Выявление вируса оспы обезьян методом иммуноферментного анализа в бесприборном формате и после инактивации его формальдегидом

Ортопоксвирусы высоко устойчивы к влиянию различных физических и химических факторов [1]. Два из них, а именно вирусы натуральной оспы (ВНО) и оспы обезьян (ВОО) относятся к группе самых опасных патогенов [2].

В прошлом они часто вызывали вспышки и даже эпидемии. В 1980 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила об элиминации натуральной оспы благодаря тотальной вакцинации, которая тогда же и прекратилась [3]. К настоящему времени обеспечиваемый ей специфический иммунитет против всех ортопоксвирусов снизился в мире настолько, что другие заболевания, в частности оспа обезьян, стали фиксироваться все чаще.

ВОО генетически разделен на Центральноафриканскую (I) и Западноафриканскую (II) клады вариантов a и b. В мае 2024 г. в Африке произошла вспышка оспы обезьян, вызванная кладой IIb. К 1 октября 2024 г. 14 стран сообщили о 35 517 предполагаемых и лабораторно подтвержденных случаях заболевания, в том числе о 996 предполагаемых и подтвержденных случаях смерти (2,8%) [5].

Распространение оспы обезьян привело к международной проблеме координации противодействия. С января 2022 г. ВОЗ занимается такой координацией. В РФ за противодействие распространению оспы обезьян ответственна Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Роспотребнадзор и оперативно противодействует распростанению оспы обезьян [6].

Идентификация возбудителя осуществляется методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР), а доставка в лабораторию образца от больного с подозрением на оспу обезьян осуществляется без инактивации с соблюдением строгих мер предосторожности. Таким образом, существует потребность в первичной диагностике «у постели больного» и в инактивации пробы с вероятным содержанием ВОО при транспортировке. Но при этом единственным надежным способом инактивации ортопоксвирусов считается обработка формальдегидом.

Для подтверждения случаев оспы обезьян возможно выявление антигенов возбудителя методом ИФА. Мы разработали экспериментальную тест-систему, которая специфично выявляет ВОО в инактивированных формальдегидом образцах включая бесприборный формат «у постели больного», по чувствительности обеспечивая подтверждение результатов ПЦР.

Получение инактивированных нативных антигенов ВОО и вируса осповакцины (ВОВ). Процесс подробно изложен в ранних публикациях [7].

В аликвоте вируссодержащей жидкости определяли титр. Титрование проводили методом бляшкообразования в 24-луночных планшетах. Титр вируса выражали в БОЕ/мл [8].

КВЖ обоих препаратов делили на две части. Одну часть исследовали в нативном виде, вторую инактивировали формальдегидом. Для инактивации части препаратов ВОО и ВОВ вирус высаживали в осадок при центрифугировании 14 000 g. Супернатант замещали на равный объем 4%-го раствора формальдегида, меняя однократно в течение 2 сут при температуре от 4 до 6 °C. Через 2 сут от начала фиксирования образца его считали обеззараженным. Перед исследованием супернатант инактивированных образцов после центрифугирования в течение 15 мин 14 000 g замещали на равный объем физраствора. Аликвоты ВОО и ВОВ хранили при минус 70 °C до однократного размораживания для проведения сравнительного ИФА.

Приготовление реагентов и процедура анализа тест-системы ИФА для выявления антигена ВОО. Процедура проведена на иммуносорбенте (ИС) с сорбированными поликлональными антителами (ПКАТ) из сыворотки крови иммунизированного препаратом ВОВ кролика. ПКАТ сорбировали в лунках 96-луночного планшета для иммунологических реакций (Nunc MaxiSorp), разводя до конечной концентрации 0,03 мг/мл 0,01М раствором натрия углекислого и внося по 100 мкл/лунку. После инкубации при температуре 22±5 °C в течение 18 ч жидкость аспирировали и блокировали 0,1% казеином (Serva). После 2 ч инкубации при температуре 22±5 °C жидкость аспирировали и высушивали при тех же условиях в течение 18 ч.

В лунки ИС вносили по 100 мкл раствора для разведения образца (РО, 0,1%-ого раствора казеина пр-во Serva) и добавляли в трех повторах по 100 мкл исследуемых образцов. Препараты ВОО разводили в промывочном растворе ФСБ-Т перед анализом серией двукратных последовательных разведений с 1:2 до 1:256. В качестве отрицательного контроля использовали аналогичное разведение препарата ВОВ. ИФА проводили по двум процедурам: в формате «у постели больного» в лабораторном инструментальном формате.

