Введение

Pseudomonas aeruginosa, или синегнойная палочка, условно патогенная грамотрицательная бактерия, вызывает до 30%, а в некоторых отделениях — до 50% всех оппортунистических внутрибольничных инфекций, которые сопровождаются высокой (34—48%) летальностью. Синегнойная палочка в высоком проценте случаев является причиной внутрибольничных пневмоний, первичных бактериемий, инфекций мочеполовой системы, гнойных послеоперационных и ожоговых инфекций. Несмотря на своевременное лечение антибиотиками, показатели смертности от синегнойных инфекций остаются высокими, а в случае с больными, находящимися на искусственной вентиляции легких (ИВЛ), смертность доходит до 60% [1].

Трудности лечения псевдомонадной инфекции вызваны чрезвычайно высокой распространенностью у этого патогена множественной устойчивости к антибиотикам. Штаммы синегнойной палочки, циркулирующие в стационарах, часто устойчивы почти ко всем классам антибиотиков, доступным в больницах [2].

В сложившейся ситуации становится очевидной необходимость разработки новых стратегий для решения данной проблемы. Инновационным решением является изменение парадигмы борьбы с инфекциями: лекарство должно подавлять вирулентность, но не убивать патоген, тем самым предотвращая селективный отбор возникающих мутаций устойчивости к применяемому препарату. Уничтожение возбудителя, утратившего вирулентные свойства, будет происходить в результате воздействия иммунных защитных сил организма-хозяина. Подавление вирулентности приведет к ограничению проявления симптомокомплекса заболевания, а также позволит избежать гибели нормальной, не патогенной, микрофлоры человека [3].

Синегнойная палочка обладает разнообразными факторами патогенности, но ведущая роль среди них принадлежит системе секреции третьего типа (ССТТ). Мутации, приводящие к нарушению функций ССТТ, вызывают снижение или потерю вирулентности [4]. Острые синегнойные инфекции, вызванные штаммами, секретирующими токсины-эффекторы ССТТ, характеризуются высокой концентрацией возбудителя в пораженных органах и тканях, частыми рецидивами после выздоровления, а также приводят к значительному увеличению смертности [5].

Таким образом, ССТТ псевдомонад является перспективной мишенью для разработки инновационных антивирулентных препаратов на основе ингибиторов ССТТ. В данном обзоре рассмотрены современные представления о структуре, функции и регуляции ССТТ псевдомонад, охарактеризованы перспективные мишени для действия ингибиторов в составе секреторного аппарата и представлены данные о наиболее эффективных ингибиторах ССТТ P. aeruginosa.

Структура ССТТ P. aeruginosa

ССТТ является высококонсервативной структурой, имеющей значительное сходство у неродственных видов грамотрицательных микроорганизмов [6, 7]. Структурно ССТТ представляет собой трансмембранный комплекс, или инжектисому, позволяющий бактерии вводить свои токсины (называемые эффекторами) непосредственно в цитозоль эукариотической клетки-мишени. Процесс формирования структурного аппарата ССТТ и транспорта эффекторов активируется в результате контакта бактериальной и эукариотической клеток [8]. ССТТ проходит сквозь внутреннюю и внешнюю мембрану бактерии и мембрану клетки хозяина. Можно выделить 3 структурные части ССТТ: цитоплазматическая часть, базальное тело и внеклеточная часть.

В цитоплазматическую часть ССТТ входят экспортный аппарат (ЭА), цитоплазматическое кольцо и АТФазный комплекс. ЭА расположен во внутренней мембране клеточной стенки и собран из 5 мембранных белков: PscR, PscS, PscT, PscU и PcrD [8]. Белок PcrD формирует экспортные ворота, представляющие собой кольцо, состоящее из 7 субъединиц, и в комплексе с другими белками ЭА выполняет функцию входного портала канала ССТТ для прохождения субстратов [9]. Непосредственно под экспортным аппаратом находится цитоплазматическое кольцо (Ц-кольцо), образуемое белком PscQ и расположенное вокруг АТФазного комплекса. АТФазный комплекс состоит из белка АТФазы PscN, белка стебелька PscO, белка PscL, который соединяет Ц-кольцо и АТФазу и является ее негативным регулятором, а также белка кофактора PscK [10]. Эти белки образуют сортировочную платформу.

Базальное тело состоит из кольцевых структур, встроенных в клеточную стенку бактерии. Белки внутренней мембраны, PscJ и PscD, образуют два мембранных кольца, встроенных друг в друга, внутри этих колец расположен ЭА [11]. Кольцо наружной мембраны, образованное N-концевыми доменами белка PscC, или секретина, проникает глубоко в периплазму и непосредственно взаимодействует с кольцом внутренней мембраны PscD, соединяя тем самым внутренние и наружные мембранные кольца.

