Введение
Нестабильность генома патогенных бактерий продолжает оставаться одной из актуальных проблем молекулярной микробиологии и генетики, решение которой открывает новые возможности в расшифровке механизмов возникновения новых вариантов возбудителей в процессе эволюции. Одним из таких патогенов, претерпевших в ходе эволюции существенные генетические изменения, является возбудитель холеры Vibrio cholerae, вызывающий у человека развитие острого диарейного заболевания, приводящего при отсутствии своевременного лечения к обезвоживанию организма и быстрой смерти [1].
История семи пандемий холеры, охвативших многие страны Азии, Африки, Европы и Северной Америки, насчитывает более 200 лет. Возбудителем первых шести пандемий азиатской холеры, которые продолжались более 100 лет (1817—1923 гг.) и унесли миллионы человеческих жизней, был V. cholerae серогруппы O1 классического биовара [1—3]. Вследствие последующей смены биовара возбудителя этиологическим агентом текущей, седьмой, пандемии (с 1961 г. по настоящее время) стали токсигенные штаммы V. cholerae O1 биовара Эль Тор, отнесенные к пандемической линии 7РЕТ ( Seven Pandemic Vibrio cholerae O1 El Tor) [4]. Полногеномное секвенирование (WGS, whole—genome sequencing) показало, что в отличие от многих других патогенных бактерий в клетках возбудителей холеры обоих биоваров присутствуют две кольцевые хромосомы — большая, 2,96 млн пн (пар нуклеотидов), и малая, 1,07 млн пн, различающиеся по размеру и функциям [5]. Несмотря на такое сходство, классические и Эль Тор вибрионы, относящиеся к разным филогенетическим линиям (L1 и L2 соответственно) и имеющие, по-видимому, независимое друг от друга происхождение, проявляют выраженные молекулярно-генетические отличия [6].
Специфической особенностью большой хромосомы Эль Тор-возбудителя является присутствие в ее составе значительного количества разнообразных мобильных генетических элементов (МГЭ) с ключевыми генами, определяющими его патогенный, эпидемический и адаптивный потенциал [7—10]. МГЭ ответственны за непостоянство генома, обусловленное возникновением разного типа мутаций, в результате которых формируются различные генетические варианты с измененными свойствами [11, 12].
Изучению молекулярных механизмов изменений генома возбудителя холеры посвящены многочисленные работы [4, 8, 13—16]. Накопленные в последние годы новые данные об эволюции его генома, механизме формирования геновариантов возбудителя и их геномном разнообразии определяют необходимость обобщения имеющихся сведений. Более того, данные о генетических особенностях современных вариантов возбудителя представляют несомненный интерес для прогнозирования эпидемиологической ситуации по холере на основе данных об изменении его генетических свойств [17].
Мобильные генетические элементы возбудителя холеры Эль Тор и их роль в эволюции генома возбудителя холеры
Нитчатые фаги. Анализ геномов токсигенных штаммов V. cholerae Эль Тор позволил выявить в составе его обеих хромосом разнообразные мобильные элементы: профаги, острова патогенности, острова пандемичности, конъюгативный мобильный элемент, интегрон, приобретенные патогеном путем горизонтального переноса генов в процессе эволюции [8, 9] (рис. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_02_04_add.zip). Среди них наиболее важная роль в патогенности V. cholerae принадлежит нитчатому бактериофагу CTXφ, впервые идентифицированному в 1996 г. M.K. Waldor и J.J. Mekalanos [18]. Различные штаммы содержат одну или множество копий CTXφ, расположенных на большой, либо малой, либо на обеих хромосомах. Геном профага (6,9 тпн) имеет две функционально различные области — коровую и RS2 (Repeat Sequence). В коровую область включен оперон ctxAB, кодирующий холерный токсин (CT, Cholera Toxin), относящийся к ключевым факторам вирулентности, действие которого направлено на развитие профузной диареи — основного клинического симптома холеры [19, 20]. Поступающий в просвет кишечника CT — это белок (85,5 кД), состоящий из одной субъединицы A (27 кД) и пяти субъединиц B (11,6 кД каждая), различающихся между собой по структуре и функции. Субъединица A отвечает за токсическую активность всей молекулы. B-субъединичный комплекс нетоксичен. Его функция связана с транспортом токсина внутрь клетки через канал, образуемый субъединицами B, которые связываются с клеточным рецептором, роль которого выполняет ганглиозид GM1, находящийся на поверхности кишечного эпителия [1, 3]. Кроме того, в этом же участке ДНК расположены гены psh, cep, orfU(pIIICTX), ace и zot, кодирующие белки и участвующие в морфогенезе и секреции фага, а также в биосинтезе дополнительных токсинов или адгезинов. Область RS2 содержит три гена (rstA, rstB, rstR), ответственных за продукцию белков, необходимых для репликации ДНК (rstA), интеграцию генома CTXφ в бактериальную хромосому (rstB) и стабильность профага (rstR), поскольку rstR кодирует белок, являющийся репрессором транскрипции гена rstA, и, следовательно, отвечающий за лизогенное состояние холерных вибрионов [10, 20].
