Введение

Контроль эпидемиологической ситуации является одним из ключевых аспектов защиты здоровья населения, особенно в условиях глобальных угроз инфекционных заболеваний и связанных с ними пандемий. Значение разработки диагностических методов и тестов в этом контексте трудно переоценить, поскольку они представляют собой начальное звено реагирования и неотъемлемый инструмент для оценки эффективности принимаемых противоэпидемиологических мер [1]. Тесты Point-of-Care (POCT) обеспечивают быструю и доступную идентификацию инфекционных агентов непосредственно в местах оказания медицинской помощи, будь то у постели больного или в полевых условиях. Использование POCT не только значительно сокращает время, требуемое для постановки диагноза и назначения адекватной терапии, но и снижает риск получения ложных результатов, связанных с неэффективностью логистической цепочки передачи образцов в централизованные лаборатории, что особенно актуально для регионов с низкой плотностью населения и слаборазвитыми диагностическими сервисами. Другим важным аспектом внедрения POCT-тестирования является возможность привлечения медицинского персонала младшего и среднего звена, не имеющего специализированной подготовки в области молекулярной диагностики [2—4]. Эта отличительная черта POCT-тестирования обусловлена уникальной архитектурой и конфигурацией инструментов и расходных материалов. POCT-системы изначально разрабатываются с учетом максимального сокращения действий оператора и с акцентом на принцип «внеси образец — получи результат». Это позволяет значительно упростить процесс тестирования и сделать его доступным для широкого круга медицинских работников [5—7].

С начала 2000-х годов в ряде западных стран начали производиться и становиться доступными для медицинского применения системы POCT, предназначенные для быстрой идентификации патогенов, вызывающих инфекционные заболевания респираторного тракта и мочеполовых путей [8]. Одной из первых и, возможно, самых известных систем является GeneXpert от компании «Cepheid», которая предлагает широкий спектр диагностических решений и возможность определения до 10 генетических маркеров в 1 реакции (в последней версии устройства) с помощью методов ПЦР и ОТ-ПЦР [9]. Также стоит отметить POCT-системы других производителей, основанные на методе ПЦР (ОТ-ПЦР), такие как Roche Liat, Quidel Savanna и Biomerieux BioFire FilmaArray [10—12]. Последняя, в частности, может обнаруживать до 100 уникальных молекулярных маркеров. Помимо данных платформ, на западном рынке также представлены системы с изотермическими методами амплификации нуклеиновых кислот, такие как ID Now («Abbott») и Solana («Quidel») [13, 14]. Данные системы применяют, соответственно, подходы NEAR (Nicking Enzyme Amplification Reaction, реакция амплификации с участием никирующей ферментной системы) и HDA (Helicase-Dependent Amplification, хеликаза-зависимая амплификация). Современные POCT-системы имеют высокую чувствительность и специфичность, способны в течение 1 ч анализировать образцы (включая выделение, амплификацию и детекцию нуклеиновых кислот) и генерировать отчет. Вышеперечисленные платформы имеют разрешение FDA (Food and Drug Administration, Управление по контролю за продуктами и лекарственными средствами) на использование в медицинской практике и сертифицированы по рекомендациям CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments, поправки к законам об улучшении клинических лабораторий) как тесты с низким уровнем ошибок, вызванных действиями оператора.

В Российской Федерации на сегодняшний день наблюдается отсутствие производства и внедрения POCT-платформ, несмотря на значительные достижения в разработке и адаптации молекулярно-диагностических наборов реагентов. Эти наборы активно внедряются как в государственных, так и в частных медицинских учреждениях, что свидетельствует о растущем интересе к высокоточным методам диагностики. Учитывая текущие мировые тенденции к улучшению доступности и качества медицинской помощи, производство POCT в России могло бы существенно изменить ландшафт доступной молекулярной диагностики. Таким образом, необходимо обратить внимание на развитие разработки и производства POCT-систем, что не только повысит уровень медицинского обслуживания, но и обеспечит наше общество современными инструментами для борьбы с инфекционными заболеваниями и контроля эпидемиологической обстановки.