Внеклеточная часть ССТТ состоит из иглы и транслокационного аппарата. Игла состоит из сотен копий белка PscF, собранных по спирали, и белка внутреннего стержня PscI, обусловливающего связь с базальным телом [12]. На конце иглы расположен белок кончика иглы PcrV. Длина иглы контролируется белком PscP, и у разных видов бактерий длина иглы может отличаться [13].

При контакте с клеткой хозяина ССТТ формирует в мембране эукариотической клетки транслокационный аппарат, состоящий из 3 структурных белков, 2 секретируемых белков PopB и PopD, которые взаимодействуют между собой и образуют комплекс PopB/D, необходимый для формирования поры в мембране клетки-хозяина, и одного белка PcrV. Белок PcrV псевдомонад является высокоспецифичным белком. Через транслокационную пору осуществляется транспорт эффекторов из бактериальной клетки в цитозоль клетки-мишени [14].

Регуляция секреторной активности ССТТ P. aeruginosa

Известно, что сигналом, который запускает экспрессию генов ССТТ, является, в первую очередь, прямой контакт инжектисомы с клеткой хозяина, но точный механизм передачи сигнала еще мало изучен. Процесс секреции регулируется на двух уровнях: транскрипционном и секреторном. В отсутствие секретирующих условий секреция белков ССТТ находится на базовом уровне.

Регуляция экспрессии генов ССТТ активатором транскрипции ExsA

Регулон ССТТ P. aeruginosa состоит примерно из 40 генов, организованных внутри 10 транскрипционных единиц. Они кодируют структурные, регуляторные и эффекторные белки, а также цитоплазматические шапероны [15].

Все гены ССТТ, включая гены, кодирующие эффекторы, находятся под контролем белка ExsA — транскрипционного активатора AraC-типа, являющегося центральным регулятором регулона ССТТ P. aeruginosa. Блокирование его функции приводит к снижению экспрессии генов ССТТ и подавлению вирулентности P. aeruginosa [15].

Регуляция экспрессии генов ССТТ контролируется каскадом ExsADCE из регуляторных белков ExsE, ExsC, ExsD и ExsA. При отсутствии индуцирующих ССТТ сигналов ExsC связан с ExsE, а ExsD с ExsA, что приводит к ингибированию ExsA-зависимой транскрипции. В условиях индукции (контакт с эукариотической клеткой, сниженное количество кальция) происходит выделение отрицательного регулятора ExsE, высвобождение ExsC и его связывание с ExsD, и в итоге освобождение ExsA, который связывается со своим промотором и активирует транскрипцию генов ССТТ. Каскад ExsADCE позволяет быстро индуцировать экспрессию генов ССТТ [16].

Активация ExsA ССТТ-независимыми путями

Помимо активации ExsА при участии вышеописанного каскада экспрессия гена exsA регулируется также тремя регуляторными путями: CyaB-cAMP / Vfr, GacSA-RsmYZ-RsmA и PsrA-RpoS.

Путь CyaB-cAMP/Vfr. Vfr — это цАМФ-зависимый регулятор транскрипции, известен как глобальный регулятор экспрессии генов вирулентности. Vfr-регулон состоит примерно из 200 генов, участвующих в регуляции экспрессии генов систем секреции третьего и второго типов, пилей IV типа и системы кворум сенсинг. В условиях индукции секреции аденилатциклаза (CyaB) активируется и продуцирует циклическую АМФ, взаимодействующую с белком Vfr. Вместе с цАМФ регулятор Vfr увеличивает транскрипцию гена exsA, взаимодействуя с промотором, расположенным непосредственно перед exsA [17].

Путь GacSA-RsmYZ-RsmA. Экспрессия гена exsA P.aeruginosa также регулируется регулятором накопления углерода, RsmA. GacS — трехсторонняя сенсорная гистидинкиназа, которая воспринимает из окружающей среды сигналы индукции секреции, активирующие регулятор ответа GacA путем фосфорилирования, что, в свою очередь, вызывает экспрессию малых регуляторных РНК RsmY и RsmZ. Транскрипты RsmY и RsmZ связывают регулятор накопления углерода RsmA, что приводит к снижению экспрессии exsA [15].

Путь PsrA-RpoS. PsrA, сенсорный регулятор длинноцепочечных жирных кислот, напрямую связывается с промоторной областью оперона exsCEBA и позитивно регулирует экспрессию этих генов. Наряду с этим PsrA также связывается с промоторной областью гена rpoS и позитивно регулирует его транскрипцию, которая, в свою очередь, репрессирует экспрессию exsA и другие гены ССТТ [18].

Секреторный путь регуляция ССТТ

Контроль сборки и функционирования ССТТ осуществляется также на уровне секреции белков, которые разделяют на следующие группы: ранние (белки иглы и стержня), средние (транслокаторы) и поздние (эффекторы) субстраты. Процесс секреции имеет строгую иерархию и происходит пошагово [8].