Интеграция CTXφ ДНК происходит в специфическом dif-сайте большой или малой хромосомы [21]. При этом интегрированный геном фага CTXφ в хромосоме, как правило, расположен в непосредственной близости от двух других нитчатых профагов — RS1φ (от repeat sequence) и TLCφ (от toxin-linked cryptic). Структура и функция профага RS1φ (2,7 тпн), включающего гены rstA, rstB, rstR, rstC и две межгенные области ig1 и ig2, весьма сходны с последовательностью RS2. Однако в отличие от нее в RS1φ присутствует дополнительный ген rstC, который, блокируя активность фагового репрессора rstR, способствует транскрипции генов профага CTXφ, необходимой для продукции свободных фаговых частиц [22, 23]. Другой профаг TLCφ (4,5 тпн) содержит гены cri и tlcR, кодирующие соответственно репликазу Cri, гомологичную белку репликации нитчатых фагов, и белок TlcR, обеспечивающий, предположительно, лизогенность профага CTXφ [24].
Между классическими и типичными штаммами Эль Тор-вибрионов существуют выраженные различия в структуре и функции профагов CTXφ, обозначенных как CTXφClassical и CTXφEl Tor соответственно. Прежде всего различия заключаются в разной нуклеотидной последовательности гена ctxB, кодирующего B-субъединицу CT. У классических вибрионов в позициях 115 и 203 присутствует цитозин (C), тогда как у вибрионов Эль Тор — тимин (T) [25]. Вследствие этого аллели гена ctxB у классических вибрионов обозначили как ctxB1, у вибрионов Эль Тор — ctxB3.
Различна также локализация CTXφ на хромосоме холерных вибрионов двух биоваров. Типичные токсигенные штаммы Эль Тор имеют от одной до нескольких копий профага CTXφ, расположенных, как правило, в тандемном порядке на большой хромосоме вблизи другого профага RS1φ [26, 27]. Такой порядок расположения двух профагов необходим для репликации CTXφ, так как в геноме RS1φ содержится ген rstC, кодирующий антирепрессор RstC, способствующий транскрипции вирусных генов CTXφ, обеспечивающих образование инфекционных фаговых частиц и секрецию их во внешнюю среду. Биологический смысл присутствия фага вирулентности во внешней среде — его диссеминация для инфицирования нетоксигенных холерных вибрионов и превращения их в токсигенные в результате фаговой конверсии. В геноме же большинства штаммов классического биовара присутствует две копии профага, локализованные на разных хромосомах. Более того, у них отсутствует профаг RS1φ [26]. Вследствие таких структурных особенностей генома классические вибрионы, в отличие от вибрионов Эль Тор, не способны образовывать зрелые фаговые частицы [28]. Таким образом, умеренные нитчатые фаги V. cholerae Эль Тор определяют не только патогенные свойства этого возбудителя, но и распространение ключевых генов вирулентности среди других штаммов.
Острова патогенности и пандемичности. В состав большой хромосомы V. cholerae Эль Тор входят также два острова патогенности (ОП) — VPI-1 (от Vibrio pathogenicity island) и VPI-2. VPI-1 (39,5 тпн), обнаруженный в 1998 г. [29], содержит структурные и регуляторные гены вирулентности: кластер генов tcpA-F, кодирующих продукцию токсин-корегулируемых пилей, или TCP (Toxin-Coregulated Pilus), обеспечивающих колонизацию тонкого кишечника вибрионами, кластер генов acf (от accessory colonization factor), контролирующих биосинтез дополнительного фактора колонизации, а также гены toxT, tcpP и tcpH, регулирующие экспрессию важнейших генов патогенности и входящие в генную сеть вирулентности [30—32].Основной субъединицей TCP, относящихся к IV типу, является белок TcpA (20 кД), кодируемый геном tcpA [33, 34]. Установлено, что TCP, как и CT, относится к ключевым факторам патогенности, поскольку заселение или колонизация тонкого кишечника — это первая и абсолютно необходимая стадия в развитии инфекционного процесса при холере. За счет TCP холерные вибрионы прикрепляются к микроворсинкам тонкого кишечника и, размножившись, начинают продуцировать CT. К тому же TCP являются рецептором для адсорбции фага CTXφ, что определяет возможность приобретения нетоксигенными вибрионами с генотипом tcpA+ генов CT в составе этого профага и их перехода в токсигенные [34, 35]. Кроме того, TCP относятся к протективным антигенам, определяющим формирование антиколонизирующего иммунитета в организме человека или экспериментальных животных [36].
