Введение

Эпилепсия — это хроническое гетерогенное неврологическое заболевание [1, 2]. Современное определение эпилепсии включает в себя два неиндуицированных (или рефлективных) эпилептических приступа с интервалом не менее 24 ч [1, 3]. Чрезвычайно высокая распространенность эпилепсии (каждый год она поражает более 70 млн человек и приводит к смерти 125 000 из них) делает данное заболевание одной из важнейших проблем современной неврологии [4].

При эпилепсии часто наблюдаются коморбидные заболевания, такие как когнитивные, депрессивные расстройства и ожирение [1, 5, 6]. В настоящее время активно изучается этиопатогенез ожирения у детей с эпилепсией [1]. Одним из факторов повышения веса при эпилептических синдромах является прием вальпроатов. В ряде исследований показано, что вальпроат натрия может вызывать ожирение, часто в сочетании с синдромом поликистозных яичников [7—9]. Но ожирение при эпилепсии может быть связано не только с применением антиконвульсантов, но и с определенными метаболическими и молекулярно-генетическими особенностями пациентов. Поэтому важно изучение взаимосвязи эпилептических синдромов и ожирения [1].

Исследования корреляции между ожирением и эпилепсией у детей достаточно противоречивы [1]. Так, K. Zhou и соавт. провели рандомизированный анализ сцепления ожирения и эпилепсии и показали их взаимосвязь [10]. Ряд исследований показывает, что у пациентов с эпилепсией возрастает риск ожирения [11—13]. Но есть ряд работ, где корреляции между ожирением и эпилепсией не выявляется [1, 14, 15]. Исследование M. Pfeifer даже выявило положительную корреляцию между недостаточным весом и риском возникновения эпилептических синдромов [16]. Есть исследователи, которые в своих работах выявили, что уровень ожирения среди больных эпилепсией аналогичен уровню избыточного веса в общей популяции [17—19]. В одном из последних метаанализов, выполненном на 17 клинических исследованиях, в которых участвовали 5329 пациентов с эпилепсией и 480 837 здоровых лиц (эти исследования были отобраны из пула из 1497 статей), показано, что существует статистически значимое различие распространенности ожирения между пациентами с эпилепсией и группой здоровых лиц (OR=1,28, 95% CI: 1,20—1,38, p<0,01) [20].

Следует отметить, что эпилепсия являет собой группу генетически гетерогенных состояний, которые представлены в современной классификации определенными эпилептическими синдромами [21]. Ряд эпилептических синдромов является вторичным проявлениям определенных моногенных нарушений обмена [22]. Для таких вариантов эпилепсии даже есть термин «метаболическая эпилепсия» [23]. Но есть синдромы, для которых не установлена четкая взаимосвязь между определенным метаболическим дефектом, что может говорить об их мультифакториальной природе, который также может иметь в основе своего этиопатогенеза метаболическую компоненту. В частности, для эпилепсии на фоне ожирения это могут быть определенные митохондриальные нарушения обмена [24]. В настоящее время описана группа митохондриальных заболеваний, при которых эпилептические приступы являются ведущим синдромом, например синдром MELAS [25]. Но в целом особенности митохондриальной дисфункции при мультифакториальных эпилептических синдромах изучены недостаточно. Вместе с тем рядом исследований показана непосредственная связь дисфункции митохондрий с ожирением и метаболическим синдромом [26]. Возникающее системное воспаление при ожирении может вызвать продукцию активных форм кислорода, окислительный стресс и митохондриальные нарушения, причем эти изменения могут происходить как в периферических тканях, так и в коре ЦНС, гипоталамусе и гиппокампе, а также нарушать гематоэнцефалический барьер [27]. Таким образом, может повышаться судорожная готовность корковых нейронов, что приводит к развитию эпилептических приступов. Показана роль ряда интерлейкинов, например IL-25, в стимуляции митохондриального дыхания за счет поляризации макрофагов M2, что приводит к усилению липолиза и снижению риска ожирения [28]. Также на роль митохондриальной дисфункции в развитии ожирения указывает то, что при развитии щитовидной железы часто развивается избыточный вес за счет формирования резистентности к ее гормонам [29]. С другой стороны, известно, что ряд антиконвульсантов может вызывать дисфункцию щитовидной железы [30, 31]. Таким образом, будет интересно изучить роль митохондриальной дисфункции в качестве диагностического маркера коморбидности эпилепсии и ожирения.