На первом этапе аутопротеаза PscU и белок PscP, контролирующий длину иглы, участвуют в регуляции секреции ранних субстратов, непосредственно формирующих иглу ССТТ. На втором этапе PscU участвует в переключении секреции на средние субстраты, что создает транслокационную пору в мембране клетки хозяина. Контроль такого переключения происходит в результате изменения конформации белка PscU и его взаимодействия с белками экспортного аппарата [19].

На следующем этапе работает целый комплекс цитоплазматических белков: регулятор PcrG, привратник PopN, АТФаза ССТТ (PscN) и поздние субстрат-специфичные шапероны. Эти белки переключают секрецию со средних на поздние субстраты, что позволяет доставлять эффекторы ССТТ через иглу и транслокационную пору в клетку-хозяина [8, 20].

Белок PopN связан с тремя белками: Pcr1, Pcr2 и PscB. Белки Pcr2 и PscB образуют гетеродимерный шаперон. Весь этот комплекс из четырех белков соединен с ССТТ через взаимодействие Pcr1 с PcrD. Белок PopN и связанные с ним регуляторы контролируют секрецию эффекторов за счет того, что они частично закупоривают канал секреции, будучи прикрепленными к ССТТ. В индуцирующих условиях PopN освобождает канал секреции, а эффекторы получают доступ к секреторному аппарату. Доступ происходит через сортировочную платформу [20].

Для последующей секреции из бактериальной клетки эффекторы с их родственными шаперонами взаимодействуют с комплексом АТФазы. Здесь гидролиз АТФ с помощью АТФазы помогает отщеплять шапероны от комплекса эффектор-шаперон и одновременно разворачивать их, а далее секретировать эффекторы через иглу ССТТ [10].

Таким образом, присоединение иглы к мембране клетки хозяина и образование транслокационной поры запускает доставку развернутых эффекторов через полый канал, образованный внутри иглы, непосредственно в цитозоль эукариотических клеток.

Как стало известно в последнее время, еще один цитоплазматический белок, PscO, энергетически обеспечивает функционирование секреторного аппарата при участии протон-движущей силы. Так, P. Halder и соавт. [10] на модели ротационной секреции показали, что протондвижущая сила, наряду с гидролизом АТФ, ответственна за вращение основания инжектисомы и, таким образом, за один оборот секретирует развернутые молекулы эффекторных белков через цитоплазматический комплекс, базальное тело, иглу и, в конечном счете, в эукариотическую клетку.

Эффекторы ССТТ и другие транспортируемые ССТТ белки

Синегнойная палочка обладает разнообразными факторами патогенности, но ведущая роль в патогенезе принадлежит эффекторным белкам ССТТ. На данный момент у синегойной палочки идентифицировано 4 эффекторных белка-экзотоксина: ExoU и ExoS, ExoT и ExoY [6].

Наиболее вирулентные штаммы P. aeruginosa продуцируют экзотоксин ExoU. N-концевой фрагмент экзотоксина ExoU обладает фосфолипазной активностью. Конечным результатом токсического действия ExoU на клетку является клеточная гибель, которая характеризуется стремительным, в течение 1—2 ч, нарушением целостности цитоплазматической мембраны, как при некрозе. Токсическое действие ExoU направлено против фагоцитов, а также на преодоление эпителиального барьера, что способствует бактериальной диссеминации и персистенции [21].

Экзотоксины ExoS и ExoT являются бифункциональными белками, активирующими ГТФ-азы и обладающими АДФ-рибозилтрансферазной активностью. Несмотря на то что эффекторы ExoT и ExoS имеют идентичные на 76% аминокислоты и структурное сходство, тем не менее функционально они разные.

Активность ExoS направлена на нарушение цитоскелета, что приводит к округлению клеток и снижению захвата псевдомонад определенными типами клеток, т.е. вызывает подавление фагоцитоза. Необратимое разрушение цитоскелета может приводить к нарушению клеточных контактов и способствовать проникновению псевдомонад через эпителиальный барьер. Гибель иммунных клеток при действии ExoS P. aeruginosa позволяет патогену персистировать в организме [22].

Активность ExoT направлена на подавление миграции, адгезии и пролиферации клеток, а также блокирование фагоцитоза и нарушение целостности эпителиального барьера, что способствует бактериальной диссеминации [23].

Значение 4-го эффекторного белка, ExoY, являющегося аденилатциклазой, до конца еще не изучено. Его активность приводит к нарушению цитоскелета, ингибированию захвата псевдомонад клетками хозяина и увеличению проницаемости эндотелия [24].

С помощью ССТТ транспортируются также и другие белки, как, например, пилин (PilA, главный компонент пилей IV типа) или PscI (компонент стержня базального тела ССТТ), а также различные белки жгутика, включая флагеллин (FliC). Распознавание и транспорт FliC обусловлено гомологичным и структурным сходством базального тела жгутика и ССТТ [8].