Второй ОП VPI-2 (57,3 тпн), впервые обнаруженный в 2002 г. [37], содержит кластер генов, кодирующих систему рестрикции-модификации первого типа, которая защищает бактериальную клетку от вирусной инфекции, а также кластер генов nan-nag-области, включающий гены, кодирующие белки, участвующие в утилизации аминосахаров, а также ген nanH, кодирующий нейраминидазу, которая создает дополнительные рецепторы для CT на поверхности мембран энтероцитов хозяина, повышая тем самым вирулентность вибрионов [37, 38]. Таким образом, ОП VPI-1 и VPI-2 играют исключительно важную роль в патогенности возбудителя холеры.
Помимо двух ОП (VPI-1 и VPI-2) на большой хромосоме V. cholerae Эль Тор локализовано два геномных острова, не связанных непосредственно с вирулентностью, а кодирующих другие функции этого возбудителя, определяющие его способность к пандемическому распространению. Эти геномные области, уникальные для возбудителя холеры Эль Тор и отсутствующие у классических вибрионов, получили обозначение VSP-I (от: Vibrio seventh pandemic island) и VSP-II [6]. VSP-I (16 тпн) включает 11 ORF, кодирующие в основном белки с неизвестной функцией [6, 39]. Остров VSP-II (26,9 тпн) состоит из 30 ORF (vc0495-0512) и кодирует белки репарации и хемотаксиса, регуляторы транскрипции, а также белки с неизвестной функцией [6, 40]. Точный вклад этих белков в пандемический (эпидемический) потенциал вирулентных штаммов вибрионов Эль Тор, вытеснивших возбудителя азиатской холеры, пока неизвестен. Тем не менее высказано предположение, что VSP играют заметную роль в адаптации этого патогена к физическим и химическим стрессам, поскольку существует четкая связь между присутствием этих мобильных элементов в геноме возбудителя седьиой пандемии и его глобальном распространением в мире [6, 39].
Интегративный конъюгативный элемент. Помимо ключевых генов патогенности и пандемичности в состав МГЭ входят гены устойчивости к лекарственным препаратам, распространение которых среди клинических штаммов V. cholerae происходит с огромной скоростью. Исключительно важную роль в этом процессе играет интегративный конъюгативный элемент, или ICE (от integrative conjugating element), впервые обнаруженный в 1992 г. в штамме V. cholerae O139 серогруппы [41]. Впоследствии этот мобильный элемент был приобретен многими штаммами V. cholerae O1 серогруппы биовара Эль Тор через горизонтальный перенос от неизвестных доноров [42, 43]. Установлено, что ICE (99,5 тпн), внедренный в хромосому, имеет мозаичную структуру [44, 45]. В его состав входят консервативные последовательности (52 гена), кодирующие его внедрение в хромосому, вырезание и конъюгативный перенос, а также четыре вариабельных региона (VRI-IV от Variable Regions), включенных в межгенное пространство в пять сайтов, названных горячими точками интеграции [43, 45]. Среди последних безусловный интерес представляет VRIII, содержащий отдельный блок генов floR, strAB, sul2 и dfrA1, кодирующих устойчивость к хлорамфениколу, стрептомицину, сульфаметоксазолу и триметоприму, соответственно. Большинство встроенных в ICE генов резистентности (floR, strAB и sul2) находятся в участке размером 23 тпн, включенном в ген rumB. Этот участок, окруженный генами транспозаз, представляет собой сложную транспозоноподобную структуру, возможно, участвующую в появлении разных вариантов ICE в результате индуцированных геномных перестроек [45].
Сравнительно недавно стало известно, что ICE нестабилен и его структура быстро меняется в ходе эволюции возбудителя. В настоящее время известно более 30 его типов, из которых наиболее распространены среди клинических штаммов ICEVchInd5/ICEVchBan5 (floRstrABsul2dfrA1), ICEVchMoz10/ICEVchBan9 (floRtetARstrABsul2dfrA1), ICEVchBan11(floRtetARstrABsul2dfrA1). Основное различие между ними — разный набор генов резистентности к антибиотикам [43, 44]. Важнейшим последствием приобретения возбудителем разных типов ICE стало появление клинических штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, что создает трудности лечения инфекции [43, 46].
Таким образом, мобильные элементы возбудителя холеры с ключевыми генами патогенности, пандемичности и лекарственной устойчивости, приобретенные предковой формой посредством горизонтального переноса, составляют значительную долю его генома. Их разнообразие и распространенность среди различных штаммов определяют нестабильность генома этого патогена и возникновение различных геновариантов с ранее неизвестными свойствами.
Генетические варианты возбудителя седьмой пандемии холеры: механизм их возникновения и геномные особенности
Первичным очагом холеры Эль Тор и местом формирования генетических вариантов возбудителя является Индийский субконтинент, откуда впоследствии происходило ее распространение по всему миру тремя независимыми, но перекрывающимися волнами [4, 47]. Первая волна пандемии холеры (1961—1990 гг.) была вызвана типичными штаммами возбудителя, содержащими профаг CTXφEl Tor с аллелем ctxB3. Однако 2 и 3 волны были связаны с атипичными штаммами, или генетически измененными вариантами, имеющими другие аллели гена ctxB(ctxB1 или ctxB7) и возникшими в результате разных генетических событий: горизонтального переноса генетического материала, геномных перестроек и точечных мутаций [48].
