Введение

Туберкулез (ТБ) — это серьезное заболевание, которое ежегодно уносит около 1,5 млн жизней по всему миру [1]. Это инфекционное заболевание, вызываемое патогенными микобактериями, относящимися к классу Actinobacteria, порядку Actinomycetales, семейству Mycobacteriaceae, образующими группу Mycobacterium tuberculosis complex, которая включает Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium canetti, Mycobacterium caprae и Mycobacterium pinnipedii [1, 2]. ТБ — инфекционное заболевание, наиболее часто передающееся воздушно-капельным путем с поражением легких. Однако развитие инфекционного процесса может происходить в любых органах и тканях организма, в том числе в лимфатических узлах, костно-мышечном аппарате, головном мозге.

В патогенезе туберкулеза различают два феномена — инфицирование и заболевание. Инфицирование — это проникновение микобактерий туберкулеза (МБТ) в организм при отсутствии соответствующей клинической симптоматики и локальных проявлений.

Заболевание туберкулезом характеризуется появлением морфологических, клинико-рентгенологических и микробиологических признаков патологии. Пациент с туберкулезом никогда не выявляется в момент первичного инфицирования. От момента заражения до развития болезни может пройти от нескольких недель до нескольких лет [1].

Заражение туберкулезом начинается бессимптомно. Это состояние неактивного носительства называется латентной туберкулезной инфекцией (ЛТИ) и может сохраняться в течение недель, месяцев или лет, прежде чем перерастет в активный процесс. Средний риск развития активной формы заболевания у пациентов с ЛТИ в течение жизни составляет около 10%.

Активный ТБ характеризуется неконтролируемым ростом количества МБТ вследствие преодоления механизмов иммунной защиты человека. В частности, для легочной формы туберкулеза характерно появление таких симптомов, как хронический кашель, лихорадка, потеря веса, ночная потливость и кровохарканье.

В развитии туберкулеза как заболевания различают два периода: первичный и вторичный. Первичные формы туберкулеза с точки зрения патогенеза характеризуются развитием гиперсенсибилизации, поражением лимфатической системы, генерализацией процесса и частым появлением внелегочных форм заболевания. Вторичные формы заболевания формируются в результате эндогенной реактивации туберкулеза на фоне ослабления иммунитета, характеризуются формированием локальных форм, однако могут развиться и в результате повторного проникновения МБТ в организм из внешней среды — экзогенной суперинфекции [1].

Поскольку туберкулез — хроническая бактериальная инфекция, характеризующаяся развитием клеточно-опосредованной гиперчувствительности, в арсенале врачей имеются и активно применяются лабораторные методы диагностики, основанные на выявлении T-клеточной сенсибилизации. Данные методы относятся к группе IGRA-тестов (Interferon gamma release assay) и служат важным инструментом, особенно для диагностики латентной туберкулезной инфекции и в качестве альтернативы внутрикожным пробам.

В настоящее время (I квартал 2024 г.) в России зарегистрированы и доступны для медицинского применения IGRA тест-системы для диагностики туберкулеза от трех производителей, которые имеют в основе единый принцип, но используют различные методологические платформы для проведения, регистрации результатов исследования, направленность антигенной презентации и также имеют отличия в преаналитических требованиях, что может вызывать затруднение при выборе оптимального теста и последующей интерпретации врачом полученного результата и приводить к снижению диагностической значимости проведенного теста.

Цель работы — провести сравнительную оценку доступных в России тест-систем для иммунологической клеточно-опосредованной диагностики туберкулеза и оценить преимущество тест-систем, использующих рекомбинантные микобактериальные антигены, способные активировать, помимо T-хелперных клеток, цитотоксические T-лимфоциты.

Материалы и методы

В исследование были включены данные обследования 50 человек старше 18 лет, из которых: 24 пациента (19 мужчин и 5 женщин) с активной формой туберкулеза, проходящих стационарное лечение, 16 — с ЛТИ (10 мужчин и 6 женщин, данная группа пациентов подобрана на основании заключений специалистов) и 10 здоровых добровольцев (8 женщин и 2 мужчины, сотрудники лаборатории, не имевшие в анамнезе контактов с больными туберкулезом и проходящие ежегодную диспансеризацию, включающую лучевые и иммунологические методы диагностики на протяжении не менее 3 лет, предшествующих данному исследованию. Последнее обследование было проведено не более чем за 6 мес до включения в исследуемую группу). Группа с активной формой туберкулеза включала 4 пациентов с туберкулезом костей и суставов и 20 — с туберкулезом легких различных стадий, клинический диагноз представлен в табл. 1.