Цель исследования — разработка и апробация первой отечественной платформы POCT полного цикла Автоген («Троицкий Инженерный Центр», Троицк, Россия). Платформа включает одноразовый микро-флюидный картридж для выделения и амплификации нуклеиновых кислот из клинических образцов, а также анализатор для манипуляции с данным картриджем.

Материал и методы

Модельные образцы

Модельные SARS-CoV-2 образцы приготавливали путем смешивания 90 µL транспортной среды АмплиТестТСР («Амплитест», Москва, Россия) и 10 µL положительного контрольного образца из набора SARS-CoV-2 LAMP, представляющего собой РНК с частичной последовательностью гена RdRP вируса SARS-CoV-2, инкапсулированного в белковый капсид бактериофага MS2 («Амплитест», Москва, Россия).

Модельные образцы на основе назофарингеальных мазков приготавливали следующим образом: мазок из ротоглотки у человека, не имеющего симптомов респираторных заболеваний, помещали в транспортную среду АмплиТестТСР согласно рекомендациям производителя. После чего к 90 µL транспортной среды добавляли 10 µL положительного контрольного образца из набора SARS-CoV-2 LAMP («Амплитест», Москва, Россия).

RT-LAMP-анализ

Для валидации POCT-платформы Автоген экстракция нуклеиновых кислот проводилась ручным и автоматическим методами. Выделение нуклеиновых кислот из модельных образцов ручным методом производилось набором АмплиТест Магно-Сорб-Комбо («Амплитест», Москва, Россия) согласно инструкции производителя. Амплификация и детекция выделенных нуклеиновых кислот производились набором АмплиТест SARS-CoV-2 LAMP («Амплитест», Москва, Россия) методом RT-LAMP (Reverse Transcription Loop Mediated Amplification, обратная транскрипция с последующей петлевой изотермической амплификацией) с детекцией в режиме реального времени в приборе Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия), также строго следуя рекомендации производителя.

Анализ на платформе Автоген

Анализ нуклеиновых кислот автоматическим методом на платформе Автоген («Троицкий Инженерный Центр», Троицк, Россия) производили следующим образом:

а) в резервуар для лизиса вносили следующее количество реагентов из набора АмплиТест Магно-Сорб-Комбо: 500 µL лизирующего буфера Комбо, 20 µL магнитного сорбента, 10 µL буфера GT; в отмывочный резервуар 1 вносили 700 µL раствора для отмывки Комбо-1; в отмывочный резервуар 2 вносили 700 µL раствора для отмывки Комбо-2; в резервуар для элюирующего раствора вносили 100 µL элюирующего буфера; в резервуар для амплификационных реагентов вносили реакционную смесь RT-LAMP из набора АмплиТест SARS-CoV-2 LAMP, содержащую все необходимые компоненты, за исключением аликвоты с анализируемыми нуклеиновыми кислотами;

б) в собранный картридж, а именно в резервуар для биологического образца, вносилось 100 µL модельного SARS-CoV-2 образца, после чего картридж устанавливался в лоток анализатора и запускалась соответствующая программа.

