Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.
Молекулярные механизмы активации гемостаза при COVID-19 на госпитальном этапе
Журнал: Лабораторная служба. 2021;10(4): 25‑29
Прочитано: 1141 раз
Как цитировать:
Клетки крови не являются стабильными структурами, раз и навсегда сформированными на период жизни в сосудистом русле. Множество морфофункциональных событий происходит с ними с момента выхода в периферическую кровь и до времени элиминации. Многие из этих событий, в частности образование микровезикул, имеют прямое отношение к процессам свертывания крови.
Процессы микровезикуляции давно находятся в поле зрения исследователей. Одним из первых обратил внимание на них выдающийся советский и российский ученый Д.М. Зубаиров. Свои наблюдения и выводы он обобщил в монографии «Микровезикулы в крови. Функции и их роль в тромбообразовании» [1]. Дальнейшие работы отечественных и зарубежных исследователей подтвердили роль микровезикуляции в качестве одного из молекулярных механизмов активации гемостатических реакций и значение в гиперкоагуляции и тромбозе [2—6].
Коронавирусная инфекция, вызвавшая пандемию начиная с 2019 г., тесным образом связана с нарушениями свертывающей системы, активация которой определяет как тяжесть течения заболевания, так и фатальные осложнения. Механизмы COVID-опосредованной коагулопатии продолжают изучаться. Одним из таких молекулярных механизмов являются процессы микровезикуляции клеток (см. рисунок на цв. вклейке) [7]. Отделившиеся микровезикулы (МВ) принимают участие в межклеточной передаче сигнала путем слияния с клеткой-реципиентом, в которую поступает молекулярное содержимое МВ. Одновременно МВ являются активными участниками коагуляционных процессов, формируя значительную по площади дополнительную поверхность для гемостатических реакций и активируя их за счет представительства на мембране, полученной у клетки-донора тканевого фактора, Р-селектина, фактора Виллебранда и массы других активных молекул. Воспалительный ответ, иммунные реакции, непосредственное воздействие вируса, гипоксия тканей при COVID-19 способствуют активному образованию МВ.
Разновидности, биогенез, молекулярный состав и взаимодействия внеклеточных везикул.
Выделены экзосомы, происходящие из эндосомальных структур и являющиеся самыми мелкими образованиями (40—180 нм), эктосомы, также называемые микровезикулами (MB), образуются при почковании плазматической мембраны (100—1000 нм), апоптотические тельца — большие везикулы, происходящие из мембран в процессе апоптоза клеток. Обозначены процессы экзоцитоза, эндоцитоза, слияния (fusion) и рецептор-опосредованного эндоцитоза (по A. Georgescu, M. Simionescu, 2021, в модификации [7]).
Однако выраженность этих процессов в зависимости от степени тяжести течения заболевания и связь с клиническими проявлениями тромбозов остается недостаточно понятной. Все вышесказанное определило цель нашего исследования.
Цель исследования — определение характера и количества микровезикул клеток крови и эндотелия у больных с COVID-19 среднетяжелого течения, госпитализированных в стационар.
В исследование были включены пациенты (средний возраст 58±2 года, 60% мужчин и 40% женщин), госпитализированные в клинику СЗГМУ им. И.И. Мечникова в связи со среднетяжелым течением COVID-19 и поражением легких 2-й степени по данным компьютерной томографии, которые получали стандартную терапию в соответствии с Временными методическими рекомендациями Минздрава России (n=43) [8]. Клинически и с помощью визуализирующих методов обследования ни у одного пациента не обнаружено в ходе госпитализации тромбоэмболических осложнений.
В качестве контрольной группы были выбраны 14 человек (средний возраст 39±4 года, 40% мужчин и 60% женщин) без признаков острой респираторной инфекции на момент исследования, не имеющие обострения хронических заболеваний, не курящие и не принимающие эстрогенсодержащие препараты, без тромбозов и сосудистых событий в анамнезе. Пациенты и лица контрольной группы, включенные в исследование, дали информированное согласие.
Все пациенты были обследованы в соответствии с Временными методическими рекомендациям Минздрава России [8]. Им был выполнен клинический и биохимический анализ крови, исследован уровень D-димера, определялся C-реактивный белок (СРБ) и сывороточный ферритин.
Всем лицам, включенным в исследование, было измерено содержание микровезикул разного клеточного происхождения на проточном цитометре Cytomics FC-500 («Beckman Coulter», США) с помощью набора реагентов Exo-FACS («HansaBioMed Life Sciences», Эстония) и флюоресцентно меченных антител для идентификации микровезикул тромбоцитарного (CD41), лейкоцитарного (CD45), эритроцитарного (CD235a) или эндотелиального (CD146) происхождения. Пробоподготовка и методика измерения описаны нами ранее [4].
Включенные в исследование лабораторные показатели оценивались не менее 2 раз. Для анализа использовали результаты, полученные в 1-й день госпитализации и через 10—14 дней. Полученные результаты подверглись статистической обработке с помощью программного пакета Statistica 10 for Windows («StatSoft, Inc.», США). Количественные характеристики представлены в виде медианы, 25 и 75 перцентиля (Me [Q1—Q3]). Для сравнения двух независимых переменных использовали тест Манна—Уитни, корреляции между показателями определяли по Спирмену. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.
