Введение

Основным этиологическим агентом рака шейки матки является вирус папилломы человека (ВПЧ). Состояние иммунной системы имеет большое значение при инфицировании ВПЧ. Клиническая форма инфекции ВПЧ зависит также от иммунного статуса инфицированного, важную роль в борьбе с ВПЧ-инфекцией играет врожденный и адаптивный иммунитет [1, 4].

В процессе эволюции папилломавирусы (ПВ) приобрели биологические и иммунологические особенности, необходимые для их облигатного эпителиотропного жизненного цикла. ПВ одни из представителей онкогенных вирусов с двухцепочечной ДНК без оболочки с геномом, кодирующим ранние (E) и поздние (L) белки. Первичная инфекция базальных эпителиальных клеток, спровоцированная микротравмой, позволяет вирусу сохраняться в базальных клетках. Репликация вируса тесно связана с дифференцировкой многослойных эпителиальных слоев. Продукция капсидных белков L1 и L2 и инкапсуляция вирусного генома происходят только в верхних слоях эпителия, далее собранные инфекционные вирионы сбрасываются с отслоившимися клетками поверхностного эпителия. Персистенция ВПЧ в локальном очаге инфекции, в условиях отсутствия системной виремии, ограничивают доступ антигенпрезентирующих клеток и обеспечивает нелитический цикл репликации вируса [1].

При попадании ВПЧ в организм активируются защитные функции врожденного иммунитета. Распознавание антигенов происходит с помощью толл-подобных-рецепторов (TLR4, TLR7, TLR8, TLR9), расположенных на — клетках Лангерганса, макрофагах и других иммунных клетках [2]. При продолжающейся персистенции вируса в регионарных лимфоидных органах, происходит презентация ДК антигенов вируса клеткам адаптивной иммунной системы, которые становятся ответственными за уничтожение вируса инфицированных эпителиальных клеток шейки матки. При этом возможен и местный иммунный ответ, который развивается с участием ДК непосредственно в слизистой оболочке шейке матки. ВПЧ обладает способностью ускользать от эффекторных механизмов иммунной системы, данный процесс обусловлен локальной иммуносупрессией, а также отсутствием виремии и выраженного цитолиза [3]. Известна способность ВПЧ тормозить миграцию и активацию клеток Лангерганса[4].

Взаимосвязь между характером инфекционного процесса и состоянием врожденного и приобретенного иммунитета, уровнем экспрессии цитокинов вызывает большой интерес для ранней лабораторной диагностики инфицирования вирусом папилломы человека, особо актуальна эта проблема для пациентов с иммунодефицитами при инфицировании онкогенными типами ВПЧ [5].

Важную физиологическую функцию, в частности активацию клеток иммунной системы на воздействие патогена, выполняют цитокины. В настоящее время уделяется большое внимание роли цитокинов, в частности интерлейкинов (IL) и интерферонов (IFN) в реализации регуляторных иммунологических процессов [6].

Интерлейкины включаются во все этапы системного и локального иммунологического ответа: распознавание и презентация антигенов; активация и миграция иммунокомпетентных клеток к участку воспаления; дифференцировка и пролиферация клонов эффекторных клеток [7].

Показано достоверное увеличение провоспалительных цитокинов IL-8 и IL-2 и снижение противовоспалительного IL-10 при исследовании локального иммунного ответа на ВПЧ высокого канцерогенного риска в цервикальной слизи у женщин и эякуляте у мужчин. По данным литературы, отмечалась низкая концентрация провоспалительных IL-1β, IL-18 и фактора некроза опухоли (TNF-a). Значение IFN-g у инфицированных ВПЧ пациентов превышало нормальный уровень, а содержание IFN-a практически не отличалось [8]. По другим данным [9], белки Е6 и Е7 ВПЧ способны угнетать синтез интерферонов, блокируя при этом ядерный транскрипционный фактор NF-κB. Помимо участия в противовирусном ответе, цитокины играют роль в процессе реализации апоптоза. Ключевую роль в регуляции апоптоза отводят IL-1β [10].

Таким образом, способность вирусных пептидов оказывать влияние на продукцию цитокинов, способствует длительной персистенции ВПЧ, снижает возможность элиминации вируса, угнетает процесс апоптоза, что приводит к развитию интраэпителиальных поражений.

Для экспериментальной оценки медиаторов воспалительного процесса, реагирующих на внедрение ВПЧ в организм была выбрана модель ДК.

ДК являются источниками цитокинов: IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, на разных этапах принимающих участие в реализации иммунного ответа на ВПЧ.

