Введение

Несмотря на завершение острой фазы эпидемии COVID-19, сохраняется потребность в диагностике, проведении вакцинопрофилактики и изучении характера взаимодействия SARS-CoV-2 и иммунной системы. С начала распространения инфекции COVID-19 была проведена значительная работа, нацеленная на ускорение разработки и внедрения стратегий диагностики и вакцинации. Однако все еще остаются нерешенными некоторые вопросы.

С 2020 г. по настоящее время для отслеживания динамики иммунного ответа против SARS-CoV-2 в качестве «золотого стандарта» используются тесты, нацеленные на количественное определение антител IgG к S-белку коронавируса SARS-CoV-2 иммунохимическими методами анализа (ИХА), которые были повсеместно внедрены для определения количества и оценки динамики антител IgG против SARS-CoV-2 в сыворотке крови человека.

В отличие от тестов, направленных на определение гуморального иммунитета, стандартизированные методы оценки клеточного звена иммунитета против SARS-CoV-2 отсутствуют. В числе причин, по которым клеточный иммунитет против SARS-CoV-2 не отслеживается подобным образом, можно предположить: использование дорогостоящего оборудования и реагентов, не входящих в стандартное оснащение клинико-диагностических лабораторий; отсутствие автоматизированных методов; технологическая трудоемкость и длительность исследования, а также недооценка роли T-клеточного иммунитета в обеспечении длительной иммунной защиты против SARS-CoV-2. Тем не менее достаточно активно предпринимаются попытки модернизации, усовершенствования и удешевления различных технологий и тестов с целью сделать их доступными для рутинного использования.

Два звена системы адаптивного иммунитета

Как известно, адаптивный иммунный ответ состоит из двух звеньев: гуморального (антителозависимый иммунный ответ) и клеточного (T-клеточный иммунный ответ) иммунитета. Обе цепи реагируют на инфекцию SARS-CoV-2 с помощью различных, но дополняющих друг друга механизмов [1—3].

Антигенспецифические антитела вырабатываются B-клетками (плазматическими клетками) и способны приводить к нейтрализации вируса путем утраты способности связываться с клетками-мишенями.

При попадании вируса в клетку-мишень T-клетки, благодаря разнообразному набору T-клеточных рецепторов, способны распознавать антигенные эпитопы вируса на поверхности инфицированных клеток с молекулами главного комплекса гистосовместимости I. Благодаря выработке гамма-интерферона (гамма-ИНФ) и межклеточным взаимодействиям T-клетки стимулируют защитный противовирусный ответ против SARS-CoV-2 как на внутриклеточном, так и на внеклеточном уровне: с одной стороны, стимулируя CD8⁺ цитотоксические лимфоциты (T_ц), которые распознают и уничтожают инфицированные вирусом клетки; с другой стороны, стимулируя выработку B-клетками нейтрализующих антител [4, 5].

Предполагается, что для формирования иммунитета необходимо наличие иммунного ответа хотя бы по одному из звеньев иммунной системы [6, 7]. При этом примечательно, что, согласно данным литературы, гуморальное звено иммунитета быстрее развивается и снижается в течение 1—3 мес после заражения или вакцинации, в то время как T-клеточный иммунитет остается в значительной степени функциональным в течение более длительного времени (>8 мес) [8, 9]. Также было описано, что у людей, получающих терапию, угнетающую B-клеточное звено иммунитета, или страдающих онкогематологическими заболеваниями, после вакцинации против SARS-CoV-2 был обнаружен исключительно T-клеточный иммунитет [10, 11].

При сравнении клеточного иммунитета пациентов, у которых наблюдали симптоматические проявления заболевания COVID-19, и пациентов с бессимптомным течением заболевания, было обнаружено, что формирование анти-SARS-CoV-2 T-клеточного ответа не зависит от наличия или отсутствия симптомов. Однако анти-SARS-CoV-2-специфические T-клетки у бессимптомных пациентов функционально более активны по сравнению с T-клетками пациентов с симптоматическим проявлением заболевания COVID-19. Это различие было продемонстрировано с помощью анализа ELISPOT (Enzyme-linked immunospot assay) цитокинов гамма-ИНФ и ИЛ-2 (интерлейкина-2) [9].