Результаты клеточного анализа периферической крови представлены в табл. 1. Вполне закономерным для среднетяжелого течения COVID-19 представляются умеренная тромбоцитопения, лимфопения и более низкое, чем в контрольной группе количество эозинофилов. В ходе наблюдения на фоне проводившейся терапии и постепенного улучшения состояния количество лейкоцитов увеличилось и стало статистически отличаться от контрольной группы за счет восстановления количества лимфоцитов, нарастания количества моноцитов и нейтрофилов. Количество эритроцитов не изменилось и не отличалось от контроля как при поступлении, так и во второй точке измерения. Сохранялась тенденция к эозинопении.
Таблица 1. Клеточные элементы периферической крови у пациентов с COVID-19 и в группе контроля
| Показатель | COVID-19 День 1-й | COVID-19 День 10—14-й | Контроль |
| WBC, ×109/L | 5,4 [4,3—6,9] | 8,8 [5,6—14,3]* | 5,9 [4,7—7,2] |
| NE, ×109/L | 3,6 [2,7—5,3] | 6,5 [3,1—11,4]* | 3,0 [2,5—4,5] |
| LY, ×109/L | 1,0 [0,9—1,4]* | 1,4 [1,2—2,1] | 1,9 [1,4—2,0] |
| MO, ×109/L | 0,5 [0,4—0,6]† | 0,8 [0,6—0,9]* | 0,5 [0,4—0,5] |
| EO, ×109/L | 0,0 [0,0—0,0]* | 0,01 [0,0—0,07]* | 0,1 [0,1—0,2] |
| BA, ×109/L | 0,0 [0,0—0,0] | 0,03 [0,01—0,05] | 0,0 [0,0—0,1] |
| RBC, ×1012/L | 5,0 [4,7—5,1] | 4,6 [4,5—4,7] | 4,9 [4,5—5,1] |
| PLT, ×109/L | 190 [143—251]*† | 319 [249—364] | 261 [237—311] |
Примечание. * — p<0,05 по сравнению с контролем; † — p<0,05 по сравнению с COVID-19 на 10—14-й день.
В отсутствие тромбоэмболических осложнений у обследованных пациентов не отмечено существенного повышения D-димера, несмотря на среднетяжелое течение заболевания: 0,30 [0,22—0,76] мг/л при поступлении в стационар, 0,30 [0,17—0,90] мг/л на 10—14-й день госпитализации при референтном интервале 0—0,5 мг/л FEU (фибриноген-эквивалентные единицы). Только 20% пациентов имели концентрацию D-димера выше референтного интервала при поступлении и 14% — на 10—14-й сутки. Зависимость уровня D-димера от тяжести течения заболевания отмечена многими авторами [9]. В работе C. Huang и соавт. (2020) указано на значительное увеличение уровня D-димера до 2,4 [0,6—14,4] мг/л против 0,5 [0,3—0,8] мг/л (p=0,004) у больных COVID-19 в тяжелом состоянии по сравнению с пациентами, не требующими перевода в реанимационное отделение [10].
Между тем концентрация СРБ и сывороточный ферритин отчетливо демонстрировали воспалительный ответ. Уровень СРБ при госпитализации составил 46,6 [18,9—85,0] мг/л при референтном интервале 0—5 мг/л, уровень ферритина — 548 [124—798] мг/л при референтном интервале для мужчин 20—250 мг/л и для женщин 10—120 мг/л. В процессе лечения маркеры воспалительного ответа имели положительную динамику и снизились до 17,2 [10,1—38,4] мг/л и 92 [61—478] мг/л соответственно. При этом значения СРБ не достигли верхнего предела референтного интервала ни у одного пациента. Это наблюдение соответствует патофизиологическим представлениям о реакции на воспаление и подтверждает системность такой реакции, в том числе при ярко выраженном иммунном компоненте при COVID-19.
Клеточный ответ в присутствие воспалительных медиаторов проявляется и в активации молекулярных механизмов гемостатических реакций. Количество микровезикул лейкоцитарного, эритроцитарного и тромбоцитарного происхождения существенно выше в крови пациентов с COVID-19 по сравнению с контрольной группой. Заметно отчетливое преобладание микровезикул, несущих на поверхности тромбоцитарный маркер CD41 (табл. 2). Значительное (в 6 раз) возрастание при госпитализации пациентов в остром периоде коронавирусной инфекции продемонстрировали лейкоцитарные микровезикулы, но их количество снизилось через 10—14 дней и не стало более отличаться от такового в контрольной группе. Между тем микровезикуляция тромбоцитов сохранялась на достоверно повышенном уровне, формируя условия для потенциального тромбообразования.
