Молекулярные механизмы активации гемостаза при COVID-19 на госпитальном этапе

Клетки крови не являются стабильными структурами, раз и навсегда сформированными на период жизни в сосудистом русле. Множество морфофункциональных событий происходит с ними с момента выхода в периферическую кровь и до времени элиминации. Многие из этих событий, в частности образование микровезикул, имеют прямое отношение к процессам свертывания крови.

Процессы микровезикуляции давно находятся в поле зрения исследователей. Одним из первых обратил внимание на них выдающийся советский и российский ученый Д.М. Зубаиров. Свои наблюдения и выводы он обобщил в монографии «Микровезикулы в крови. Функции и их роль в тромбообразовании» [1]. Дальнейшие работы отечественных и зарубежных исследователей подтвердили роль микровезикуляции в качестве одного из молекулярных механизмов активации гемостатических реакций и значение в гиперкоагуляции и тромбозе [2—6].

Коронавирусная инфекция, вызвавшая пандемию начиная с 2019 г., тесным образом связана с нарушениями свертывающей системы, активация которой определяет как тяжесть течения заболевания, так и фатальные осложнения. Механизмы COVID-опосредованной коагулопатии продолжают изучаться. Одним из таких молекулярных механизмов являются процессы микровезикуляции клеток (см. рисунок на цв. вклейке) [7]. Отделившиеся микровезикулы (МВ) принимают участие в межклеточной передаче сигнала путем слияния с клеткой-реципиентом, в которую поступает молекулярное содержимое МВ. Одновременно МВ являются активными участниками коагуляционных процессов, формируя значительную по площади дополнительную поверхность для гемостатических реакций и активируя их за счет представительства на мембране, полученной у клетки-донора тканевого фактора, Р-селектина, фактора Виллебранда и массы других активных молекул. Воспалительный ответ, иммунные реакции, непосредственное воздействие вируса, гипоксия тканей при COVID-19 способствуют активному образованию МВ.

Разновидности, биогенез, молекулярный состав и взаимодействия внеклеточных везикул.

Выделены экзосомы, происходящие из эндосомальных структур и являющиеся самыми мелкими образованиями (40—180 нм), эктосомы, также называемые микровезикулами (MB), образуются при почковании плазматической мембраны (100—1000 нм), апоптотические тельца — большие везикулы, происходящие из мембран в процессе апоптоза клеток. Обозначены процессы экзоцитоза, эндоцитоза, слияния (fusion) и рецептор-опосредованного эндоцитоза (по A. Georgescu, M. Simionescu, 2021, в модификации [7]).

Однако выраженность этих процессов в зависимости от степени тяжести течения заболевания и связь с клиническими проявлениями тромбозов остается недостаточно понятной. Все вышесказанное определило цель нашего исследования.

Цель исследования — определение характера и количества микровезикул клеток крови и эндотелия у больных с COVID-19 среднетяжелого течения, госпитализированных в стационар.

В исследование были включены пациенты (средний возраст 58±2 года, 60% мужчин и 40% женщин), госпитализированные в клинику СЗГМУ им. И.И. Мечникова в связи со среднетяжелым течением COVID-19 и поражением легких 2-й степени по данным компьютерной томографии, которые получали стандартную терапию в соответствии с Временными методическими рекомендациями Минздрава России (n=43) [8]. Клинически и с помощью визуализирующих методов обследования ни у одного пациента не обнаружено в ходе госпитализации тромбоэмболических осложнений.

В качестве контрольной группы были выбраны 14 человек (средний возраст 39±4 года, 40% мужчин и 60% женщин) без признаков острой респираторной инфекции на момент исследования, не имеющие обострения хронических заболеваний, не курящие и не принимающие эстрогенсодержащие препараты, без тромбозов и сосудистых событий в анамнезе. Пациенты и лица контрольной группы, включенные в исследование, дали информированное согласие.

Все пациенты были обследованы в соответствии с Временными методическими рекомендациям Минздрава России [8]. Им был выполнен клинический и биохимический анализ крови, исследован уровень D-димера, определялся C-реактивный белок (СРБ) и сывороточный ферритин.