Результаты и обсуждение

Конструкция картриджа

Одноразовый картридж состоит из 4 основных функциональных узлов: резервуара для внесения биологического образца, резервуаров с реагентами (лизирующий раствор, промывочные растворы, элюент, компоненты LAMP-реакции), камеры для амплификации и детекции, а также поворотного клапана. Основные элементы картриджа изображены на рис. 1. Компоненты 4, 5 и 7 (распределительная крышка, распределительное кольцо и дозатор-распределитель соответственно) образуют поворотный клапан, который попарно соединяет резервуары картриджа для выполнения необходимых стадий процесса. Герметичность узлов картриджа обеспечивается путем сваривания его компонентов с помощью ультразвуковой сварки, например основание картриджа (1) сваривается с распределительной крышкой (4), а дозатор-распределитель (7) сваривается с крышкой дозатора-распределителя (8). В свою очередь соединение подвижного поворотного клапана и поворотного штока прибора, через который также подается избыточное давление воздуха для перемещения жидкостей через клапан, герметизировано одноразовым уплотнительным кольцом (6), которое находится внутри клапана. Резервуар для амплификации (2) вмещает 25 µL реакционной смеси и заклеен прозрачной полиэтиленовой пленкой для обеспечения эффективного теплообмена с нагревательным элементом прибора и регистрирования флюоресцентного сигнала. Отверстия для сообщения внутренней атмосферы картриджа с окружающей средой оборудованы воздушными HEPA-фильтрами для предотвращения попадания содержимого картриджа во внешнюю среду. Резервуар для внесения пробы плотно закрывается крышкой-защелкой типа Эппендорф. Так как все реагенты хранятся в отдельных резервуарах, конструкция картриджа обеспечивает запирание реагентов внутри в процессе хранения, транспортировки и при проведении анализа. Компоненты картриджа изготавливаются из полипропилена методом литья под давлением.

Рис.1. Одноразовый картридж платформы Автоген для выделения, амплификации и детекции нуклеиновых кислот.

а — составные элементы одноразового картриджа: 1 — основание с резервуарами, 2 — резервуар для амплификации, 3 — капиллярные патрубки для соединения резервуаров и поворотного клапана, 4 — распределительная крышка, 5 — распределительное кольцо, 6 — уплотнительное кольцо, 7 — дозатор-распределитель, 8 — крышка дозатора-распределителя, 9 — прижимная крышка; б — фотография картриджа платформы Автоген.

Конструкция анализатора

Общий вид анализатора представлен на рис. 2. Анализатор состоит из пяти основных модулей (рис. 2, а). Лоток (рис. 2, а (1)) включает все ключевые компоненты механизации процесса выделения и амплификации нуклеиновых кислот, обеспечивая подачу картриджа в анализатор и выравнивание резервуара для амплификации с оптическим блоком. Дисплей (рис. 2, а (2)) отображает информацию о работе устройства, ходе и результатах амплификации, а также другую сопутствующую информацию. Сенсорный дисплей позволяет осуществлять управление прибором с помощью нажатий.

Рис. 2. Анализатор «Автоген».

а — схематичное изображение анализатора и его основных узлов: выдвижной лоток для фиксирования и подачи картриджа внутрь анализатора (1), сенсорный дисплей для обеспечения коммуникации между пользователем и анализатором (2), оптический модуль для регистрирования флюоресцентного сигнала из реакционного резервуара (3), насос для создания положительного давления в картридже с целью перемещения жидкостей в резервуарах (4), блок электроники (5); б — фотография анализатора и картриджа платформы Автоген; в — анализатор Автоген с открытым лотком и загруженным картриджем.

Оптический модуль (рис. 2, а (3)) представляет собой оптическую систему, совмещающую функции возбуждения и детекции флюоресценции по четырем каналам: FAM, HEX, ROX и Cy5. Прецизионный шприцевой насос (рис. 2, а (4)) обеспечивает точное дозирование жидкости внутри картриджа. Блок электроники (рис. 2, а (5)), включающий микро-ЭВМ, управляет приводами лотка, насосом и оптическим узлом прибора, а также осуществляет получение, обработку и вывод информации о ходе и результатах реакции амплификации на дисплей.

Все модули анализатора закреплены на алюминиевой платформе и защищены сверху алюминиевым корпусом с габаритными размерами 10×25×30 см (ширина, высота, глубина), как показано на рис. 2, б.