Следует отметить, что на взаимосвязь ожирения и ряда эпилептических синдромов указывают новые исследования о положительном эффекте кетогенной диеты при лечении пациентов детского возраста с эпилепсией. В частности, предварительные результаты показывают эффективность такой диеты при синдроме Веста, тяжелой миоклонической эпилепсии младенчества, миоклоническо-астатической эпилепсии, а также при фармакорезистентной идиопатической генерализованной эпилепсии [32]. Также положительный эффект установлен при фармакорезистентных эпилептических синдромах, ассоциированных с дефицитом транспортера глюкозы 1-го типа и недостаточностью пируватдегидрогеназы [33]. Положительный эффект кетогенной диеты связан с тем, что кетоновые тела легко проникают через гематоэнцефалический барьер и обеспечивают стабильный источник энергии для нейронов [33]. Также они регулируют активность ионных каналов (например, калиевых и кальциевых), снижая возбудимость нейронов, а также увеличивают синтез тормозного медиатора — гамма-аминомасляной кислоты.

Резюмируя все вышесказанное, можно отметить, что разработка персонализированных подходов диагностики эпилепсии у детей на фоне ожирения с использованием методов биохимической диагностики чрезвычайно важна с точки зрения как установления особенностей этиопатогенеза данного патологического состояния, так и разработки оптимальной и эффективной терапии.

Цель работы — разработать подход к персонализированной биохимической диагностике эпилепсии у детей на основе потенциального изменения профиля органических кислот в моче.

Материалы и методы

В исследование были включены 22 пациента в возрасте от 1 года до 16 лет (средний — 11,7 года). По половому составу было 15 девочек и 7 мальчиков. Пациенты были отобраны в психоневрологическом отделении №1 НПЦ специализированной медицинской помощи детям им. В.Ф. Войно-Ясенецкого ДЗМ. Распределение пациентов по клиническим диагнозам представлено в табл. 1.

Таблица 1. Распределение по клиническим диагнозам пациентов исследуемой выборки и группы сравнения

Таким образом, в подгруппу пациентов с различными эпилептическими синдромами и сопутствующим конституционально-экзогенным ожирением входили 16 пациентов в возрасте от 1 года до 17 лет (средний — 10,2 года). В группу сравнения вошли 3 пациента с морбидным ожирением и метаболическим синдромом без признаков эпилептической активности и 3 — с экзогенно-конституциональным ожирением, также без признаков эпилепсии. С родителей или законных представителей всех пациентов бралось информированное согласие на исследование. Всем детям производился забор утренней порции мочи в стерильный контейнер на исследование профиля органических кислот методом ВЭЖХ-МС/МС. До исследования моча хранилась при температуре –70 °C.

Методика определения органических кислот в моче

Количественное определение органических кислот в моче проводилось в два этапа. Анализ кетокислот (ацетоуксусной, 3-гидроксимасляной) включал в себя: разведение мочи деионизированной водой в соотношении 50:50 и последующую дериватизацию: добавление 50 мкл буфера (смесь метилгидроксиламина гидрохлорида и пиридина в соотношении 2:8 в метаноле). Для определения остальных органических кислот образцы мочи разводились деионизированной водой в соотношении 50:50 и далее без дериватизации вводились в хроматографическую систему. Измерение содержания органических кислот и их производных проводили с использованием ВЭЖХ-МС/МС системы с хроматографом Waters Acquity Premier, оборудованной масс-спектрометром Sciex Qtrap 5500, с предварительным разделением на хроматографической колонке с сорбентом с обратной фазой Phenomenex silica core с размером частиц сорбента 2,6 мкм, 100A, C18 Kinetex (50×2,10 мм) («Phenomenex», США). Референтные интервалы для каждого из показателей были рассчитаны «косвенным» ретроспективным методом набора референтной контрольной выборки, которая состояла из 443 практически здоровых детей разных возрастных групп [34].