Таблица 1. Информация о формах туберкулеза в группе с активной формой заболевания

МКБ-10 — Международная классификация болезней 10-го пересмотра (МКБ-10); 1ГДУ — Первая группа диспансерного учета; ЯБЖ — Язвенная болезнь желудка; МБТ(+) — туберкулез подтвержденный результатами бактериологических исследований мазка мокроты; МБТ (–) — микобактерии по данным лабораторного исследования не выявлены; СД — сахарный диабет; ЛУ — лекарственная устойчивость; R — Рифампицин; МЛУ — множественная лекарственная устойчивость; H — изониазид (Isoniazid); R — рифампицин (Rifampicin); E — этамбутол (Ethambutol); Etn — этионамид (Ethionamide).

Для сравнительной характеристики IGRA-тестов были выбраны зарегистрированные и доступные в России: T-SPOT.TB, QuantiFERON-TB Gold Plus и TB-Feron IGRA. Каждый из 50 пациентов был обследован с использованием всех перечисленных тест-систем. Все указанные тест-системы относятся к семейству IGRA-тестов, которые основаны на способности регистрировать наличие клеточно-опосредованного иммунного ответа в ответ на антигены микобактерий туберкулезного комплекса. Ключевые отличия данных тест-систем заключаются в типе используемой платформы исполнения, наборе и длине пептидных антигенов, а также в преаналитических требованиях.

В зависимости от используемой платформы рассматриваемые тесты делятся на две группы: основанные на классическом варианте иммуноферментного анализа (ИФА) и на методе ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot). К первой группе тестов относятся TB-Feron IGRA («SD BIOSENSOR. INC», Южная Корея) и QuantiFERON-TB Gold Plus («QIAGEN GmbH», США). Ко второй группе относится тест T-SPOT.TB («Oxford Immunotec Ltd.», Великобритания, АО «ГЕНЕРИУМ», Россия).

Использование всех тест-систем проводилось в строгом соответствии с приложенной инструкцией производителя с соблюдением всех требований преаналитического этапа. Оценка результатов проводилась согласно критериям, установленным соответствующими производителями.

В текущей статье проведено сравнение указанных выше тест-систем на основании теоретических данных и результатов собственного сравнительного исследования.

Для оценки диагностической эффективности проводилось определение чувствительности тестов в рутинной практике — доли лиц с положительными результатами теста среди лиц, страдающих изучаемым заболеванием, и специфичности — доли лиц с отрицательными результатами теста среди здоровых лиц без изучаемого заболевания.

Для оценки работы диагностических тестов рассчитан индекс Юдена J (Youden’s index):

J=Se+Sp-1,

где Se — Sensitivity, чувствительность теста, Sp — Specificity, специфичность теста.

Чем выше индекс, тем лучше работает диагностическая технология.

Результаты

Сравнение типов используемой платформы

Тест-системы для иммунологической клеточно-опосредованной диагностики туберкулеза могут быть реализованы с использованием твердофазного ИФА или на платформе ELISPOT, каждый метод имеет ряд особенностей.

Платформа ELISPOT позволяет обнаружить и произвести подсчет отдельных гамма-интерферон-продуцирующих T-лимфоцитов, сенсибилизированных к микобактериальным антигенам. Данную платформу из рассматриваемых тестов использует тест-система T-SPOT.TB («Oxford Immunotec Ltd.», Великобритания, АО «ГЕНЕРИУМ», Россия). Основные этапы данного метода включают¹:

1. Выделение мононуклеаров периферической крови (МНПК) из литий гепариновой или цитратной крови на градиенте фиколла (плотность 1,077 г/см³) или с использованием специальных пробирок для выделения МНПК BD Vacutainer CPT;

2. Двукратную отмывку выделенных клеток;

3. Подсчет выделенных клеток с помощью гемоцитометра (камера Горяева), автоматического счетчика клеток или гематологического анализатора с последующим разведением в среде AIM-V;

4. Перенос клеточной суспензии, содержащей по 250 тыс/кл, в 4 лунки специального 96-луночного планшета и инкубацию во влажной камере при 37 °C и 5% CO₂ в течение 16—20 ч. При этом для каждого пациента проводится контроль спонтанной продукции гамма-интерферона в первой лунке планшета, во второй и третьей — добавляются антигены ESAT-6 и CFP-10 соответственно. В четвертой лунке инкубация проводится с фитогемаглютинином (ФГА) для неспецифической активации T-лимфоцитов с целью проверки их функциональной полноценности и контроля преаналитического этапа.

