут подтверждены в продолжающемся в настоящее время исследовании и затем в III фазе исследования с участием 15 000 человек, терапия инклисираном может стать альтернативой статинам при лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Этот препарат основан на использовании малых интерферирующих РНК [40].

С января 2020 г. выполняется рандомизированное контролируемое клиническое испытание II фазы с внутрикожным введением тилсотолимода (MO-2125) при меланоме I—II стадии для оценки общей выживаемости, частоты положительных ответов в сторожевых лимфатических узлах и безрецидивной выживаемости. В этом исследовании определяли эффект анализируемого вещества у 214 пациентов с вышеуказанным диагнозом. Тилсотолимод является синтетическим агонистом толл-подобного рецептора 9 (TLR9), другое название CD289 [41].

С 2019 г. проводится клиническое исследование I фазы в отношении побочных эффектов АСО SD-101 в сочетании с применением иммунологического препарата ниволумаба и лучевой терапии у пациентов с распространенной формой рака поджелудочной железы IV стадии, характеризующегося рефрактерностью к химиотерапии. Мишенью SD-101 является толл-подобный рецептор 9 (TLR9), который экспрессируется в клетках иммунной системы, включая дендритные клетки, макрофаги, клетки-киллеры. TLR9 преимущественно связывает ДНК, присутствующую в бактериях и вирусах, и запускает сигнальные каскады, которые приводят к развитию провоспалительного цитокинового ответа. Применение АСО к TLR9 в сочетании с антителами к PD-L1 и PD-L2 и лучевой терапией может обеспечить повышение показателей общей и безрецидивной выживаемости при аденокарциноме поджелудочной железы [42].

Резюмируя, стоит отметить, что нацеленное на единичные молекулы воздействие с применением АСО имеет перспективы для использования в клинической медицине. Вместе с тем применение олигонуклеотидов в фундаментальных и клинических исследованиях, а затем в терапевтических целях требует их оптимизации посредством химических модификаций в структуре для улучшения физико-химических и биологических свойств [7].

На сегодняшний день терапия АСО является эффективным подходом для избирательного моделирования экспрессии гена. Количество исследований в этой области непрерывно растет, что обусловлено в том числе необходимостью постоянного поиска новых средств противоопухолевой терапии [43]. Однако оптимальное использование АСО в качестве лекарственных средств в настоящее время затруднено из-за ряда проблем, таких как их нестабильность в физиологических жидкостях, разрушение под действием РНКаз, недостаточная биодоступность в тканях, способность накапливаться в печени, почках и кишечнике, что требует введения высоких доз для достижения соответствующей фармакологической концентрации. Все вышеперечисленное необходимо учитывать наравне с возможностью производства и экономической эффективностью. Также при введении АСО непосредственно пациенту следует учитывать многие факторы: период полувыведения вещества, скорость клиренса. Различные носители — липосомы, полимеры и проникающие в клетки пептиды — были предложены в качестве основных методов доставки АСО к мишеням, но отсутствие у них клеточной специфичности остается основным недостатком их клинического использования. Помимо того, использование пептидов как средств доставки АСО к цели дает выраженные токсические эффекты у пациентов, что зачастую требует отмены препаратов [44—46]. Таким образом, можно сделать вывод, что наряду с необходимой защитой АСО от действия гидролитических ферментов их доставка к конкретным типам клеток и контроль высвобождения являются ключевой задачей для трансформации данного экспериментального метода в терапевтические средства. С решением этих недостатков АСО могут оказаться прорывной технологией для лечения угрожающих жизни людей заболеваний в ближайшем будущем.

Заключение

Применение АСО обладает потенциальной терапевтической значимостью для лечения онкологических заболеваний. Особое внимание к данным веществам связано с их способностью модулировать экспрессионную активность тех молекул, которые отвечают за реализацию процессов пролиферации, инвазии, ангиогенеза и ассоциированы с опухолевой прогрессией. На данный момент имеется 10 одобренных препаратов на основе АСО, 3 из которых были разрешены для применения за последние 12 месяцев, ряд препаратов на основе АСО проходит исследование во II и III фазе клинических испытаний. Терапия на основе АСО может расширяться для лечения социально значимых заболеваний [19, 45].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.