Первые геноварианты, появившиеся в 1991—1994 гг. во время второй волны пандемии (1991—2001 гг.), сформировались в результате двух генетических событий — приобретения типичными штаммами Эль Тор от холерных классических вибрионов всего генома профага CTXφClassica , либо его гена ctxB1, а также получения от неизвестных доноров мобильного элемента ICE с генами лекарственной устойчивости (рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_02_07_add.zip) [42, 49]. Одна из возможных причин таких изменений возбудителя — отсутствие одного из механизмов защиты клетки от проникновения чужеродной ДНК, обеспечиваемых системой CRISPR-Cas (от: clastered regularly interspaced short palindromic repeats) [50]. Среди двух пандемических штаммов V. cholerae эту систему адаптивного иммунитета имели лишь холерные вибрионы классического биовара, тогда как токсигенные штаммы Эль Тор лишены ее [51].
Сопоставление полных геномов типичных и измененных штаммов возбудителя показало, что приобретение вибрионами Эль Тор участка ДНК классических вибрионов привело к замене аллеля ctxB3 на ctxB1, отличия между которыми обусловлены изменениями в нуклеотидной последовательности. У типичных вибрионов Эль Тор в позициях 115 и 203 присутствует тимин (T), у первых геновариантов — цитозин (C) (рис 3, a, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_02_07_add.zip). Изменение структуры одного из генов холерного токсина (ctxB) привело к повышению его продукции и усилению вирулентности геновариантов, что выразилось в развитии более тяжелых клинических форм холеры [52, 53]. Второе генетическое событие — увеличение генома возбудителя за счет включения в его состав разных вариантов мобильного элемента ICE с множественными генами лекарственной устойчивости, что привело к появлению клинических штаммов с разнообразным спектром резистентности к антибиотикам [45]. Более того, такие изменения геномов впервые возникших вариантов возбудителя стали, видимо, причиной повышения их эпидемического потенциала, что проявилось в повсеместном вытеснении ими типичных вибрионов Эль Тор [16, 54]. Таким образом, последствием генетических изменений возбудителя в период второй волны пандемии стало усиление патогенного и эпидемического потенциалов по сравнению с типичными штаммами, а также приобретение множественной резистентности к антибиотикам. Ключевой генетический маркер первых вариантов возбудителя — ген ctxB1, характерный для возбудителя предыдущих пандемий азиатской холеры V. cholerae классического биовара.
Вместе с тем геном вариантов, увеличенный за счет приобретения участков чужеродной ДНК, отличается нестабильностью. В коровой области хромосомы и мобильных элементах возникали различные мутации, что привело к появлению новых вариантов, вызвавших 3 волну пандемии. Прежде всего следует отметить принципиально важные изменения в ключевых генах вирулентности — ctxB и tcpA, ответственных за продукцию CT и колонизацию кишечника вибрионами. Дополнительная точечная мутация в гене ctxB1 (С58A) обусловила появление его нового аллеля, обозначенного как ctxB7 [53]. Другая точечная мутация затронула ген tcpA, кодирующий основной белок ведущего фактора колонизации токсин-корегулируемых пилей. В результате замены A266G появился новый аллель, обозначенный как tcpACIRS101 [55] (см. рис. 3, a, b). Следствием таких изменений стало более значительное усиление вирулентности современных вариантов, по сравнению с ранее возникшими, за счет 4—5-кратного повышения продукции CT, что привело к развитию тяжелых клинических форм холеры и росту летальности [52, 54]. Точный вклад мутаций, повлиявших на повышение вирулентности этих вариантов, пока еще недостаточно изучен. Помимо повышения продукции CT, для холерных вибрионов с измененной структурой белков TcpA и CtxB, кодируемых генами tcpACIRS101 и ctxB7, соответственно, характерной является более быстрая колонизация ими тонкого кишечника по сравнению с типичными штаммами [56].
Нестабильным оказался и геном острова пандемичности VSP-II, содержащий 30 открытых рамок считывания (vc0498-vc0517) и определяющий, видимо, высокий уровень адаптации вибрионов Эль Тор к условиям внешней среды. За счет делеции ряда его генов появились различные варианты VSP-II, обнаруженные в геномах измененных штаммов из разных эндемичных регионов [39]. Среди них особого внимания заслуживает VSP-II, обозначенный нами как VSP-IIΔ, имеющий протяженную делецию. Такая перестройка генома отразилась на эпидемическом потенциале штаммов (см. рис. 3, g). Делеция VSP-II, охватившая его центральную область размером 13 105 пн, включающую 21 ген (Δvc0495 — vc0512), — характерный генетический маркер новых вариантов с высоким эпидемическим потенциалом, отличающий их от геновариантов, которые были обнаружены в более ранний период [39, 57, 58]. Отсутствие в геноме VSP-IIΔ многих генов, возможно, обусловлено невостребованностью их продуктов при адаптации возбудителя к окружающей среде. Вместе с тем нельзя исключить и другое предположение, состоящее в том, что утрата одних генов может привести к повышенной экспрессии сохранившихся генов, продукты которых важны для адаптации возбудителя к различным условиям существования. Однако точные причины селективного преимущества новых вариантов с дефектным VSP-II остаются пока невыясненными.