После инкубации при 22±5 °C/37 °C в течение 60/30 мин лунки ИС отмывали трехкратно добавлением по 300 мкл/лунку промывочного раствора (ФСБ-Т). Для выявления антигена использовали пероксидазный конъюгат моноклональных антител (МКАТ) A29L-7 к уникальному для ВОО антигену белка A29L [7]. Его вносили по 100 мкл, разведенного 1:5000 в ФСБ-Т. После инкубации при 22±5 °C/37 °C в течение 30/30 мин лунки ИС отмывали десятикратно раствором ФСБ-Т и вносили по 100 мкл хромогена ТМБ для визуализации образовавшихся иммунных комплексов. Через 15 мин выдерживания при 22±5 °C/37 °C реакцию останавливали внесением 50 мкл/лунку 1М раствора серной кислоты. Результаты учитывали при ИФА в формате «у постели больного» визуально в терминах «положительный» или «отрицательный», выявляя отличие цветовой окраски в лунках с одинаковыми разведениями исследуемых и контрольных отрицательных образцов. Выраженные в «+» и «–» результаты анализа использовали для определения титра препарата в данном повторе. Им считали наибольшее разведение, давшее положительный результат. Результаты учитывали при ИФА в лабораторном инструментальном формате на планшетном ридере при длине волны 450 нм. Результаты анализа, выраженные в оптических единицах оптической плотности раствора в лунках ИС (ОП, о.е.), использовали для определения титра препарата в данном повторе. Им считали наибольшее разведение, ОП которого минимум в 4 раза превышала усредненную ОП отрицательного контроля в этом же разведении. По результатам учета обоих форматов титры трех повторов усредняли.

Определение диагностических свойств нативного и инактивированного формальдегидом препаратов ВОО в бесприборном ИФА. Сравнивали титры препаратов нативного и инактивированного растворов ВОО. В качестве отрицательного контроля использовали разведения нативного препарата ВОВ.

Определение чувствительности выявления инактивированного антигена ВОО. Определяли чувствительность выявления инактивированного препарата ВОО сравнивая полученные в одном формате постановки титры по результатам ИФА.

Статистическая обработка. Результаты работы подвергались статистической обработке стандартными методами с оценкой достоверности отличий при 5%-ом уровне значимости вероятности ошибки (p≤0,05) для 95%-го доверительного уровня (I95) [9].

Получение инактивированных нативных антигенов ВОО и ВОВ. Были определены инфекционные титры стоковых растворов. Титр ВОО составил 4,1·10⁶ БОЕ/мл. Титр ВОВ составил 1·10⁸ БОЕ/мл и препарат был разбавлен физраствором до титра 4·10⁶ БОЕ/мл. В ИФА при разведении препарата чувствительность выражали в титрах, привязывая ее к величине инфекционного титра неразведенного препарата 4·10⁶ БОЕ/мл. Препараты КВЖ были инактивированы формальдегидом как описано выше.

Определение диагностических свойств нативного и инактивированного формальдегидом препаратов ВОО в бесприборном ИФА. Реакция ИФА проводилась по описанной выше методике в формате «у постели больного». Результаты исследования представлены в табл. 1.

Таблица 1. Сравнение чувствительности выявления нативного и инактивированного формальдегидом препаратов ВОО и ВОВ в бесприборном ИФА

Установлено, что значения логарифмов среднегеометрического обратных титров (lgОТ) инактивированного (2,3) и не инактивированного препаратов ВОО (0,4) статистически отличаются (±0,4). Доверительные интервалы lgОТ не перекрываются. Инактивированный препарат в бесприборном формате ИФА выявляется слабее нативного аналога из-за потерь части вирусных частиц в ходе инактивации.

Определение чувствительности выявления инактивированного антигена ВОО. Чувствительность выявления двумя форматами ИФА инактивированного антигена приведена в табл. 2.

Таблица 2. Чувствительность выявления двумя форматами ИФА инактивированных антигенов ВОО и ВОВ

Значения lgОТ подтверждают возможность компенсации потери чувствительности выявления инактивированного ВОО использованием оборудования.

В настоящее время разработаны экспериментальные методы детекции ВОО по антигену, в основном по A29L. Используется как иммунофлуоресценция [10] так и CRISPR/Cas12a сенсоры [11], но детектируется рекомбинантная конструкция а не вирусная частица. Коллегами из Бостона (США) было проведено наиболее близкое к нашему исследование по детекции именно вирусных частиц ВОО [12] методом оптической детекции по конечной точке и в инструментальном ИФА. Им удалось выявить инактивированный прогреванием ВОО с уровнем чувствительности 2·10³ БОЕ/мл и 1,8·10³ БОЕ/мл соответственно. Но термическая инактивация потребовала подтверждения тремя пассажами на чувствительной культуре, заняв более двух недель. А также вариант «у постели больного» не рассматривался.

Нами решена задача бесприборного выявления нативного антигена ВОО, чувствительность диагностического метода по инфекционному титру составила 1,97·10⁴ БОЕ/мл с максимально возможным отличием от чувствительности выявления инактивированного антигена ВОО в 100 раз.

Утвердительный ответ на вопрос о возможности выявления антигена ВОО методом ИФА с использованием приборной базы диагностической лаборатории в инактивированном формальдегидом препарате получен. Чувствительность диагностического метода по инфекционному титру составила 2,48·10⁴ БОЕ/мл с максимально возможным отличием от чувствительности выявления бесприборным способом в 100 раз.

Перспективой дальнейшей работы является сравнение чувствительности описанных форматов ИФА с результатами ПЦР по выявлению ДНК ВОО в образцах идентичного происхождения, а также корреляции величин чувствительности методов.

В целях дифференциальной диагностики возможно подтверждение случаев заболевания оспой обезьян при анализе в ИФА на месте нативного препарата или анализе доставленного в лабораторию обработанного формальдегидом препарата антигена ВОО.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ГЗ-34/21 ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (номер государственного учета НИР Рег. № 121033100069-4).

Соблюдение этических стандартов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов исследований.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.