Для сравнения среднего значения концентрации определенной органической кислоты в группе исследованных пациентов с группой сравнения рассчитывался t-критерий Стьюдента для несвязанных совокупностей с границей значимости p=0,05. Для расчета t-критерия рассчитывались средние арифметические значения M1 и M2 концентрации в моче определенной органической кислоты для исследуемой и контрольной групп соответственно, вычислялись средние арифметические этих значений m1 и m2 и на основании этого в статистической программе рассчитывались значения t-критерия Стьюдента. Если граница значимости была ниже выбранного критического 0,05, разница между значением концентрации данной органической кислоты между группами пациентов и сравнения признавалась достоверной, в противном случае различия были случайными, статистически незначимыми. Для анализа различий всей совокупности концентраций определенной органической кислоты в группе детей с эпилепсией на фоне ожирения и в группе сравнения использовался непараметрический U-критерий Манна—Уитни, также с границей значимости p=0,05. Для этого в программе автоматически рассчитывалось значение U-критерия по формуле U=(n1*n2)+(n+1)/2–R, где вместо n1 — количество значений концентраций определенной органической кислоты в исследуемой группе (16), n2 — количество значений концентраций определенной органической кислоты в группе сравнения (6), n — количество элементов в группе с наибольшей суммой рангов, R — большая по величине сумма рангов. Также рассчитывались медианные значения концентраций каждой из органических кислот, дисперсия значений и стандартное отклонение как в группе пациентов, так и в группе сравнения. Для оценки различий между показателями концентрации органических кислот разных возрастных групп детей использовался непараметрический метод сравнения множества независимых групп — метод Краскела—Уоллиса, являющийся непараметрической альтернативой одномерному (дисперсионному) анализу. Статистические расчеты были выполнены в программе Statistica 10,0 («StatSoft Inc.», США), Excel’2007 («MicroSoft Corp.», США).

Результаты и обсуждение

В табл. 2 представлены средние значения органических кислот в моче, которые различались в группе больных и группе сравнения.

Таблица 2. Средние значения и разброс значений органических кислот в моче в группе пациентов и группе сравнения

Основные отклонения в профиле органических кислот в моче у пациентов с различными эпилептическими синдромами на фоне ожирения были выявлены в следующих метаболических показателях (у 11 пациентов из 16):

1) маркеры цикла Кребса;

2) маркеры митохондриальной дисфункции;

3) маркеры детоксикации;

4) маркеры бактериального дисбиоза.

Общее количество отклонений по определенным метаболическим маркерам у 11 пациентов с эпилепсией на фоне ожирения показано на рис. 1.

Рис. 1. Общее количество отклонений по метаболическим маркерам у пациентов с различными эпилептическими синдромами на фоне ожирения.

Также у данных пациентов было выявлено отклонение уровня молочной кислоты за пределы референтных интервалов (рис. 2). В группе сравнения (пациенты с метаболическим синдромом без признаков эпилептической активности и пациенты с нормальным индексом массы тела и эпилепсией) также наблюдался выход уровня молочной кислоты в моче за референтный интервал, но только по нижней границе. Статистический анализ средних значений данного параметра по t-критерию Стьюдента между выборкой пациентов и группой сравнения показал значимые различия (p=0,021). Анализ всей совокупности значений концентраций молочной кислоты в группе пациентов и группе сравнения по критерию Манна—Уитни также показал значимые различия (p=0,019). Также выявлено более высокое среднее и медианное значение уровня молочной кислоты в исследуемой выборке детей, по сравнению с контрольной группой (табл. 3). Таким образом, в группе детей с эпилепсией на фоне ожирения наблюдаются существенные метаболические нарушения.

Рис. 2. График уровня молочной кислоты у пациентов детского возраста с эпилепсией на фоне ожирения.

Таблица 3. Средние и медианные значения уровня молочной кислоты в группе детей с эпилепсией на фоне ожирения и в группе сравнения

У большинства детей с эпилепсией на фоне ожирения и детей группы сравнения отмечено повышение уровня 4-метил-2-оксовалериановой кислоты, что может быть связано с вторичным нарушением обмена аминокислот у таких больных (табл. 4). Статистический анализ среднего значения данного метаболического маркера по t-критерию Стьюдента не выявил достоверных отличий между группой детей с эпилепсией на фоне ожирения и группой сравнения (p=0,108), так же как не обнаружено достоверных различий между всей совокупностью значений данного параметра по критерию Манна—Уитни (p=0,207), хотя известно, что ряд моногенных нарушений обмена аминокислот может проявляться различными эпилептическими синдромами [35]. Поэтому данный вопрос требует дальнейшего исследования.