На протяжении этого этапа происходит презентация антигенов T-лимфоцитам, и при наличии в исследуемой суспензии сенсибилизированных к туберкулезным микобактериям клеток происходит их активация с секрецией гамма-интерферона (ИНФ-γ), который захватывается иммобилизованными на нитроцеллюлозной мембране дна лунки планшета антителами.

5. После инкубации проводится отмывка лунок планшета, добавление вторичных меченых антител к ИНФ-γ и субстрата, в результате на дне лунок планшета появляются так называемые споты (пятна), которые представляют собой тени гамма-интерферон-секретирующих клеток;

6. После высыхания планшета проводится подсчет пятен с помощью микроскопа, различных средств фотовизуализации или специализированного ELISPOT- считывающего устройства.

Ключевые особенности данной платформы:

1. Образцы крови можно получать в стандартные пробирки для сбора крови с гепарином или цитратом с последующим выделением МНПК при помощи стандартных сепарационных технологий;

2. Исследование проводится на объеме крови, полученном от пациента, метод не требует стандартизации по объему крови. Стандартизация по количеству МНПК корректирует низкое количество T-клеток, что является несомненным преимуществом для лиц с иммунодефицитом и минимизирует получение ложноотрицательных результатов;

3. В ходе исследования производится отмывка клеток для удаления внеклеточных цитокинов и снижения тем самым их фонового уровня. Этап отмывки также позволяет удалить фон от приема лекарственных препаратов, способных влиять на интерфероновый ответ, что повышает качество итогового результата теста;

4. Для исследования одного образца по методике T-SPOT.TB требуется задействовать 4 лунки, из которых две лунки контроля (нулевой контроль — оценка спонтанной продукции ИНФ-ɣ, положительный контроль — оценка функциональной способности T-клеток). В ходе исследования T-SPOT.TB определяется функциональный статус T-клеток, не требуется построения стандартных кривых.

В отличие от ELISPOT-платформы, метод IGRA ИФА, на котором основаны TB-Feron IGRA («SD BIOSENSOR. INC», Южная Корея)² и QuantiFERON-TB Gold Plus («QIAGEN GmbH», США)³, не позволяет провести подсчет отдельных клеток, поскольку детекция ИНФ-ɣ проводится в плазме крови человека. В связи с этим мы можем выделить следующие отличительные особенности:

1. Метод IGRA-тестов, основанных на ИФА, не предполагает наличие этапа клеточного выделения, и процесс антигенной презентации проводится непосредственно в цельной литий-гепариновой крови;

2. После получения лабораторией крови пациента, взятой в стандартную вакуумную пробирку, содержащую гепаринат лития, проводится перенос 1±0,2 мл перемешанной крови в специальные пробирки, входящие в состав тест-систем. В случае с TB-Feron IGRA — это 3 пробирки, для QuantiFERON-TB Gold Plus — 4 пробирки, детальное описание которых будет приведено в разделах ниже. Необходимо соблюдать технику перемешивания;

3. Допускается взятие крови пациента непосредственно в пробирки, входящие в состав наборов тест-систем, минуя промежуточную, выбор зависит от индивидуальных условий и логистических возможностей;

4. После переноса крови в пробирки, входящие в состав соответствующих наборов реагентов, проводится их инкубация при 37 °C без необходимости подачи углекислоты в течение 16—20 ч. Реакционные пробирки содержат пептидные антигены туберкулезных микобактерий, при этом предусмотрено по одной дополнительной пробирке для каждого пациента для контроля спонтанной продукции и неспецифической активации, аналогично описанному выше тесту T-SPOT.TB;

5. По окончании инкубации проводится центрифугирование пробирок, при котором содержащийся в них разделительный гель отделяет форменные элементы от плазмы, в которой далее проводится количественное измерение гамма-интерферона с использованием ИФА-планшета и компонентов, входящих в состав тест-системы.