Помимо изменения ключевых генов вирулентности и эпидемичности, входящих в состав мобильных элементов, у новых вариантов обнаружили мутации и в коровых генах. Одна из них появилась в гене rtxA1, кодирующем цитотоксин MARTX. Нуклеотидная замена G13602A в возникшем аллельном варианте rtxA4 привела к образованию стоп-кодона и утрате биосинтеза цитотоксина (см. рис. 3, c) [59]. Однако изменения этого гена не завершились, и в последние годы были выявлены штаммы с новым аллелем rtxA4а, несущим в проксимальной области гена rtxA4 делецию размером 60 пн (см. рис. 3, c) [60].
Другими значимыми изменениями были точечные мутации в генах gyrA (G248T) и parC (С254T), кодирующих топоизомеразу II (ДНК-гиразу) и топоизомеразу IV, которые привели к устойчивости штаммов к налидиксовой кислоте (см. рис. 3, d, e) [61]. Кроме того, еще одно важное изменение у ряда штаммов новых вариантов — возникновение мутации в регуляторном гене carR (G265A), которая привела к биосинтезу мутантного белка CarR с пониженной транскрипционной активностью в отношении оперона almEFG, принимающего участие в модификации липида A (см. рис. 3, f) Следствием этого процесса явилась утрата устойчивости к полимиксину B — одному из диагностических маркеров вибрионов биовара Эль Тор [62].
К тому же у новых вариантов были обнаружены и другие мутации. Так, у штаммов с повышенной вирулентностью, изолированных во время вспышки холеры в Бангладеш в 2022 г., были идентифицированы многочисленные мутации в регуляторных генах, контролирующих экспрессию ключевых факторов вирулентности (CT и TCP), а также в генах, продукты которых обеспечивают выживаемость холерных вибрионов в кишечнике человека и резистентность к бактериофагам [63, 64].
Таким образом, механизм формирования первых вариантов возбудителя, возникших в период второй волны пандемии, и новых вариантов, вызвавших третью волну пандемии, был разный. Начальный этап формирования первых вариантов — приобретение типичными штаммами нового генетического материала: ctxB1 из профага CTXφClassical и разных типов мобильного элемента ICE. Последующие значимые этапы эволюции были связаны с изменением генома уже возникших атипичных штаммов за счет мутаций разного типа как в мобильных элементах, так и в генах коровой области. Биологическим последствием таких изменений стало более значительное усиление патогенного и эпидемического потенциала современных вариантов по сравнению с ранее возникшими, появление штаммов с новым спектром резистентности к антибиотикам и утрата PolS — одного из диагностически значимых признаков вибрионов Эль Тор. Эти геномные изменения обеспечили селективные преимущества новым вариантам в условиях постоянного эволюционного отбора, что привело к вытеснению ими ранее возникших вариантов на территории эндемичных стран и их быстрому распространению в эндемичных очагах холеры. Недавно проведенное исследование показало огромную роль холерного токсина в фекально-оральной трансмиссии современных вариантов. Вызывая тяжелые диареи, гипервирулентные варианты более эффективно распространяются во внешней среде по сравнению с холерными вибрионами с более низким уровнем продукции этого белка [56]. Основной генетический маркер новых гипервирулентных вариантов — ген ctxB7.
Геномное разнообразие токсигенных штаммов V. cholerae O1 Эль Тор в современный период пандемии
Нестабильность генома возбудителя холеры привела к появлению эпидемически опасных штаммов с разным сочетанием измененных генов, кодирующих белки, и обеспечивающие их вирулентность, способность к эпидемическому распространению, резистентность к антимикробным препаратам, защиту от иммунитета хозяина. Для оценки геномного разнообразия возбудителя мы сопоставили геномы 240 токсигенных штаммов, изолированных в 17 странах Азии и Африки, а также в России в 1991—2024 гг. Прежде всего был проведен сравнительный анализ секвенированных участков геномов, содержащих мобильные элементы CTXφ, VPI-1 и VSP-II с ключевыми генами патогенности (ctxAB, tcpA) и эпидемичности (vc0498-vc0517), поскольку их вариабельность вносит существенный вклад в генетическую пластичность возбудителя. Как и ожидалось, штаммы из эндемичных регионов (изучены геномы 200 изолятов) были генетически неоднородны. Среди них, циркулировавших во вторую волну пандемии, только 20,0% имели генотип ctxB3tcpAEl Tor, характерный для типичных штаммов из более раннего периода (1970—1990 гг.). Вместе с тем значительная часть штаммов (80,0%) составляла группу вариантов возбудителя, включающую штаммы с тремя различными генотипами: ctxB1tcpAEl TorrtxA1ICEVchInd5, ctxB1tcpAEl TorrtxA1ICEVchBan9/Moz10 и ctxB1tcpAEl TorrtxA1ICEVchBan11 (рис. 4, a, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_02_08_add.zip). Геномы этих штаммов отличались от типичных присутствием чужеродных участков ДНК (ctxB1 в составе профага CTXφ и ICE).