Таблица 4. Средние и медианные значения уровня 4-метил-2-оксовалериановой кислоты в группе детей с эпилепсией на фоне ожирения и в группе сравнения

Интересно отметить, что у ряда пациентов с эпилепсией на фоне ожирения выявлены отклонения в уровне метаболических маркеров бактериального дисбиоза (пара-гидроксифенилуксусной кислоты, бензойной кислоты и гиппуровой кислоты). В последнее время вопрос ассоциации между дисбиозом и эпилептическими синдромами у детей начал активно изучаться [36]. Пилотные исследования пока указывают на то, что изменение микрофлоры кишечника у детей с эпилепсией является вторичным, что подтверждается положительным эффектом на течение данного заболевания кетогенной диеты [37]. Также некоторые исследования показывают ассоциацию между изменением микробиоты кишечника и фармакорезистентностью эпилепсии [38, 39]. Но роль в этиопатогенезе эпилепсии на фоне ожирения дисбиоза ЖКТ и его влияние на коморбидные взаимоотношения данных патологических состояний требуют более глубокого изучения.

У 3 пациентов с эпилепсией на фоне ожирения выявлено повышение уровня фумаровой кислоты, которая является метаболическим маркером цикла Кребса. Сравнительный анализ среднего значения данного параметра по t-критерию Стьюдента в группе больных эпилепсией с ожирением (0,94±0,24 ммоль/моль креатинина) относительно группы сравнения (0,27±0,22 ммоль/моль креатинина) не выявил статистически достоверного отличия (p=0,085), хотя в настоящее время описана тяжелая моногенная патология, связанная с частичным дефицитом фермента цикла Кребса фумаразы, которая проявляется судорожным синдромом, микроцефалией, рядом дисморфических признаков и приводит к смерти больных в раннем детстве [40]. У 6 пациентов было выявлено превышение верхней границы 2-кетоглутаровой кислоты. Сравнительный анализ методом t-критерия Стьюдента средней величины уровня данного метаболита (36,6±9,91 ммоль/моль креатинина) в группе больных против группы сравнения (11,9±1,87 ммоль/моль креатинина) показал статистически достоверное различие между данными выборками (p=0,018). Статистический сравнительный анализ выборки пациентов и группы сравнения всей совокупности значений данного метаболита по критерию Манна—Уитни также показал достоверное различие (p=0,023). Исследованиями установлено, что некоторые антиконвульсанты, например вальпроаты, могут блокировать восстановительное аминирование α-кетоглутарата, вызванное хемоконвульсантным метаболитом пентилентетразолом [41]. Таким образом, данный маркер цикла Кребса может играть определенную роль в этиопатогенезе эпилептической активности нейронов коры головного мозга.

Также у ряда пациентов с эпилепсией на фоне ожирения были выявлены повышенные уровни маркеров митохондриальной дисфункции: у 5 — адипиновой кислоты, у 3 — этилмалоновой, у 1 — метилянтарной. В группе сравнения все исследованные маркеры митохондриальной дисфункции были в пределах нормы. Статистический анализ среднего значения адипиновой кислоты в группе больных эпилепсией на фоне ожирения (2,97±0,78 ммоль/моль креатинина) против группы сравнения (1,87±0,39 ммоль/моль креатинина) не показал статистически достоверных различий (p=0,621). Такой же анализ, проведенный для этилмалоновой кислоты (2,79±0,42 ммоль/моль креатинина против 1,58±0,42 ммоль/моль креатинина соответственно), показал статистически достоверное отличие (p=0,012). В настоящее время установлено, что митохондриальная дисфункция может быть следствием эпилептических приступов, увеличивать энергетическую потребность нейроцитов и в конце концов приводить к их гибели [42]. Также может быть обратная ситуация, когда моногенные митохондриальные заболевания проявляются клинической картиной определенного эпилептического синдрома [43, 44].

Заключение

Таким образом, в группе пациентов с различными эпилептическими синдромами на фоне ожирения выявлены следующие нарушения профиля органических кислот в моче:

1) у большинства пациентов отмечены отклонения в метаболизме аминокислот, что связано с повышенными уровнями 4-метил-2-оксовалериановой кислоты;

2) в группе пациентов с эпилепсией на фоне ожирения отмечено превышение в моче ряда метаболических маркеров, ассоциированных с митохондриальной дисфункцией;

3) также в группе пациентов с эпилепсией на фоне ожирения отмечено превышение в моче 2-кетоглутаровой кислоты.

Таким образом, результаты исследования подтверждают значимость индивидуального подхода к диагностике и лечению эпилепсии у детей с ожирением. Особое внимание следует уделять исследованию митохондриальных функций и метаболических нарушений, так как они оказывают значительное влияние на клиническое течение эпилепсии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.