Таблица 2. Количество микрочастиц различного клеточного происхождения в исследуемых группах
| Клеточный маркер (% событий) | COVID-19 День 1-й | COVID-19 День 10—14-й | Контроль |
| CD41+/тромбоциты | 41,7 [35,7—58,4]*† | 16,8 [12,6—25,9]* | 10,1 [7,8—20,9] |
| CD45+/лейкоциты | 12,2 [2,4—14,1]*† | 1,3 [0,7—2,4] | 1,4 [1,1—2,9] |
| CD235a+/эритроциты | 1,0 [0,7—1,4]* | 1,1 [0,5—2,4]* | 0,3 [0,2—0,5] |
| CD146+/эндотелиоциты | 0,3 [0,2—0,3]* | 0,2 [0,1—0,4]* | 0,4 [0,3—1,1] |
Примечание. * — p<0,05 по сравнению с контролем; † — p<0,05 по сравнению с COVID-19 выписка.
Корреляция микровезикул с клетками крови носила избирательный характер. Уровень CD45+ (лейкоцитарных) микровезикул на момент госпитализации коррелировал с количеством лимфоцитов, несмотря на лимфопению — R=0,68 (p<0,008) для CD45+/LY, ×109/L. Это соотносится со сведениями о вовлечении клеток крови в иммунный ответ — характерной для COVID-19 лимфопении и в целом представлением о гемостатических гиперкоагуляционных реакциях как элементах иммунотромбоза.
Несколько неожиданным выглядело сниженное количество микровезикул эндотелиального происхождения у пациентов с COVID-19 по сравнению с контрольной группой, несмотря на то, что повреждение эндотелия характерно для данного заболевания [11]. Нам представляется, что это могло зависеть от нескольких причин: связывания CD146+ элементов с клетками крови (вариант потребления), технологическиих особенностей детекции CD146+, представленных малым количеством событий, небольшой выборки группы, невысокой степени тяжести течения COVID-19. В пользу предположения о связывании с клеточными элементами говорит обратная корреляция между количеством тромбоцитов и микровезикул эндотелиального происхождения: R= –0,85 (p<0,008) для CD146+ и PLT, ×109/L. В литературе существуют указания на аналогичные находки [12]. Этот факт, несомненно, требует дальнейшего изучения.
Представленные в данном исследовании результаты говорят об активации молекулярных механизмов тромообразования (в частности, микровезикуляции) у пациентов, переносящих среднетяжелое течение коронавирусной инфекции. Такая степень тяжести может не характеризоваться тромбоэмболическими осложнениями, но создает все предпосылки к их развитию. Примечательно, что пациенты данной группы в соответствии с Временными рекомендациями Минздрава России могут находиться на амбулаторном лечении. В этом случае необходимо акцентировать внимание лечащих врачей на настоятельной необходимости сохранения антитромботической терапии (прием антиагрегантов или антикоагулянтов) в случае их назначения до COVID-19 по соответствующим показаниям, внеочередной стратификации риска и назначения препаратов при выявленных, но оставшихся без внимания врача (или пациента при низком комплаенсе) обстоятельствах. Госпитализация позволила организовать лабораторное наблюдение и оценку молекулярных механизмов тромбообразования, что трудно сделать на амбулаторном этапе. Исследования, проведенные в 1-е сутки после госпитализации, позволили исключить факт пребывания в стационаре как самостоятельный и дополнительный риск тромбообразования. COVID-19 с поражением легких до 50% в данном исследовании может рассматриваться как самостоятельно влияющий фактор риска тромбозов. Мы выяснили, что даже в отсутствие тромбоэмболических осложнений, но при подтвержденном диагнозе COVID-19 молекулярные механизмы активации гемостатических реакций в полном объеме демонстрируют вовлеченность клеточных элементов, коррелирующую с клинической динамикой процесса. Полученные данные вполне обосновывают использование антикоагулянтной терапии для всех госпитализированных больных, обозначенной во многих клинических рекомендациях [13—16].
Начатая терапия антикоагулянтами в комплексе с этиопатогенетическим лечением оказывает эффект в том числе на механизмы, способные запустить клиническую реализацию гиперкоагуляции.
1. Пациенты со среднетяжелым течением COVID-19, госпитализированные в стационар, имеют высокую активность формирования клеточных микровезикул, что является отражением молекулярных гиперкоагуляционных сдвигов и потенциальным риском развития тромбоэмболических осложнений даже в условиях отсутствия повышения уровня D-димера.
2. Процесс микровезикуляции затрагивает все клеточные элементы периферической крови и коррелирует со степенью тяжести воспалительной реакции.
3. Этиопатогенетическое лечение с включением в протокол антикоагулянтной терапии позволяет снизить продукцию микровезикул, но не нормализует процесс полностью. Потенциальные риски тромбозов сохраняются. Длительность этих реакций и выявление групп пациентов, нуждающихся в продлении приема антикоагулянтов после выписки из стационара, требуют дополнительного изучения.
Исследование выполнено при поддержке РООИ «Здоровье человека» и РФФИ №20-04-00257 и темы Государственного задания
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература / References:
Подтверждение e-mail
На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.
Подтверждение e-mail
Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.