Однако в последние два десятилетия (третья волна пандемии) уровень геномного разнообразия вариантов и механизмы их возникновения заметно изменились. Наряду со штаммами, характерными для второй волны (8,5%), были выявлены изоляты восьми новых генотипов (91,5%), различающихся разным набором однонуклеотидных замен в генах патогенности и антибиотикорезистентности и/или типами ICE (см. рис. 4, b). Это означает, что геномное разнообразие эпидемически опасных вариантов возбудителя холеры значительно возросло в последние десятилетия, что является следствием различных мутаций в коровых генах и генах мобильных элементов, продукты которых обеспечивают повышенный уровень патогенности, эпидемичности и устойчивости к антибиотикам. Следует отдельно отметить исключительно большой вклад в вариабельность генома мобильного элемента ICE, разные типы которого имели отличающийся набор генов лекарственной устойчивости. Наиболее распространенным был ICEVchInd5(floRstrABsul2dfrA1), кодирующий резистентность к хлорамфениколу, стрептомицину, сульфаниламиду и триметоприму, а также появившийся позднее ICEVchInd5ΔVRIII (или ICEVchInd5Δ) с делецией размером около 10 тпн, включившей четыре гена (floR, strA, strB, sul2) из вариабельной области VRIII при сохранении лишь dfrA1. Кроме того, были выявлены штаммы с ICE, обозначенным как SXTTET(tetARstrABsul2dfrA1)и несущим гены tetAR, определяющие устойчивость к тетрациклину, широко применявшемуся в ряде стран при лечении холеры. Широкое распространение штаммов с множественной лекарственной устойчивостью привело к значительному повышению показателей заболеваемости и смертности при холере. Среди новых вариантов также были обнаружены штаммы с мутацией в регуляторном гене carR, что привело к утрате ими PolR — диагностического признака вибрионов Эль Тор (см. рис. 4, b). Наиболее распространенными в последнее десятилетие стали гипертоксигенные варианты с последовательно накопленными мутациями в генах патогенности, эпидемичности и лекарственной устойчивости.
В то же время, несмотря на явное доминирование новых вариантов во многих эндемичных регионах, на территории ряда стран (Мозамбик, 2004—2005 гг., 2010 г.) продолжали циркулировать популяции холерных вибрионов с генотипами ctxB1tcpAEl TorVSP-II ICEVchInd5 и ctxB1tcpAEl TorVSP-II ICEVchBan9/Moz10), характерными для первых вариантов.
Что касается вариантов, выделенных в России в период второй и третьей волн пандемии, то их геномы (исследовано 40 штаммов) были также разнообразны. Частота встречаемости штаммов, относящихся к разным геногруппам, варьировала в зависимости от волны пандемии. Среди изученных изолятов из второй волны пандемии (1993—2001 гг.) 76,5% принадлежали к генотипам ctxB1tcpAEl TorVSP-II ICEVchInd5 и ctxB1tcpAEl TorVSP-II ICEVchBan9 или ctxB1tcpAEl TorVSP-II ICEVchBan11. В последующую, третью волну пандемии в 2004—2023 гг., варианты были представлены пятью генетическими группами, различающимися измененными генами патогенности, эпидемичности и резистентности к антибиотикам. Особый интерес представляли штаммы с генотипами ctxB7tcpACIRS101rtxA4gyrA(G248T)parC(С254T)VSP-II(Δvc0495-vc0512)ICEVchInd5 и ctxB7tcpACIRS101rtxA4gyrA(G248T)parC(С254T)carA(C254T)VSP-II(Δvc0495-vc0512)ICEVchInd5, отличительная особенность которых состояла в появлении в их геномах измененного гена ctxB7 — генетического маркера высоковирулентных штаммов. При этом в 21,0% случаев штаммы содержали дополнительную мутацию в гене carA, которая привела к потере ими PolR — диагностического маркера вибрионов Эль Тор.
Таким образом, приведенные данные свидетельствует о большом геномном разнообразии циркулирующих популяций возбудителя в эндемичных регионах, где на протяжении двух последних волн пандемии происходило довольно быстрое изменение его генома. При этом уровень геномного разнообразия в последние два десятилетия стал существенно выше по сравнению с таковым в 1991—2001 гг. К имеющим глобальное распространение в последние годы следует отнести варианты, сочетающие мутации в генах патогенности, эпидемичности и лекарственной устойчивости, что привело к усилению вирулентности патогена, изменению его резистентности к антибиотикам и утрате диагностически значимого свойства. Возросшая гетерогенность популяции генетически измененного возбудителя является, видимо, ключевым фактором, повышающим адаптацию патогена к меняющимся условиям среды обитания, а также обеспечивающим сохранение и широкое распространение патогена.