Мишени и механизм действия ингибиторов ССТТ P. aeruginosa

На сегодняшний день идентифицировано несколько классов низкомолекулярных веществ, специфически ингибирующих ССТТ грамотрицательных бактерий. Помимо низкомолекулярных соединений ингибиторы ССТТ также представлены полимерами, белками, полипептидами-миметиками, полисахаридами. Для нескольких ингибиторов были выявлены конкретные мишени в ССТТ, но большинство мишеней для ингибиторов ССТТ еще предстоит идентифицировать или охарактеризовать. Суммарная информация об известных на настоящий момент ингибиторах ССТТ, их молекулярных мишенях, представителях родов бактерий, для которых показано действие ингибиторов, а также о химических классах соединений представлена в таблице.

Примечание. ↑ — повышение; ↓ — снижение; НД — нет данных.

По мишеням воздействия на ССТТ ингибиторы могут быть разделены на следующие группы:

1) действующие на генетическую регуляцию СССТ (гидразоны салицилового альдегида, N-гидрокси-бензимидазолы, растительные фенольные соединения);

2) действующие на функционирование аппарата ССТТ (гидроксихинолины, тиазолидиноны, фенилацетамиды, PcrV-антитела (KB001, V2L2MD), PcrV/PsI-антитела MEDI3902);

3) действующие на эффекторные белки ССТТ (экзоцин, арильные сульфаниламиды, псевдолипаза A, (–)-hopeaphenol).

Ингибиторы генетической регуляции ССТТ

Одними из первых, хорошо охарактеризованных ингибиторов ССТТ являются соединения класса гидразонов салицилового альдегида, активные в отношении широкого круга бактерий, таких как Y. pseudotuberculosis, S. enterica серовар Typhimurium, Shigella spp., Chlamydia spp., E. coli O157:H7, P. aeruginosa и растительного патогена Erwinia amylovora [25, 26].

В 2003 г. А. Kauppi и соавт. [25] в результате скрининга химической библиотеки из 9400 соединений идентифицировали несколько гидразонов салицилового альдегида, таких как INP0007 и INP0010, эффективно подавлявших секрецию эффектора YopE Y. pseudotuberculosis in vitro.

Другое соединение этого класса, INP0341, подавляло транскрипцию генов ССТТ, в том числе у штаммов с их конститутивной экспрессией, и снижало уровень экспрессии экзотоксинов. Авторы предположили, что возможным механизмом действия ингибитора является подавление транскрипции оперона, кодирующего ССТТ P. aeruginosa [26].

Было показано, что INP0341 ингибировал ССТТ-зависимую внутриклеточную репликацию C. trachomatis в клетках HeLa, подавляя секрецию хламидийного эффекторного белка IncA. Также соединения этого класса подавляют секрецию эффекторных белков у Salmonella enterica in vitro [27].

Результаты исследований на моделях у животных демонстрировали снижение клинических симптомов инфекций, вызванных S. enterica серовар Typhimurium и Citrobacter rodentium, после терапии гидразонами салицилового альдегида [28]. В другой работе [29] была показана эффективность терапии соединением INP0341 в отношении вагинальной хламидийной инфекции у мышей.

Действие ингибитора INP0341 на P. aeruginosa было показано на модели ожоговой инфекции у мышей. Аппликационная терапия INP0341 достоверно повышала продолжительность жизни у животных в группе лечения, однако не предотвращала системное распространение инфекции и гибель мышей [30].

К недостаткам соединения салицилиден-ацилгидразида INP0341 можно отнести неудовлетворительные фармакокинетические параметры, связанные с невозможностью достигать высоких концентраций в плазме крови, а также короткий период полувыведения этого вещества. Таким образом, гидразоны салицилового альдегида могут рассматриваться как перспективные препараты на основе специфических ингибиторов ССТТ широкого круга грамотрицательных бактерий, требующие, однако, дальнейших фармакологических оптимизаций.

Соединения N-гидроксибензимидазола (N-hydroxybenzimidazoles) были получены путем скрининга низкомолекулярных соединений и представляют собой класс антивирулентных молекул, которые ингибируют ДНК-связывающую активность некоторых AraC белков [31]. У псевдомонад белок ExsA является ключевым регулятором транскрипции ССТТ регулона AraC-типа. Было показано, что N-гидроксибензимидазолы взаимодействуют с ДНК-связывающим доменом ExsA, тем самым ингибируя ДНК-связывающую активность белка ExsA и подавляя ExsA-зависимую активацию транскрипции. Такое взаимодействие, по-видимому, является специфическим, поскольку ингибиторы не подавляли активацию транскрипции, связанную с глобальным регулятором вирулентности, белком Vfr [32].

Биологические эффекты N-гидроксибензимидазола проявлялись в снижении экспрессии генов ССТТ и ССТТ-опосредованной цитотоксичности in vitro. Действие N-гидроксибензимидазолов in vivo пока показано не было [33].