Специфические анти-SARS-CoV-2 T-клетки циркулируют в организме более продолжительное время, чем соответствующие антитела, поэтому логично предположить необходимость контроля клеточного иммунитета на популяционном уровне. Таким образом, целесообразна разработка масштабируемых методов, направленных на исследование клеточного иммунитета. На данный момент имеется ряд тестов, которые позволяют производить такие исследования, но они имеют ряд ограничений: 1. Тест-системы иностранного производства с ограниченной доступностью; 2. Тест-системы имеют многоэтапную и длительную методику, что препятствует внедрению в рутинную практику; 3. Высокая стоимость диагностического набора и нестандартные требования к оснащенности лаборатории.

В отличие от гуморального иммунитета, для оценки которого проводится количественное определение антител с пересчетом результатов в международные единицы (BAU/мл), клеточный иммунитет не имеет унифицированного способа интерпретации полученных данных. В клинических испытаниях и при разработке вакцин могут быть использованы различные методы, такие как ELISPOT, иммуноферментный анализ (ИФА) и проточная цитометрия. Каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки, описание и сравнение которых будет представлено в данном обзоре. Также в обзоре будут описаны усовершенствованные варианты тестов, которые были предложены разными авторами.

Тесты, направленные на регистрацию высвобождения гамма-ИНФ (IGRA-тесты)

IGRA-тесты нацелены на обнаружение антигенспецифических T-клеток. В основе лабораторных методик лежат определение и визуализация секреции определенных цитокинов (например, гамма-ИНФ), секретируемых сенсибилизированными к SARS-CoV-2 T-клетками в ответ на представление им определенных антигенов (например, пептидов из различных белков SARS-CoV-2). Инкубация приводит к специфической активации сенсибилизированных клеток, которые могут быть количественно выявлены и охарактеризованы в разной степени. Данный тип тестов имеет несколько вариантов, отличающихся разными методологическими платформами.

Тест-системы на платформе ELISPOT

Тест-система на платформе ELISPOT чаще всего используется для количественного определения специфических T-клеток. Методика подразумевает выделение мононуклеарных клеток периферической крови человека (МНПК) из венозной крови на градиенте фиколла. Далее в планшет с сорбированными на мембране антителами к гамма-ИНФ (или другому цитокину) вносят клеточную суспензию. Затем вносятся пептидные антигены (количество антигенов может варьироваться). Клетки, специфически распознающие антиген, секретируют цитокины, которые локально захватываются сорбированными антителами, а затем могут быть обнаружены путем инкубации с вторичными биотинилированными антителами с последующим подсчетом отдельных пятен с помощью средств фотовизуализации, где каждое пятно соответствует одной антигенспецифической T-клетке [11, 12].

Разновидность анализа ELISPOT — Fluorospot. Особенность теста заключается в использовании антител, конъюгированных с флюорохромами, для обнаружения более широкого спектра специфических подмножеств клеток. Тест позволяет определять несколько цитокинов одновременно путем использования разных флюорохромов для разных мишеней, что дает возможность обнаруживать их одновременно в одном анализе [13].

Преимущества ELISPOT заключаются в высокой чувствительности и надежности результата. Данный метод использовался в клинических исследованиях, в том числе в испытаниях вакцины Sputnik Light [14, 15].

Oxford Immunotec одним из первых разработал анализ ELISPOT для исследования клеточного иммунитета к SARS-CoV-2 в диагностических целях (T.SPOT COVID). Данная тест-система была одобрена FDA [16]. В России также существует ELISPOT для исследования клеточного иммунитета SARS-CoV-2 в диагностических целях — набор ТиграТест SARS-CoV-2, разработанный компанией АО «ГЕНЕРИУМ» [17].