Сравнение типов используемых антигенов

Проведенная расшифровка генома МБТ [4] и возможности полногеномного секвенирования МБТ позволили провести сравнительные исследования геномов, в частности патогенных M. bovis и M. tuberculosis H37Rv с вакцинным штаммом M. bovis BCG [5—8], что привело к идентификации зоны RD1, присутствующей во всех штаммах M. tuberculosis и патогенных штаммах M. bovis, но отсутствующей в M. bovis BCG и большинстве нетуберкулезных микобактерий [11]. При этом наиболее полно изученные антигены ESAT-6 (early secreted antigenic target 6) и CFP-10 (culture filtrate protein 10) зоны RD1 [8—10] нашли применение как в диагностических препаратах (Диаскинтест), так и в лабораторных тест-системах, в том числе во всех рассматриваемых в текущей статье. Используемые антигены могут быть направлены только на T-хелперный ответ, как в тесте TB-Feron, в котором используются пептиды с длинной цепью, или может быть использована комбинация длинных и коротких пептидов для дополнительной стимуляции CD8+ цитотоксических T-лимфоцитов, как в тестах T-SPOT.TB и QuantiFERON-TB Gold Plus.

Относительно недавние исследования показали важную роль цитотоксических T-клеток CD8+ в механизмах иммунного противостояния и контроля над M. tuberculosis, при этом был продемонстрирован значительно более высокий ответ CD8+ у пациентов с положительным результатом микроскопии или активным туберкулезом легких, чем у пациентов с отрицательным результатом микроскопии или ЛТИ [12, 13]. Высокий CD8+ T-клеточный ответ также был выявлен среди лиц, недавно контактировавших с пациентами, страдающими активной туберкулезной инфекцией [14].

Способность индуцировать ответ цитотоксических T-клеток CD8+ является важным аспектом для пациентов, коинфицированных ВИЧ, у которых развивается дефицит Th при сохранении количества CD8+ T-лимфоцитов [15, 16].

Перечисленные аргументы подтверждают целесообразность индуцировать оба типа T-клеток, что призвано повысить чувствительность тест-систем в отношении активных форм туберкулеза и состояниях, сопровождающихся дефицитом CD4+ T-лимфоцитов.

Способностью индуцировать CD4+ и CD8+ T-клеточный ответ in vitro обладают из рассматриваемых нами две тест-системы: T-SPOT.TB и QuantiFERON-TB Gold Plus, что позволяет отнести их к новому поколению. При этом T-SPOT.TB показывает T-клеточный ответ раздельно по антигенам ESAT-6 и CFP-10, без способности субпопуляционного разделения CD4+ или CD8+, QuantiFERON-TB Gold Plus имеет две пробирки с антигенами TB1 и TB2, позволяет получить информацию о преимущественном типе активированных клеток без разделения на антигены. Обе пробирки, TB1 и TB2, содержат антигены ESAT-6 и CFP-10, но TB1 предназначена для индукции T-хелперного ответа, тогда как TB2, содержащая смесь коротких и длинных пептидов, активирует оба типа CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, при этом разница между пробирками отражает направленность ответа. В общей сложности QuantiFERON-TB Gold Plus содержит 4 пробирки с антикоагулянтом: с антигенами TB1 и TB2; NIL — не содержит дополнительных компонентов и служит для контроля спонтанной продукции ИНФ-ɣ и оценки его фонового уровня; Mitogen — пробирка, содержащая фитогемагглютинин (ФГА) для контроля функциональной полноценности лимфоцитов и способности секретировать ИНФ-ɣ.

Отличительной чертой третьего из рассматриваемых тестов — TB-Feron, помимо направленности антигенов только на T-хелперный ответ, является наличие только одной пробирки с антигенами (кроме контрольных пробирок, аналогичных QuantiFERON-TB Gold Plus), где, помимо ESAT-6 и CFP-10, имеется антиген TB7.7, но какого-либо преимущества он не демонстрирует, что было показано в ряде исследований и согласуется с данными, полученными в этой работе [17, 18].

Сравнение требований преаналитического этапа

В условиях возрастающей тенденции к централизации лабораторий и отсутствия экономической целесообразности локального проведения тестов с высоким уровнем ручных манипуляций и слабоподдающихся автоматизации, таких как IGRA-тесты, актуальной является проблема преаналитических требований. Особенно важными параметрами являются: время от момента взятия биоматериала до начала исследования и температура его хранения, что в свою очередь влияет на географический охват и доступность методов диагностики в удаленных регионах.

QuantiFERON-TB Gold Plus позволяет начать инкубацию спустя 53 ч после взятия крови у пациента при соблюдении температуры хранения и транспортировки 2—8 °C.