Соединения TS027 и TS103 были идентифицированы в результате скрининга библиотеки растительных фенольных соединений. Они подавляли транскрипцию гена exoS через регуляторный путь GacSA-RsmYZ-RsmA-ExsA. На данном этапе разработки влияние соединений TS027 и TS103 на ССТТ-опосредованную цитотоксичность не исследовали [34].

Ингибиторы функционирования аппарата ССТТ

Гидроксихинолины были впервые описаны как ингибиторы экспрессии генов ССТТ у Y. pseudotuberculosis [35], а затем у P. aeruginosa. INP1855, ингибитор из класса гидроксихинолинов, был получен путем скрининга библиотеки из 17 500 синтетических низкомолекулярных органических молекул. Было показано, что гидроксихинолин INP1855 подавлял секрецию отрицательного регулятора транскрипции ExsE, эффекторного белка ExoS и белка жгутика FliC, и это дало основание предположить, что у гидроксихинолинов в ССТТ и во флагелле может быть общая мишень [36]. Исследования механизма действия указывают на то, что такой мишенью INP1855 может быть АТФаза, поскольку воздействие INP1855 на бактериальные клетки повышает уровень АТФ только у штаммов, экспрессирующих ССТТ и/или флагеллу. Данное исследование было проведено на белке АТФазного комплекса YscN у Y. pseudotuberculosis. На данный момент нет четких данных, которые бы показывали прямое действие ингибитора INP1855 на белок АТФазного комплекса PscN у P. aeruginosa. Однако, поскольку белок YscN имеет 57% гомологии с белком PscN (по данным выравнивания BLAST), можно предположить, что INP1855 будет также ингибировать и активность белка PscN [37].

In vitro INP1855 защищал эукариотические клетки от ССТТ-опосредованной цитотоксичности и подавлял активацию каспазы-1 с последующим высвобождением IL-1β в фагоцитирующих клетках, что указывало на подавление процесса активации NLRC4 инфламосомного сигнального пути [38]. Лечение ингибитором INP1855 in vivo на модели острой псевдомонадной пневмонии у мышей приводило к снижению повреждений и количества псевдомонад в легких, а также к ограничению диссеминации бактерий в селезенку.

При этом не было отмечено разницы в высевах из тканей легкого от животных из группы лечения и контрольной группы, так как ингибитор INP1855 не действовал на жизнеспособность бактерий. Однако при этом было показано уменьшение притока нейтрофилов и макрофагов в очаг инфекции, а также значительное уменьшение уровня IL-1β и повышение уровня IL-17 в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), что говорит о купировании острого воспаления. Работа с гидроксихинолинами продолжается, однако данных о переходе разработок на стадию доклинических исследований в литературе пока не описано [37].

Тиазолидиноны. Соединение класса тиазолидинонов, 2-имино-5-арилидентиазолидинон, было выбрано как перспективный ингибитор ССТТ, который обладал широким спектром действия против грамотрицательных патогенов [39]. Этот ингибитор был получен в результате скрининга библиотеки из 92 000 низкомолекулярных соединений с помощью высокопроизводительного экспериментального тестирования соединений в отношении подавления функции ССТТ у S. enterica серовар Typhimurium. Для этого был сконструирован штамм сальмонелл, у которого ССТТ-зависимым образом секретировался белок-эффектор SipA, «слитый» с белком YplA Y. enterocolitica, обладающим фосфолипазной активностью. Было показано, что 2-имино-5-арилидентиазолидинон дозозависимо ингибирует секрецию эффекторных белков сальмонелл SipA и SspH1, не влияя на рост бактерий [39]. При изучении механизма действия полученного ингибитора было выявлено, что он вызывает снижение количества структурных белков ССТТ, InvG, PrgH и PrgK, формирующих секретирующий комплекс во внутренней и наружной мембране клеточной стенки S. enterica серовар Typhimurium, что предполагает ингибирование сборки или дестабилизацию секреторного аппарата [40].

Учитывая структурное сходство ССТТ и аппарата жгутика в области базальной структуры, расположенной в цитоплазматической мембране, изучали действие ингибитора 2-имино-5-арилидентиазолидинона на подвижность бактерий S. enterica серовар Typhimurium. Было показано, что 2-имино-5-арилидентиазолидинон не подавляет флагеллярную систему, что свидетельствует о локализации возможной мишени ингибитора в наружной мембране клеточной стенки. Авторы предположили, что такой мишенью может являться консервативный белок секретин, который присутствует не только в составе ССТТ, но и в составе систем секреции второго (ССВТ) и четвертого типа (ССЧТ). На модели P. aeruginosa было установлено, что 2-имино-5-арилидентиазолидинон подавлял транслокацию эффекторного белка ССВТ эластазы, значимого фактора вирулентности псевдомонад, а также ингибировал подвижность, зависящую от пилей ССЧТ. Таким образом, вероятной мишенью полученного ингибитора может являться секретин, единственный белок, общий для систем секреции типов II, III и IV [40].