К преимуществам ELISPOT можно отнести: высокую чувствительность (можно обнаружить антигенспецифические клетки с точностью до 1 клетки в образце), относительно быстрое время выполнения анализа (24 ч), возможность централизации выполнения. К основным недостаткам данной тест-системы можно отнести: наличие процедуры выделения МНПК, которая представляет собой технически сложный этап; высокая стоимость реагентов и оборудования создает трудности для рутинного использования; отсутствие стандартизированного метода криоконсервации, так как МНПК чувствительны к данной манипуляции [18].

Тест-системы на основе иммуноферментного анализа (ИФА)

Лабораторные тесты ИФА также нацелены на обнаружение антигенспецифических T-клеток путем анализа секреции гамма-ИНФ или других цитокинов после инкубации с антигенными пептидными пулами. Анализ производится в планшетах ИФА, покрытых антителами, которые связываются со специфическими цитокинами и количественно определяют их концентрацию [19].

Наборы ИФА просты в применении и доступны в виде коммерческих наборов с четкими инструкциями и реагентами. «Qiagen» выпустил набор ИФА, предназначенный для исследований COVID-19 (QuantiFeron SARS-CoV-2), однако данный коммерческий набор недоступен в России [20]. ИФА требует стандартного оборудования, достаточно наличия классического планшетного фотометра для анализа результата. Дополнительным преимуществом этого анализа является то, что после стимуляции цельной крови образцы сыворотки могут храниться продолжительный период времени (до 7 дней при +2…+8 °C), для более продолжительного хранения есть возможность заморозки проб.

Метод «проточная цитометрия»

Метод проточной цитометрии, в отличие от рассмотренных ранее методов, дает возможность проведения полного иммунофенотипирования клеток. Общий принцип этого анализа заключается в характеристике поверхностных или внутриклеточных маркеров на каждой отдельной клетке образца с применением моноклональных антител с флюоресцентной меткой к каждому маркеру. В качестве материала для исследования могут применяться выделенные МНПК или цельная кровь. Наиболее распространенным вариантом оценки реактивности T-клеток является изучение T-клеточных индуцированных активационных маркеров после воздействия вирусного антигена: обнаружение CD25 и CD40L на CD4+ T-клетках или ко-экспрессия CD40L и CD69, а также CD107a и CD137 на антигенспецифичных CD8+ T-клетках. Дополнительные маркеры активации, такие как CD134 и CD25, экспрессируются на активированных CD8+ T-клетках [21]. В отличие от ИФА, где количественно определяется общая концентрация цитокинов, методом проточной цитометрии можно определить субпопуляцию клеток, секретирующих определенные молекулы [22].

Анализ с использованием проточной цитометрии широко использовался в исследованиях COVID-19 для уточнения субпопуляций иммунных клеток, в том числе T-клеток, и их характеристик, а также для проведения функционального анализа (например, подавление функциональной активности определенных субпопуляций T-клеток) [23]. Очевидно, что использование данной технологии позволяет получить значительный объем информации, однако к недостаткам этого метода можно отнести необходимость высокого уровня квалификации персонала, технологическую сложность метода, а также высокую стоимость, что затрудняет его масштабирование.

Перспективные варианты модификации тестов

Выше были описаны методы, применимые для анализа клеточного звена иммунной системы с целью обнаружения клеточного иммунитета к инфекции, включая SARS-CoV-2. Несмотря на большой спектр методов, у каждого из них есть ограничения для широкого применения в рутинных исследованиях клинико-диагностических лабораторий.

Всесторонняя оценка вакциноиндуцированного иммунитета может быть полезной при оценке продолжительности и напряженности иммунитета и способствовать получению более полной информации об эффективности вакцинации. В качестве примера значимости анализа клеточного иммунитета можно привести исследование, которое показало, что вакцина Ad26.COV2.S значительно теряет свою эффективность против вирусных вариантов за счет быстрого снижения титра антител [24]. Однако есть и альтернативная точка зрения, которая заключается к том, что, несмотря на снижение антител против различных вариантов вируса, ответ T-клеток оставался неизменным в течении 8 мес [25].