Филогенетический анализ различных вариантов возбудителя холеры из эндемичных регионов и России, выделенных в разные временные периоды текущей пандемии
Для выяснения генетических связей различных вариантов возбудителя между собой был проведен филогенетический анализ полногеномных последовательностей 121 штамма. На дендрограмме, построенной на основании анализа 1950 коровых SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), показано распределение штаммов в три основных кластера, которое четко совпадало с временным периодом трех волн пандемии (рис. 5, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_02_09_add.zip). Типичные штаммы A155 и N16961 (референсный штамм, 1965 г., Бангладеш) с генотипом ctxB3tcpAEltorVSP-II образовали отдельный кластер I. Эти изоляты были чувствительны к налидиксовой кислоте (NalS), резистентны к полимиксину B (PolR) и не содержали в геноме ICE. Кластер II включал штаммы из России, а также штаммы из эндемичных стран, изолированные в период второй волны пандемии (1991—2001 гг.). Обособление этих штаммов от изолятов из кластера I четко коррелировало с приобретением ими новых участков ДНК — гена ctxB1 (в составе профага CTXφ) и разных типов мобильного элемента ICE (ICEVchInd5, ICEVchBan9). В результате эти первые варианты возбудителя имели генотип ctxB1tcpAEltorVSP-II ICE, отличный от такового референсного штамма N16961. Различия между штаммами из кластеров I, II и референсным N16961 составляли в среднем 86 и 128 SNPs соответственно. Что касается других исследуемых штаммов, выделенных как в России, так и в эндемичных регионах Азии и Африки, то все они относились к геновариантам из третьей волны пандемии (2002—2024 гг.), которые образовали кластер III, различаясь от референсного штамма по 162 SNPs (см. рис. 5). Обособление этого кластера было связано с формированием генома холерных вибрионов с усиленной патогенностью и способностью к глобальному распространению. Эти варианты отличались от измененных штаммов второй волны разного типа дополнительными мутациями — однонуклеотидными заменами в ключевых (ctxA, tcpA) и дополнительных (rtxA) генах патогенности и лекарственной устойчивости (gyrA, parC, carA), делецией генов в VSP-II и разными типами ICE, включая ICEVchInd5Δ, утративший в результате делеции четыре гена, кодирующих устойчивость к хлорамфениколу (floR) стрептомицину (strAB), сульфаниламиду (sul2). Вследствие различного сочетания мутаций штаммы кластера III были генетически неоднородны, образовав восемь отдельных ветвей с разными генотипами:
“a” ctxB1tcpAEltorgyrA(G248T)parC(C254T)VSP-IIΔICEVchInd5;
“b” ctxB1tcpACIRS101gyrA(G248T)parC(C254T)VSP-IIΔSXTTET;
“c” ctxB1tcpACIRS101rtxA4 gyrA(G248T)parC(C254T)VSP-IIΔICEVchInd5;
“d” ctxB7tcpACIRS101rtxA4gyrA(G248T)parC(C254T)VSP-IIΔICEVchInd5/Ind5*;
“e” ctxB7tcpACIRS101rtxA4gyrA(G248T)parC(C254T)carR(G265A)VSP-IIΔICEVchInd5;
“f” ctxB7tcpACIRS101rtxA4gyrA(G248T)parC(C254T)carR(G265A)VSP-IIΔICEVchInd5Δ;
“g” ctxB7tcpACIRS101rtxA4gyrA(G248T)parC(C254T)carR(G265A)VSP-IIΔICEVchInd5;
“h” ctxB7tcpACIRS101rtxA4-а gyrA(G248T)parC(C254T)carR(G265A)VSP-IIΔICEVchInd5Δ (см. рис. 5).
Несмотря на генетическое разнообразие, все измененные штаммы принадлежали к одной пандемической линии 7РЕТ. Это означает, что настоящая пандемия холеры вызвана многочисленными вариантами, возникшими от общего предшественника — типичного штамма V. cholerae биовара Эль Тор.
Таким образом, показано, что деление исследуемых штаммов на три кластера, различающихся между собой по структуре геномов, совпадало с временным периодом трех волн пандемии. Присутствие в каждом кластере эпидемически опасных штаммов как из России, так и из эндемичных стран, указывает на их генетическую близость и подтверждает их занос на территорию РФ. Штаммы кластера III, изолированные на протяжении третьей волны пандемии в последние 20 лет (2002—2024 гг.), отличаются более высоким уровнем разнообразия генотипов, обусловленным последовательным накоплением различных мутаций в генах, входящих в состав как мобильных элементов, так и коровой части хромосом. Преобладающими среди них в последние годы стали штаммы, сочетающие ранее неизвестные мутации в генах патогенности и лекарственной устойчивости: ctxB7tcpACIRS101rtxA4gyrA(G248T)parC(C254T)carR(G265A)VSP-IIΔICEVchInd5 и
ctxB7tcpACIRS101rtxA4-а gyrA(G248T)parC(C254T)carR(G265A)VSP-IIΔICEVchInd5Δ.