Для 2-имино-5-арилидентиазолидинона было показано, что он подавлял ССТТ других грамотрицательных патогенов, таких как Yersinia. spp., Pseudomonas spp. и Francisella novicida [39]. То есть полученный ингибитор подавлял вирулентность патогенов млекопитающих и растений, снижая вызванную сальмонеллами гибель макрофагов и подавляя реакции гиперчувствительности у растений табака, индуцированные бактериями P. syringae. Таким образом, ингибитор 2-имино-5-арилидентиазолидинон является перспективным антивирулентным препаратом широкого спектра действия, однако данных о дальнейшей разработке этого класса ингибиторов в доступной литературе нами не было обнаружено [41].

Феноксиацетамиды представляют собой еще один класс ингибиторов ССТТ. Они были определены как ингибиторы ССТТ P. aeruginosa путем скрининга in vitro [42]. Было выдвинуто предположение, что феноксиацетамиды специфически связываются с белком иглы PscF. Основой для этой гипотезы стало наблюдение, что мутации в этом белке инактивируют ингибирующие свойства феноксиацетамида MBX1641 [43]. Было показано in vitro, что феноксиацетамиды снижали ССТТ-опосредованную цитотоксичность и облегчали интернализацию бактерий в клетки HeLa. Терапия феноксиацетамидами показала положительные результаты при подавлении псевдомонадной инфекции на модели абсцесса у мышей [44].

Тиадиазиноны. В «НИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России был разработан новый низкомолекулярный ингибитор ССТТ, названный CL-55, относящийся к классу 2,4-дизамещенных-4H- [1, 3, 4] -тиадиазин-5-онов. Соединение было получено в результате экспериментального скрининга более 400 низкомолекулярных соединений различных классов и модифицировано с целью улучшения физико-химических свойств, таких как растворимость и стабильность, и снижения токсичности для эукариотических клеток [45, 46].

Механизм действия был продемонстрирован на псевдомонадах, хламидиях и сальмонеллах при использовании специфических сывороток к эффекторным белкам, что показало подавление транслокации этих белков [47—50].

На моделях in vitro ингибирование активности ССТТ приводило к дозозависимому подавлению цитотоксичности в отношении эукариотических клеток, связанной с активностью эффекторов P. aeruginosa ЕхоU и ЕхоS. Ингибитор приводил к восстановлению фагоцитарной активности непрофессиональных фагоцитов, которая подавляется при участии белка ЕхоS, обладающего АДФ-рибозилтрансферазной активностью. Для псевдомонад было показано, что ингибитор ССТТ подавлял также подвижность, обусловленную флагеллярным аппаратом [47].

У хламидий подавление транспорта эффекторных белков семейства Inc приводило к блокированию внутриклеточного размножения как при продуктивной, так и персистентной инфекции в культуре клеток [48, 49]. Для сальмонелл было показано, что ингибитор подавлял транслокацию белков, кодируемых двумя островами патогенности, SPI-1 и SPI-2, что приводило к блокированию инвазии и подавлению внутриклеточного выживания [50].

В использованных тестах in vitro была определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК) препарата, которая составила 5—20 мкг/мл. В соответствии с механизмом действия выбранный ингибитор в условиях in vitro не обладал антибактериальным действием в отношении как изученных патогенов, так и представителей нормальной микрофлоры человека.

Проведенные исследования возможности формирования устойчивости показали, что в отличие от антибиотиков чувствительность к препарату не менялась в условиях длительного пассирования в присутствии препарата. В исследовании L. Nesterenko и соавт. [50] было продемонстрировано действие CL-55 на экспериментальную инфекцию, вызванную S. enterica серовар Typhimurium. Было обнаружено, что CL-55 подавляет сальмонеллезную инфекцию в модели генерализованной инфекции на мышах, приводя к полному уничтожению возбудителя в селезенке, печени и крови после терапии в течение 5 дней.

На основе низкомолекулярного соединения CL-55 была разработана лекарственная форма препарат Фтортиазинон (ФТ). Терапевтическое действие ФТ in vivo оценивали на модели псевдомонадной пневмонии, вызванной клиническими изолятами P. aeruginosa с различными профилями множественной антибиотикорезистентности. На разработанной модели было показано достоверное снижение бактериальной нагрузки в тканях легкого и высокий протективный эффект в группе лечения. На модели пневмонии и ожоговой инфекции, вызванной псевдомонадами, было показано блокирование генерализации инфекции, т.е. подавлялась бактериемия, характерная для таких заболеваний. На фоне лечения патоморфологические изменения в тканях были существенно меньше выражены по сравнению с контрольными животными.