Из-за необходимости исследования клеточного иммунитета предпринимается большое количество попыток разработать новые или модифицировать имеющиеся тесты с целью улучшения и упрощения теста. Например, авторы статьи в журнале «Biosafety and Health» предлагают использование различных комбинаций антигенов для достижения максимальных результатов в зависимости от цели. В частности, с целью повышения точности выявления пациентов, перенесших COVID-19, авторы предложили применение пептидных пулов белков S1, S2, M, N совместно, а не в отдельности, а также отдельные исследования наличия иммунного ответа на каждый из антигенов с целью идентификации пациентов, перенесших COVID-19 бессимптомно, и альтернативные варианты культивирования с добавлением ИЛ-7 и ИЛ-2. В результате авторам удалось достигнуть максимальной чувствительности 93% и максимальной специфичности 100% относительно коммерчески доступного набора сравнения с чувствительностью и специфичностью 81,1 и 90,9% соответственно [26].

В другом варианте модернизации авторы использовали разное количество пептидных антигенов с целью возможности уменьшения их количества на одно исследование для снижения стоимости теста и не обнаружили значимых различий между результатами при концентрации от 0,1 до 5,0 мкг/мл в анализе ELISPOT. Влияние концентраций пептидов оценивалось у людей, не подвергшихся воздействию SARS-CoV-2, переболевших COVID-19 и вакцинированных против SARS-CoV-2 [27]. В данной работе авторы также предлагают вариант автоматизации считывания планшетов ELISPOT без использования дорогостоящего планшетного ELISPOT-ридера и программного обеспечения. Авторы использовали стандартный цифровой микроскоп в самостоятельно стандартизированной освещенной среде. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения FIJI с открытым исходным кодом, которое позволяет в автоматизированном режиме производить подсчет спотов (окрашенных пятен) в лунках планшета. Также показана возможность использования сторонних пептидных пулов, что позволяет адаптировать тест-систему для более точной оценки клеточного иммунитета на конкретные варианты вируса [27].

Стоит обратить внимание на то, что в литературе встречается сравнение точности ELISPOT и проточной цитометрии. Например, J. Villemonteix и соавт. продемонстрировали, что при сравнении тестов анализа клеточного иммунитета пациентов, переболевших легкой формой COVID-19, анализ ELISPOT оказался более чувствительным, чем проточная цитометрия [28]. Эти данные указывают на то, что разные анализы in vitro могут приводить к получению различных результатов о наличии или отсутствии специфического T-клеточного иммунитета к SARS-CoV-2. Авторы предполагают, что результаты можно скорректировать путем проработки вариантов протокола культивирования клеток, однако это также указывает на необходимость разработки стандартизованного и простого метода для получения корректного результата [28].

Также F. Bergami и соавт. представили разработку собственного аналога IGRA-теста с использованием технологии ИФА и сравнили его со стандартизированным дизайном анализа ELISPOT, а также с коммерческими тестами для количественной оценки антигенспецифической продукции гамма-ИНФ на платформе ИФА (аналога QuantiFeron) [29]. Идея авторов заключалась в том, чтобы уйти от платформы ELISPOT для упрощения и снижения стоимости теста. Авторы стимулировали 1 мл цельной крови пептидами S-белка (данные пулы также использовались для ELISPOT), далее производили анализ супернатанта ИФА системой количественного анализа гамма-ИНФ и сравнивали с тремя коммерческими диагностическими тестами на платформе ИФА для количественной оценки антигенспецифичной продукции гамма-ИНФ к SARS-CoV-2 [29]. Примечательно, что в качестве порогового значения авторы установили уровень гамма-ИНФ выше 10 пг/мл. Остается открытым вопрос об обосновании такого значения, учитывая, что в коммерческих наборах чаще используются другие единицы измерения (ЕД/мл). Установление порогового значения является одной из ключевых проблем при самостоятельной разработке аналогичного теста. В целом авторами были получены удовлетворительные результаты, тест собственной разработки незначительно уступал в чувствительности коммерческим аналогам (согласованность положительных результатов составила 93%, согласованность отрицательных результатов — 75%). Также отмечено, что анализ ELISPOT имеет более высокую чувствительность относительно тестов на платформе ИФА — 90 и 83% соответственно [29].