Всем лицам, включенным в исследование, было измерено содержание микровезикул разного клеточного происхождения на проточном цитометре Cytomics FC-500 («Beckman Coulter», США) с помощью набора реагентов Exo-FACS («HansaBioMed Life Sciences», Эстония) и флюоресцентно меченных антител для идентификации микровезикул тромбоцитарного (CD41), лейкоцитарного (CD45), эритроцитарного (CD235a) или эндотелиального (CD146) происхождения. Пробоподготовка и методика измерения описаны нами ранее [4].

Включенные в исследование лабораторные показатели оценивались не менее 2 раз. Для анализа использовали результаты, полученные в 1-й день госпитализации и через 10—14 дней. Полученные результаты подверглись статистической обработке с помощью программного пакета Statistica 10 for Windows («StatSoft, Inc.», США). Количественные характеристики представлены в виде медианы, 25 и 75 перцентиля (Me [Q1—Q3]). Для сравнения двух независимых переменных использовали тест Манна—Уитни, корреляции между показателями определяли по Спирмену. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты клеточного анализа периферической крови представлены в табл. 1. Вполне закономерным для среднетяжелого течения COVID-19 представляются умеренная тромбоцитопения, лимфопения и более низкое, чем в контрольной группе количество эозинофилов. В ходе наблюдения на фоне проводившейся терапии и постепенного улучшения состояния количество лейкоцитов увеличилось и стало статистически отличаться от контрольной группы за счет восстановления количества лимфоцитов, нарастания количества моноцитов и нейтрофилов. Количество эритроцитов не изменилось и не отличалось от контроля как при поступлении, так и во второй точке измерения. Сохранялась тенденция к эозинопении.

Таблица 1. Клеточные элементы периферической крови у пациентов с COVID-19 и в группе контроля

Примечание. * — p<0,05 по сравнению с контролем; † — p<0,05 по сравнению с COVID-19 на 10—14-й день.

В отсутствие тромбоэмболических осложнений у обследованных пациентов не отмечено существенного повышения D-димера, несмотря на среднетяжелое течение заболевания: 0,30 [0,22—0,76] мг/л при поступлении в стационар, 0,30 [0,17—0,90] мг/л на 10—14-й день госпитализации при референтном интервале 0—0,5 мг/л FEU (фибриноген-эквивалентные единицы). Только 20% пациентов имели концентрацию D-димера выше референтного интервала при поступлении и 14% — на 10—14-й сутки. Зависимость уровня D-димера от тяжести течения заболевания отмечена многими авторами [9]. В работе C. Huang и соавт. (2020) указано на значительное увеличение уровня D-димера до 2,4 [0,6—14,4] мг/л против 0,5 [0,3—0,8] мг/л (p=0,004) у больных COVID-19 в тяжелом состоянии по сравнению с пациентами, не требующими перевода в реанимационное отделение [10].

Между тем концентрация СРБ и сывороточный ферритин отчетливо демонстрировали воспалительный ответ. Уровень СРБ при госпитализации составил 46,6 [18,9—85,0] мг/л при референтном интервале 0—5 мг/л, уровень ферритина — 548 [124—798] мг/л при референтном интервале для мужчин 20—250 мг/л и для женщин 10—120 мг/л. В процессе лечения маркеры воспалительного ответа имели положительную динамику и снизились до 17,2 [10,1—38,4] мг/л и 92 [61—478] мг/л соответственно. При этом значения СРБ не достигли верхнего предела референтного интервала ни у одного пациента. Это наблюдение соответствует патофизиологическим представлениям о реакции на воспаление и подтверждает системность такой реакции, в том числе при ярко выраженном иммунном компоненте при COVID-19.

Клеточный ответ в присутствие воспалительных медиаторов проявляется и в активации молекулярных механизмов гемостатических реакций. Количество микровезикул лейкоцитарного, эритроцитарного и тромбоцитарного происхождения существенно выше в крови пациентов с COVID-19 по сравнению с контрольной группой. Заметно отчетливое преобладание микровезикул, несущих на поверхности тромбоцитарный маркер CD41 (табл. 2). Значительное (в 6 раз) возрастание при госпитализации пациентов в остром периоде коронавирусной инфекции продемонстрировали лейкоцитарные микровезикулы, но их количество снизилось через 10—14 дней и не стало более отличаться от такового в контрольной группе. Между тем микровезикуляция тромбоцитов сохранялась на достоверно повышенном уровне, формируя условия для потенциального тромбообразования.