Заключение
Выраженная нестабильность генома возбудителя холеры Эль Тор, обусловленная присутствием разнообразных мобильных элементов, привела к формированию различных генетических вариантов с ранее неизвестными свойствами, о которых впервые стало известно через 30 лет после начала седьмой пандемии, вызванной токсигенными штаммами пандемической линии 7 PET. Одно из важных событий в эволюции возбудителя холеры Эль Тор — приобретение новых участков ДНК (мобильного элемента ICE, содержащего гены резистентности к антибиотикам, и классического профага CTXφ либо только гена ctxB1, входящего в его состав), что привело к возникновению первых геновариантов с новыми свойствами. Повышение вирулентности и приобретение множественной лекарственной устойчивости обеспечило им селективные преимущества, следствием которых стало вытеснение ими типичных штаммов в эндемичных по холере регионах. Включение чужеродных участков ДНК, многие из которых обладали свойствами МГЭ, в геном типичных штаммов V. cholerae Эль Тор определяло нестабильность и других хромосомных регионов, связанных с патогенностью. В результате в разных генах накапливались мутации, приводящие к изменению важнейших биологических свойств позбудителя — патогенности, устойчивости к антибиотикам и адаптации к стрессовым воздействиям окружающей среды.
Появление в геноме современных вариантов новых аллелей ключевых генов патогенности (ctxB7 и tcpACIRS101) привело к еще большему усилению их вирулентности, что обусловило тяжелые клинические формы заболевания и высокую смертность. Высокая скорость их распространения во многих странах мира свидетельствует о селективном преимуществе этих штаммов. Согласно недавним исследованиям, ключевая роль в глобальном распространении высоковирулентных вариантов принадлежит CT, который, вызывая развитие тяжелых диарей, обеспечивает эффективную фекально-оральную трансмиссию патогена.
Механизм совокупного влияния накопленных мутаций у современных вариантов на их патогенный и эпидемический потенциал пока недостаточно изучен. Имеющиеся сведения позволяют предположить, что включение в хромосому вариантов нового участка ДНК с генами CT и последующие мутации в генах патогенности повлияли не только на вирулентность, но и на другие процессы в клетке, — метаболизм и энергетический обмен, транспорт различных веществ, защита клеток от стрессовых воздействий окружающей среды [56, 65, 66]. Индукция или репрессия кодируемых этими генами белков могла быть следствием изменения активности глобальных регуляторов, входящих в состав связанных между собой генных сетей возбудителя, контролирующих как координированную регуляцию экспрессии генов патогенности, так и адаптацию патогена к условиям внешней среды [67—69].
Вопрос о том, какой из вновь сформированных вариантов будет доминирующим в ближайшее время, остается открытым. Достаточно быстрые преобразования генома возбудителя холеры Эль Тор являются, видимо, одним из основных механизмов реализации стратегии его выживания как в организме хозяина, так и в окружающей среде.
Широкое распространение полногеномного секвенирования с последующим анализом ДНК дало возможность проследить эволюцию возбудителя холеры. Однако многие вопросы, связанные с пониманием роли свойств у выявляемых вариантов возбудителя в эпидемическом процессе, остаются нерешенными. В этой связи представляется возможным выделить ряд приоритетных направлений дальнейших фундаментальных и прикладных исследований возбудителя холеры:
—изучение взаимодействий белков высоковирулентных вариантов возбудителя и клеточных белков хозяина с использованием мультимиксных технологий для понимания молекулярных основ патогенеза;
—исследование генных сетей регуляции экспрессии генов вирулентности различных вариантов возбудителя в организме человека на протеомном и транскриптомном уровне;
—анализ молекулярных механизмов адаптации и персистенции современных вариантов в окружающей среде на основе сравнения их транскрипционного и протеомного профиля при различных воздействиях в водных биоценозах для выяснения роли разных мутаций в глобальном распространении генетически измененных штаммов;
—получение новых сведений о геномном разнообразии возбудителя холеры в России и эндемичных по холере регионах с последующим созданием баз данных с молекулярно-генетическими свойствами различных штаммов;
—создание новых вакцинных препаратов методом редактирования генома CRISPR/Cas современных высоковирулентных вариантов возбудителя с измененными иммуногенными свойствами;
—изучение закономерности и направления современной эволюции возбудителя для прогнозирования возникновения других вариантов с ранее неизвестными свойствами при использовании мультимиксных и биоинформатических технологий;
—проведение постоянного геномного эпиднадзора за возбудителем холеры с целью выявления генетических изменений патогена для оперативного и адекватного реагирования на эпидемические осложнения по холере в России.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.