Разработки направлены не только на упрощение тест-систем, но и на увеличение корректности оценки иммунного ответа против SARS-CoV-2. A. Aiello и соавт. сравнивали результаты стандартизированного QuantiFeron SARS-CoV-2 с результатами теста QuantiFeron SARS-CoV-2, в котором набор пробирок с лиофилизатом пептидных пулов SARS-CoV-2, входящий в состав набора, был заменен на сторонние антигены PepTivator SARS-CoV-2 (Prot_S, Prot_S1 и Prot_S+, Германия). В результате исследования на 66 пациентах (в их числе были пациенты с ослабленным иммунитетом), которые перенесли COVID-19 или вакцинировались, было продемонстрировано, что тест-система со сторонними антигенами показала наиболее высокий результат выявляемости наличия иммунного ответа (78,8% против 62,1%). Авторы предполагают, что подобное различие может быть связано с природой антигенов и используемой стимулирующей концентрации [30]. Также авторы с помощью проточной цитометрии охарактеризовали пулы клеток, которые активируются под воздействием антигенов, содержащихся в составе набора (лиофилизаты антигенов в комплекте пробирок — Ag1 и Ag2). Смесь пептидов, содержащаяся в пробирке Ag1, индуцировала ответ, опосредованный CD4⁺ T-клетками. Напротив, смесь пептидов в пробирке Ag2 индуцировала ответ как на CD4⁺, так и на CD8⁺ T-клетках [30]. Эти результаты согласуются с другими результатами подобного исследования [31] и могут представлять собой дополнительный параметр при интерпретации результатов.

Также были представлены и весьма необычные идеи упрощения и стандартизации IGRA-теста. Например, авторы описывают быстрый, чувствительный микрожидкостный чип IGRA с нанослойным полилизином, считываемый с помощью флюоресцентного микроскопа. Тест-система предполагает внесение на специальный чип 25 мкл цельной крови, стимуляторов активации и пулов антигенов, после чего смесь инкубируется в течение 4 ч. Далее предполагаются фиксация образца, пермеабилизация, а затем окрашивание анти-IFN-γ-Alexa488 (eBioscience 50-168-09) и Hoechst 33342 с последующей визуализацией с помощью флюоресцентного микроскопа по принципу технологии ELISPOT. При оценке ответа T-клеток на пептиды SARS-CoV-2 в группах вакцинированных или переболевших пациентов результаты данного анализа коррелировали с результатами анализа коммерческого IGRA-теста ELISPOT и результатами проточной цитометрии. Авторы утверждают, что этот упрощенный и недорогой анализ подходит для высокопроизводительных исследований в условиях ограниченных ресурсов и при других инфекционных заболеваниях [32].

Заключение

Остается потребность в более полной оценке адаптивного иммунного ответа на SARS-CoV-2 для формирования картины иммунного статуса населения. Кроме того, всесторонний анализ индуцированного вакциной иммунитета дает возможность определить продолжительность и напряженность иммунитета, оценить эффективность вакцинации. В настоящее время не существует унифицированных методов оценки клеточного иммунитета против SARS-CoV-2, которые могли бы использоваться повсеместно аналогично оценке титра антител против SARS-CoV-2. В клинических исследованиях и разработке вакцин используется несколько анализов, такие как ELISPOT, иммуноферментный анализ и проточная цитометрия. Каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки, которые были описаны в этом обзоре.

Из представленных описаний видно, что тема разработки оптимальных тест-систем для оценки клеточного иммунитета активно исследуется. Предлагается множество вариантов с целью упрощения, стандартизации и снижения себестоимости коммерческих тест-систем для возможности внедрения анализа в рутинную лабораторную практику. Варианты модернизации и разработки направлены на оптимизацию стоимости теста путем использования собственного программного обеспечения, доступного для общего пользования, и разработки собственного оборудования для визуализации; на усовершенствование путем замены отдельных компонентов коммерческих тест-систем, а также на полную разработку аналогичного теста.

Финансирование. Специального финансирования нет.

Financing. No special funding.

Авторы подтверждают, что статья или ее части ранее не были опубликованы.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.