ФТ демонстрировал равную эффективность с антибиотиками в отношении подавления острого инфекционного процесса и устранения возбудителя из организма животных в сопоставимых с антибиотиками дозах [47]. Для ФТ был проведен полный цикл токсикологических исследований. В ходе проведения комплексного доклинического исследования, включавшего изучение мутагенности и канцерогенности, острой токсичности, хронической токсичности, аллергизирующих свойств, иммунотоксичности и репродуктивной токсичности, не было выявлено результатов, препятствующих дальнейшей разработке препарата. Препарат ФТ прошел I фазу клинических исследований, по результатам проведения которой были получены данные, свидетельствующие о безопасности препарата. В настоящее время препарат проходит II фазу клинических испытаний на пациентах с осложненными инфекциями мочевыводящих путей.

Ингибиторы на основе антител. Среди ингибиторов, подавляющих функционирование ССТТ, отдельно можно выделить препараты на основе специфических антител. Для инактивации транслокона ССТТ P. aeruginosa были разработаны кроличьи поликлональные анти-PcrV-антитела и мышиные моноклональные анти-PcrV-антитела (mAb166.2a), ингибирующие транслокацию эффекторов псевдомонад. Такое ингибирование приводило к восстановлению фагоцитарной активности макрофагов в отношении патогена [51—53]. Несмотря на вариабельность последовательности PcrV среди различных штаммов P. aeruginosa, анти-PcrV антитела были эффективны в снижении цитотоксичности широкого спектра клинических изолятов, что позволяет предположить перспективность их применения в клинике.

Исследования по оценке возможности действия антител на биопленки были проведены V. Ray и соавт. [54]. В этой работе исследователи показали, что моноклональные антитела к экзополисахариду PsI действуют на образование и созревание биопленок, а также на уже сформировавшиеся биопленки.

Одним из препаратов на основе антител сразу к двум мишеням является MEDI3902. MEDI3902 (MedImmune LLC; Неймеген, Нидерланды) — это гуманизированые бивалентные биспецифические моноклональные антитела (mAb), действие которых направлено на инактивацию как белка кончика иглы PcrV, так и на экзополисахарида PsI. MEDI3902 снижали цитотоксичность клинических изолятов, экспрессирующих PcrV (100%) и PsI (98%) [51].

Для MEDI3902 были проведены доклинические исследования. По их результатам показано, что MEDI3902 оказывал протективный эффект на модели острой летальной пневмонии, вызванной P. aeruginosa, а также на модели бактериемии и ожоговой модели. Было выявлено, что MEDI3902 сохраняет целостность тканей легкого, снижает бактериальную нагрузку и предотвращает распространение патогена в селезенку и почки.

MEDI3902 прошел I фазу клинических испытаний и в настоящее время находится на II фазе испытаний при лечении пациентов, находящихся на ИВЛ на фоне госпитальной псевдомонадной инфекции.

Другой препарат на основе антител был разработан против белка кончика иглы PcrV, KB001 (Kalobios Pharmaceuticals; Сан-Франциско, Калифорния, США) на основе моноклональных антител к PcrV, mAb166.2a. Для препарата KB001 была показана безопасность в отношении здоровых добровольцев. Однако клинические испытания на пациентах с муковисцидозом не показали достаточную эффективность препарата КВ001, и его дальнейшее исследование было приостановлено [52].

V2L2MD — это еще один вариант антител, показавший свое действие как на клетках, так и на животных. Антитела анти-PcrVMAb V2L2MD in vitro снижали ССТТ-опосредованную цитотоксичность на человеческих бронхоэпителиальных клетках.

Антитела оказывали протективный эффект при заражении животных летальной дозой P. aeruginosa на модели острой пневмонии, а на модели нелетальной пневмонии было отмечено значительное снижение бактериальной нагрузки в легких, селезенке и почках.

В современной литературе пока не представлено данных о применении антител V2L2MD в качестве препарата для лечения псевдомонадных инфекций у людей [53].

Ингибиторы эффекторных белков ССТТ

Еще одной стратегией снижения вирулентности является воздействие непосредственно на эффекторные белки ССТТ, которых у P. aeruginosa к настоящему времени описано четыре. Такой подход направлен на снижение токсического воздействия на клетки хозяина, однако имеет ограничения в связи с тем, что не все эффекторы экспрессируются в каждом отдельном штамме.

Псевдолипазин А был первым ингибитором белка ExoU. Он получен в результате скрининга in silico. Псевдолипазин выступает в качестве специфического ингибитора активности фосфолипазы А2 белка ExoU P. aeruginosa, не влияя при этом на другие эукариотические фосфолипазы [55].

Арилсульфамиды также являются ингибиторами белка ExoU. Некоторые соединения этой группы арилсульфамидов значительно ингибировали цитотоксичность, опосредованную белком ExoU, при этом не вызывая неспецифической цитотоксичности [56].