Принцип работы анализатора

Экстракция нуклеиновых кислот из биологического образца в картридже осуществляется комбинированным методом химического лизиса при повышенной температуре с последующей адсорбцией/десорбцией на покрытых оксидом кремния магнитных частицах и в присутствии хаотропных агентов [15]. С этой целью для нагрева жидкости в лотке предусмотрено два нагревательных элемента. Первый нагревательный элемент производит нагрев резервуара для лизиса микроорганизмов до 60 °C. Установленный в лоток подвижный магнит позволяет производить осаждение магнитных частиц на стенках резервуара с целью смены промывочных и элюирующего растворов. Объединение элюата с LAMP-реакционной смесью с последующим переносом в резервуар для амплификации, подогреваемый вторым нагревающим элементом до 56 °C, инициирует процедуру амплификации. Оптический узел, расположенный над амплификационным резервуаром, регистрирует интенсивность флюоресценции в заданном канале в режиме реального времени. По окончании амплификации на дисплей анализатора выводится результат-отчет о результатах анализа, включающий график накопления флюоресцентного сигнала. По желанию пользователя результат может быть сохранен или передан на другое устройство по сети Интернет или на USB-накопитель.

Апробация платформы Автоген

Апробация платформы Автоген была разбита на два этапа: оценка эффективности выделения нуклеиновых кислот в картридже путем сравнения с ручным форматом выделения при использовании идентичных реагентов и первичная демонстрация полного цикла анализа, включающего выделение, амплификацию и детекцию синтетической РНК SARS-CoV-2 из модельных биологических образцов.

Автоматическое выделение нуклеиновых кислот из биологических образцов представляет собой сложный технический процесс, требующий прецизионного манипулирования жидкими реагентами, их точного дозирования и нагревания, а также осаждения и ресуспендирования магнитных сорбентов. Часто биологические образцы обладают повышенной вязкостью и могут содержать труднорастворимые тканевые сгустки или преципитаты, что ужесточает критерии конструирования [16]. В результате проведение любой из стадий процесса выделения в субоптимальных условиях может сказаться негативно как на выходе нуклеиновых кислот, так и на наличии ингибиторов в элюате. Следует подчеркнуть, что ингибирующий эффект может быть также обусловлен остатками в элюате хаотропных солей и/или этанола — ключевых реагентов, используемых для выделения и очистки нуклеиновых кислот в современных методах.

На первом этапе апробации платформы Автоген сравнивалось качество выделения РНК ручным методом с использованием набора АмплиТест Магно-Сорб-Комбо («Амплитест», Москва, Россия) и автоматизированным методом в картридже платформы Автоген, применяя те же реагенты. Это позволит оценить эффективность и надежность автоматизированного подхода по сравнению с традиционным ручным методом, а также выявить возможные преимущества и недостатки каждого из них в контексте выделения РНК. При автоматизированном выделении в картридже программа анализа была прервана после стадии элюции, и элюат был отобран из соответствующего резервуара. Данный препарат нуклеиновых кислот и препарат, полученный при ручном выделении, были проанализированы методом RT-LAMP на приборе Rotor-Gene Q. На рис. 3, а отображена кинетика накопления флюоресцентного сигнала: светлые кривые соответствуют ручному методу выделения, а темные — автоматическому. Результаты показали, что автоматическое выделение привело к незначительно меньшему выходу нуклеиновых кислот с разницей времени достижения порогового уровня флюоресценции не более 16 с. Однако стоит отметить, что автоматизированный процесс существенно сократил общее время эксперимента: с 40 мин для ручного метода до 15 мин для автоматического, и, что наиболее важно, вовлеченность оператора уменьшилась с 40 мин для ручного метода до <1 мин для автоматического (включая внесение образца). Эти результаты подчеркивают преимущество автоматизации в контексте сокращения времени и повышения удобства работы оператора.

На втором этапе апробации был проведен полный цикл анализа, включающий выделение, амплификацию и детекцию синтетической РНК SARS-CoV-2 из модельных биологических образцов. Кинетика накопления сигнала амплификации в результате полного цикла анализа модельного биологического образца SARS-CoV-2 с использованием POCT-платформы Автоген представлена на рис. 3, б. График демонстрирует наличие кривой накопления сигнала, что свидетельствует об успешном выделении РНК, амплификации и детекции продукта реакции. Сравнение кривых на рис. 3, а и б позволяет заключить, что результаты полного цикла анализа сопоставимы с результатами, полученными как при полностью ручном выделении с последующей амплификацией на коммерчески доступном ПЦР-оборудовании (Rotor-Gene Q), так и при использовании двухстадийной методики, где выделение происходит в автоматическом режиме в картридже, а амплификация выполняется в том же анализаторе в амплификационном резервуаре.