ДК являются ключевым звеном в иммунном ответе на патоген. Они способны представить антиген в переработанном виде с соответствующими молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC-II или MHC-I) T-наивным или T-цитотоксическим клеткам соответственно, индуцируя тем самым антигенспецифические B- и T-клеточные ответы. Помимо антигенспецифической презентации, зрелые дендритные клетки посылают цитокиновые сигналы T-клеткам, необходимые для дифференцировки T-наивных клеток в Th1 и Th2. Нарушение баланса цитокинпродуцирующей активности Th1 и Th2 является существенным фактором в хронизации инфекций [11].

Цель настоящего исследования — изучение цитокинового профиля ДК в ответ на стимуляцию ВПЧ 16 типа. В качестве вирус-специфического стимулятора ДК нами был выбран вирусный антиген (консервативный участок минорного капсидного белка L2, содержащий с 17 по 36 аминокислотные остатки), который может индуцировать низкотитражные антитела с широкой перекрестной нейтрализацией гетерологичных типов ВПЧ и способен обеспечить перекрестную защиту в моделях заражения животных [12—14].

Материал и методы

Биоматериал получали путем венепункции 72 доноров крови (женщины возрасте 22±5 лет). Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли по методу A. Boyum [15], Полученную кровь разводили физиологическим раствором 1:1 и осторожно наслаивали на градиент фиколла-урографина плотностью 1,077 г/мл в соотношении 1:3. Центрифугировали 40 мин при скорости 1500 об/мин. Дважды отмывали полученную взвесь фосфатно-солевым буфером (ФСБ). Через 2 ч культивирования в культуральном матраце при 37 °C с 5% CO₂ отмывали неприкрепившиеся клетки. Прикрепившийся слой МКПК смывали трипсин-версеном, затем отмывали ФСБ и доводили до концентрации 5×10⁶/мл лейкоцитов в полной среде DMEM с L-глутамином и гентамицином 40 мкг/мл. Для получения ДК, вносили цитокины с концентрацией 72 нг/мл GM-CSF и 50 нг/мл IL-4 на 1, 3 и 7-е сутки культивирования, далее в культуру ДК вносили синтезированный свободный пептид L2 ВПЧ 16 в концентрации 250 и 50 нг/мл, время экспозиции от 1 до 3 сут. Фенотипирование ДК по CD80, CD86, HLA-DR проводили на проточном цитометре FACS Canto II (BD, США), с использованием моноклональных антител (BioLegend, США). Концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов: IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-a, IFN-γ; TNF-a; моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-I) определяли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем АО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Статистическую обработку данных проводили с помощью программы SPSS, используя параметрический метод оценки значимости различий средних величин критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

При активации иммунной защиты как локального, так и системного характера, цитокины координируют работу клеток. Определение уровня концентрации цитокинов, синтезированных ДК, позволяет оценить их функциональную активность. Для определения уровня продукции цитокинов ДК в культуре определяли спонтанную и индуцированную (в частности, на синтезированный пептид L2 белка ВПЧ 16) их концентрацию. Сниженная индуцированная продукция цитокинов в ответ на стимул может служить одним из признаков формирования иммунодефицитного состояния.

При внесении пептида L2 ВПЧ 16 было выявлено несколько вариантов реагирования цитокиновой продукции ДК на синтезированный пептид: с увеличением концентрации цитокина (1-я группа), без достоверно значимого изменения концентрации цитокина (2-я группа), со снижением концентрации цитокина (3-я группа).

В 2-ю группу реагирования вошли MCP-I, IL-1β, IL-6, IL-10, IFN-α, TNF-α. Во 2-ю группу вошли IL-4 и IL-8. К 3-й группе реагирования были отнесены IFN-γ и IL-2 (см. таблицу).

Цитокиновый ответ на воздействие белком ВПЧ L2

Примечание. Значения достоверности отличий от спонтанного ответа * — p<0,05; ** — p<0,01;*** — p<0,001.

Наилучшую реактивность к пептиду L2 ВПЧ 16 показал MCP-I. В 100% проб произошел выброс хемоаттрактанта в ответ на внесение L2 пептида ВПЧ 16. Значимое увеличение концентрации в 2 и более раз наблюдалось в 80% проб. Примечательно, что уровень реагирования MCP-I на меньшую концентрацию L2 (50 нг/мл) был выше, чем к большей концентрации пептида (250 нг/мл). MCP-I известен как моноцитарный хемотаксический фактор, в большом количестве синтезирующийся макрофагами. Именно поэтому MCP-I играет важную роль в патогенезе многих заболеваний, сопровождающихся мононуклеарной инфильтрацией тканей. MCP-I способен привлекать в зону повреждения не только моноциты, но и T-лимфоциты (CD4+, CD8+) и базофилы. И именно от активности этого фактора зависит тип реагирования и количество рекрутированных в очаг воспаления клеток. В отношении MCP-I по данным нашего эксперимента, показано активное реагирование на ДК пептид вируса (увеличение показателя в 2—3 раза), создающее предпосылки для хорошей миграции клеток в очаг поражения.