При сравнении действия арилсульфонамидов и псевдолипазина А было показано, что активность арилсульфонамидов не превышала активности псевдолипазина А при ингибировании ExoU-опосредованной цитотоксичности. Действие этих соединений на животных к настоящему времени показано не было.

Семейство синтетических циклических пептид-пептоидных гибридных молекул (пептомеров) идентифицировали в экспериментальном скрининге ингибиторов ССТТ. Ингибиторы этого класса демонстрировали дозозависимое подавление секреции эффектора ExoU у P. aeruginosa, не влияя при этом на рост или подвижность бактерий. При изучении действия пептомеров на флагеллу ингибирующего эффекта отмечено не было. Действие пептомеров in vivo еще предстоит исследовать [57].

Ингибитор экзоцин был получен путем скрининга низкомолекулярных ингибиторов на клетках дрожжей, экспрессирующих ExoS P. aeruginosa. Экзоцин подавлял ферментативную активность АДФ-рибозилтрансферазы белка ExoS P. aeruginosa. Экзоцин действовал в качестве конкурентного ингибитора в отношении субстрата NAD⁺ белка ExoS. Было показано действие in vitro на клетках млекопитающих. Экзоцин защищал клетки СНО (chinese hamster ovary, клетки китайского хомячка) от лизиса, вызванного синегнойными бактериями. Данных по дальнейшему исследованию этого ингибитора найти не удалось [58].

Тиенопиримидиноны — относительно новый класс ингибиторов АДФ-рибозилтрансферазы белка ExoS. Ингибирование белка ExoS показано in vitro путем ферментативного анализа. Было разработано несколько соединений, которые блокировали АДФ-рибозилтрансферазную активность белка ExoS P. aeruginosa. Подробно действие тиенопиримидинонов в тестах in vitro и in vivo не описано [59].

Хопафенол замыкает класс ингибиторов, действующих на эффекторные белки ССТТ. Он был получен в результате скрининга библиотек природных соединений и относится к классу полифенолов, которые являются тетрамерами ресвератрола. Было показано, что хопафенол ингибировал ССТТ у Y. pseudotuberculosis: отмечалось подавление экспрессии и транслокации белка YopE, экспрессии и секреции транслокатора YopD и секреции белка YopH. У C. trachomatis хопафенол уменьшал проникновение в клетки и последующий внутриклеточный рост. При действии на P. aeruginosa хопафенол блокировал секрецию белка ExoS и снижал ССТТ-опосредованную цитотоксичность. Таким образом, было показано действие хопафенола in vitro на клетках млекопитающих, однако данных о действии in vivo пока нет [60].

Заключение

Ключевым фактором вирулентности псевдомонад является ССТТ, с помощью которой бактерия транспортирует эффекторные белки в клетку хозяина. Основное действие эффекторных белков направлено на подавление иммунного ответа: они ингибируют миграцию и фагоцитоз макрофагов и нейтрофилов, рекрутируемых к очагу инфекции, вызывают гибель иммунных клеток. Внутрибольничные инфекции, вызванные синегнойной палочкой, практически не поддаются стандартному антибактериальному лечению вследствие множественной устойчивости к антибиотикам у клинических штаммов. Очевидно, что для решения проблемы антибиотикорезистентности и повышения эффективности лечения необходимо выбирать новые мишени для разработки антибактериальных препаратов. Одной из перспективных мишеней в составе факторов вирулентности является ССТТ грамотрицательных бактерий в связи с ее крайне важной функцией в развитии инфекционного процесса.

Анализ литературы показывает, что в последние 20 лет в лабораториях всего мира активно проводились исследования в области разработки ингибиторов, действующих на ССТТ различных бактерий. К настоящему времени разработан целый ряд ингибиторов разной природы и с разными механизмами действия. Однако конкретные молекулярные мишени идентифицированы лишь для небольшого числа описанных соединений, а механизмы еще мало изучены. Среди описанных ингибиторов для основной массы соединений показано только действие in vitro. Действие на моделях in vivo было показано для гидроксихинолонов и гидразонов салицилового альдегида. Самыми перспективными ингибиторами на данный момент являются два соединения: фтортиазинон, относящийся к классу тиадиазинонов, и препарат на основе антител MEDI3902, для которого на данный момент завершены клинические исследования II фазы. Стоит отметить, что препараты на основе антител обладают низкой биодоступностью при пероральном введении и должны вводиться инъекционно, в отличие от низкомолекулярных ингибиторов, которые обладают более высокой пероральной биодоступностью и, соответственно, более привлекательны в качестве лекарственных препаратов. Описанные данные дают надежду на то, что новые препараты на основе ингибиторов ССТТ позволят решить существующую проблему лечения и могут применяться как в составе комплексной терапии, так и, возможно, при дальнейшем изучении, при монотерапии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.