T-SPOT.TB предполагает возможность хранения и транспортирования образцов крови не более 8 ч при температуре 18—25 °C⁴. Однако это время можно продлить до 32 ч при условии использования дополнительного реагента T-Cell Xtend, который способен повысить чистоту лимфоцитарной фракции при выделении клеток после длительного хранения крови⁵. Температура хранения и транспортировки биоматериала в обоих вариантах сохраняется 18—25 °C.

Для TB-Feron преаналитические требования предполагают 16 ч от взятия до начала инкубации, необходимо соблюдать температуру хранения 18—25 °C.

Для ИФА IGRA тест-систем в ряде случаев целесообразно проводить этап инкубации по месту взятия биоматериала, что позволяет увеличить допустимое время доставки в лабораторию.

Сравнение полученных результатов применения тест-систем

Проведенное исследование показало, что для группы с активными формами туберкулеза (n=24) положительный результат был у 19 пациентов при использовании T-SPOT.TB, у 19 — с QuantiFERON-TB Gold Plus и у 13 — с TB-Feron, при этом 2 результата были интерпретированы как неопределенные вследствие недостаточной функциональной активности лимфоцитов (табл. 2).

Таблица 2. Результаты диагностических тестов, полученные в группе пациентов с активной формой туберкулеза (n=24)

Примечание. * — значение приводится после вычета спонтанной концентрации ИНФ-ɣ в контрольной пробирке. ** — значение приводится после вычета количества спотов в нулевой контрольной лунке.

Полученные данные для группы с активной формой туберкулеза свидетельствуют о сравнительно низкой чувствительности тест-систем, в отличие от латентных форм. Наименьшую чувствительность показал TB-Feron. Причиной этого может служить комплекс особенностей патогенеза заболевания, ключевой из которых является роль T-хелперного звена при развитии активной формы заболевания. В частности, недостаточность T-хелперной напряженности приводит к снижению возможностей элиминации возбудителя и, как следствие, к развитию активного процесса или переходу латентной формы туберкулеза в активную. При этом требует дополнительного изучения вопрос, что является первичным: дефицит CD4+ лимфоцитов как следствие их мобилизации или развитие туберкулезной инфекции из-за первичной недостаточности T-хелперного ответа. Примечательно, что для повышения чувствительности к активным формам туберкулеза производители ряда тест-систем (T-SPOT.TB и QuantiFERON-TB Gold Plus) применяют короткие пептиды, что позволяет получить активацию цитотоксических T-лимфоцитов. Это согласуется с полученными нами результатами.

Для группы из 16 пациентов с латентной туберкулезной инфекцией положительный результат был у 14 пациентов с использованием T-SPOT.TB, у 15 — с QuantiFERON-TB Gold Plus и у 14 — с TB-Feron. Полученные результаты подтверждают высокую сходимость всех тест-систем в отношении латентных форм туберкулеза.

Для 10 здоровых индивидуумов все тест-системы показали отрицательный результат, что подтверждает высокую специфичность тестов.

Оценка индекса Юдена представлена в табл. 3.

Таблица 3. Индекс Юдена J для анализируемых IGRA-тестов (активные формы ТБ)

Заключение

Проведенное исследование позволяет согласиться с данными литературы о более высокой диагностической чувствительности тест-систем, использующих в составе короткоцепочечные пептидные антигены M.Tubeculosis (T-SPOT.TB и QuantiFERON-TB Gold Plus) для диагностики активных форм туберкулеза, а также подтвердить высокую чувствительность и сходимость результатов IGRA-тестов с использованием всех тест-систем (T-SPOT.TB, QuantiFERON-TB Gold Plus и TB-Feron) в отношении латентных форм туберкулеза.

Иммунологические лабораторные IGRA-тесты для диагностики туберкулезной инфекции имеют в основе единый принцип, но также и существенные различия, в частности используют различные подходы к проведению, регистрации результатов исследования, преаналитические требования, различия в направленности активации клеточных субпопуляций. Детальное описание указанных особенностей представлено в работе, их понимание может быть полезным при выборе оптимального варианта тест-системы и позволит повысить диагностическую значимость проводимых тестов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹Инструкция к набору реагентов T-SPOT.TB («Oxford Immunotec Ltd.», Великобритания).

² Инструкция к набору реагентов TB-Feron IGRA («SD BIOSENSOR. INC», Южная Корея).

³ Инструкция к набору реагентов QuantiFERON-TB Gold Plus («QIAGEN GmbH», США).

⁴ Инструкция к набору реагентов T-SPOT.TB («Oxford Immunotec Ltd.», Великобритания, АО ГЕНЕРИУМ).

⁵Инструкция T-Cell Xtend.