Менее выраженным был ответ IL-1β и IL-6. В данном эксперименте мы получили повышение концентрации указанных цитокинов в 2,8 раза на внесение 50 нг/мл L2 ВПЧ 16 и в 2 раза на внесение пептида с большей концентрацией 250 нг/мл. Таким образом, выявлена зависимая от концентрации пептида L2 ВПЧ 16 продукция ДК антиапоптотического цитокина IL-1β и IL-6, который многие исследователи связывают с иммуносупрессией иммунного ответа T-регулярными лимфоцитами [10].

Значимым является тот факт, что в ответ на стимуляцию вирусным пептидом L2 ВПЧ 16 ДК увеличивают синтез противовоспалительного цитокина IL-10: при более низкой концентрации L2 (50 нг/мл) — в 2,9 раза, при более высокой (250 нг/мл) в 1,5 раза по сравнению с контролем без стимуляции. Выявленные нами совокупные изменения продукции IL-1β, IL-6, IL-10 в ответ на стимуляцию ДК L2 пептидом in vitro, вероятно, позволяют вирусу в организме — поляризовать иммунный ответ и сформировать очаг воспаления с низкой степенью активности и обеспечить его длительную персистенцию [16].

На фоне стимуляции вирусным пептидом L2 ВПЧ 16 отмечено угнетение синтеза провоспалительного IL-2. Клетками — мишенями IL-2 являются натуральные киллеры, моноциты, активированные T-лимфоциты. Концентрация IL-2 влияет на баланс Th1 и Th2, активирует T-клеточную цитотоксичность [17].

Однотипными были изменения IL-4 и IL-8: в ответ на низкие концентрации L2 пептида ВПЧ 16 (50 нг/мл) реакции со стороны цитокинов не наблюдалось, а при повышении концентрации вирусного пептида до 250 нг/мл отмечалась тенденция к угнетению выработки этих провоспалительных цитокинов.

Увеличение концентрации TNF-α в 18 раз (при стимуляции 50 нг/мл L2) и в 33 раза (при стимуляции 250 нг/мл L2) было получено в ответ на стимуляцию пептидом ВПЧ. Данные изменения TNF-α являются значимыми, т.к. в случае инфицирования эпителиальных клеток цервикса ВПЧ 16 и 18 типов этот цитокин может способствовать пролиферации пораженных клеток [17].

Полученные нами результаты подтверждают способность ВПЧ уклоняться от противовирусной иммунологической защиты путем изменения синтеза ряда цитокинов, что согласуется с известными данными о супрессивном воздействии ранних онкогенных белков ВПЧ Е6 и Е7 как на врожденный, так и на адаптивный иммунный ответ [9].

В ответ на действие минорного капсидного протеина L2 мы получили данные об угнетении продукции ДК IFN-γ, который обуславливает активирующее действие на клетки иммунной системы. Такие разнонаправленные изменения в интерфероновом звене сказываются на качестве противовирусного ответа. Благодаря свойствам модифицировать интерфероновый ответ ВПЧ способен к длительной персистенции в организме хозяина с последующей онкогенной трансформацией.

Выводы

1. В супернатантах клеточных культур ДК на внесение синтезированного пептида L2 ВПЧ 16 для различных цитокинов обнаружены 3 варианта ответа: без изменения продукции цитокина IL-4, IL-8, с усилением IL-1β, IL-6, MCP-I, TNF-α и с угнетением секреции IL-2.

2. Вариант реагирования зависит от концентрации вирусного пептида L2. В вариантах IL-1β, IL-6, MCP-I, IFN-α, TNF-α выявлена прямая, в вариантах IL-10, IFN-γ обратная зависимость от концентрации. Дозозависимый ответ показывает ведущую роль вирусной нагрузки в трансформации противовирусного иммунитета.

Выявленный дисбаланс соотношения про- и противовоспалительных цитокинов в ответ на внесение пептида L2 ВПЧ 16 в культуру ДК приводит к депрессии воспалительного ответа, формированию иммунодефицитного состояния и персистенции вируса.

4. Полученные данные об особенностях иммунного ответа на ВПЧ могут быть использованы, для ранней лабораторной диагностики заражения ВПЧ и могут быть применимы при комплексном клинико-лабораторном обследовании пациентов.

Работа выполнена по теме из Плана НИР ЕНИИВИ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, №гос. регистрации 122040600157-0.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.