Таблица 2. Количество микрочастиц различного клеточного происхождения в исследуемых группах

Примечание. * — p<0,05 по сравнению с контролем; † — p<0,05 по сравнению с COVID-19 выписка.

Корреляция микровезикул с клетками крови носила избирательный характер. Уровень CD45+ (лейкоцитарных) микровезикул на момент госпитализации коррелировал с количеством лимфоцитов, несмотря на лимфопению — R=0,68 (p<0,008) для CD45+/LY, ×10⁹/L. Это соотносится со сведениями о вовлечении клеток крови в иммунный ответ — характерной для COVID-19 лимфопении и в целом представлением о гемостатических гиперкоагуляционных реакциях как элементах иммунотромбоза.

Несколько неожиданным выглядело сниженное количество микровезикул эндотелиального происхождения у пациентов с COVID-19 по сравнению с контрольной группой, несмотря на то, что повреждение эндотелия характерно для данного заболевания [11]. Нам представляется, что это могло зависеть от нескольких причин: связывания CD146+ элементов с клетками крови (вариант потребления), технологическиих особенностей детекции CD146+, представленных малым количеством событий, небольшой выборки группы, невысокой степени тяжести течения COVID-19. В пользу предположения о связывании с клеточными элементами говорит обратная корреляция между количеством тромбоцитов и микровезикул эндотелиального происхождения: R= –0,85 (p<0,008) для CD146+ и PLT, ×10⁹/L. В литературе существуют указания на аналогичные находки [12]. Этот факт, несомненно, требует дальнейшего изучения.

Представленные в данном исследовании результаты говорят об активации молекулярных механизмов тромообразования (в частности, микровезикуляции) у пациентов, переносящих среднетяжелое течение коронавирусной инфекции. Такая степень тяжести может не характеризоваться тромбоэмболическими осложнениями, но создает все предпосылки к их развитию. Примечательно, что пациенты данной группы в соответствии с Временными рекомендациями Минздрава России могут находиться на амбулаторном лечении. В этом случае необходимо акцентировать внимание лечащих врачей на настоятельной необходимости сохранения антитромботической терапии (прием антиагрегантов или антикоагулянтов) в случае их назначения до COVID-19 по соответствующим показаниям, внеочередной стратификации риска и назначения препаратов при выявленных, но оставшихся без внимания врача (или пациента при низком комплаенсе) обстоятельствах. Госпитализация позволила организовать лабораторное наблюдение и оценку молекулярных механизмов тромбообразования, что трудно сделать на амбулаторном этапе. Исследования, проведенные в 1-е сутки после госпитализации, позволили исключить факт пребывания в стационаре как самостоятельный и дополнительный риск тромбообразования. COVID-19 с поражением легких до 50% в данном исследовании может рассматриваться как самостоятельно влияющий фактор риска тромбозов. Мы выяснили, что даже в отсутствие тромбоэмболических осложнений, но при подтвержденном диагнозе COVID-19 молекулярные механизмы активации гемостатических реакций в полном объеме демонстрируют вовлеченность клеточных элементов, коррелирующую с клинической динамикой процесса. Полученные данные вполне обосновывают использование антикоагулянтной терапии для всех госпитализированных больных, обозначенной во многих клинических рекомендациях [13—16].

Начатая терапия антикоагулянтами в комплексе с этиопатогенетическим лечением оказывает эффект в том числе на механизмы, способные запустить клиническую реализацию гиперкоагуляции.

1. Пациенты со среднетяжелым течением COVID-19, госпитализированные в стационар, имеют высокую активность формирования клеточных микровезикул, что является отражением молекулярных гиперкоагуляционных сдвигов и потенциальным риском развития тромбоэмболических осложнений даже в условиях отсутствия повышения уровня D-димера.

2. Процесс микровезикуляции затрагивает все клеточные элементы периферической крови и коррелирует со степенью тяжести воспалительной реакции.

3. Этиопатогенетическое лечение с включением в протокол антикоагулянтной терапии позволяет снизить продукцию микровезикул, но не нормализует процесс полностью. Потенциальные риски тромбозов сохраняются. Длительность этих реакций и выявление групп пациентов, нуждающихся в продлении приема антикоагулянтов после выписки из стационара, требуют дополнительного изучения.

Исследование выполнено при поддержке РООИ «Здоровье человека» и РФФИ №20-04-00257 и темы Государственного задания

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.