Рис. 3. Кинетика накопления флюоресцентного сигнала при: (а) ручном выделении РНК (серые кривые) и автоматическом выделении РНК в картридже платформы Автоген (черные кривые) с последующей амплификацией и детекцией в амплификаторе Rotor-Gene Q методом RT-LAMP и (б) полностью автоматическом выделении РНК, амплификации и детекции на платформе Автоген.

Способность картриджа к выделению и амплификации нуклеиновых кислот из реального клинического материала была проверена на трех модельных образцах, приготовленных с использованием назофарингеальных мазков, взятых у волонтеров, не проявляющих клинических симптомов респираторных заболеваний. Мазки также были проверены на отсутствие вируса SARS-CoV-2 (данные не показаны). К мазкам, помещенным в транспортную среду, был добавлен положительный контрольный образец из набора реагентов SARS-CoV-2 LAMP, как описано выше. Далее анализ на системе Автоген производился в полностью автоматическом режиме без участия оператора.

На рис. 4 представлена кинетика накопления флюоресцентного сигнала, получаемого на стадии амплификации и детекции. S-образная кривая была зарегистрирована для всех трех образцов, что свидетельствует о том, что все этапы анализа (выделение РНК, ее амплификация и детекция) были успешно проведены в картридже разработанной системы.

Рис. 4. Кинетика накопления флюоресцентного сигнала стадии амплификации и детекции полного цикла анализа нуклеиновых кислот, проведенного на платформе Автоген.

Модельные образцы, содержащие положительный контрольный образец из набора реагентов SARS-CoV-2 LAMP, были приготовлены с использованием назофарингеальных мазков, взятых у волонтеров, не проявляющих клинических симптомов респираторных заболеваний.

Следует отметить, что полностью автоматизированный цикл анализа на платформе Автоген занимает не более 35 мин. Время распределяется следующим образом: 1 мин на внесение образца и загрузку картриджа в прибор, 15 мин на выделение нуклеиновых кислот и 17 мин на RT-LAMP-амплификацию с детекцией в режиме реального времени. Этот подход не только сокращает общее время процесса по сравнению с ручными и полуавтоматическими методами, но и значительно снижает вероятность ошибок, связанных с человеческим фактором.

Заключение

В свете недавних пандемий, таких как COVID-19, а также с учетом потенциальных новых угроз, включая болезни X и оспу обезьян (Mpox), интеграция POCT в систему здравоохранения становится не просто желательной, а жизненно важной. Эта интеграция может значительно повысить устойчивость системы здравоохранения за счет сокращения времени диагностики и снижения ошибок, связанных с человеческим фактором. Такие улучшения критически важны для эффективного сдерживания распространения инфекций и реализации адекватных мер профилактики.

Представленная в данной работе первая отечественная система POCT Автоген продемонстрировала свои эффективность и соответствие современным требованиям к POCT-системам на модельных биологических образцах, включая образцы, приготовленные на основе назофарингеальных мазков человека. Следующий шаг на пути к регистрации системы как медицинского изделия и ее внедрению в клиническую практику заключается в проведении мультицентрового исследования с использованием реального клинического материала. Исследование будет сосредоточено на определении клинической специфичности и чувствительности системы, что позволит не только подтвердить ее эффективность, но и обеспечить необходимую надежность результатов диагностики в реальных условиях.

Участие авторов:

Разработка и создание автоматической POCT-платформы картриджного типа — Пономарев В.А. (20%)

Проведение экспериментальной части, написание и правка текста статьи — Спудулите В.Г. (20%)

Написание и правка текста статьи, подбор литературы по теме исследования — Тарасова Ж.Е. (20%)

Разработка и создание автоматической POCT-платформы картриджного типа — Горский Е.В. (20%)

Написание и правка текста статьи, подбор литературы по теме исследования — Ходаков Д.А. (20%)

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.