Введение

Основная тяжесть заболевания COVID-19 обусловлена синдромом системного гипервоспалительного ответа, который в итоге приводит к тяжелой пневмонии, острому респираторному дистресс-синдрому, воспалению сосудистой системы и часто является причиной смерти. Иммунный ответ, индуцированный SARS-CoV-2, напоминает другие синдромы системного воспалительного ответа, характеризующиеся активацией CD4- или CD8-положительных T-клеток, NK-клеток и моноцитов и секрецией соответствующих цито- и хемокинов [1].

Большинство цитокин-индуцированных воспалительных реакций опосредуется рецептор-ассоциированными ферментами — янус-киназами (JAK). Семейство JAK состоит из четырех ферментов (JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2), которые имеют различные паттерны ассоциации с рецепторами и по-разному активируют последующие ферменты-посредники, такие как STAT, MAPK и ферменты пути протеинкиназы B (PI3K/AKT) [2]. Хорошо известно, что лимфоцитопения, нейтрофилия и высокое соотношение нейтрофилов к лимфоцитам являются признаками плохого прогноза заболевания [3]. При тяжелом течении инфекции абсолютное количество субпопуляций CD4+ и CD8+ T-клеток значительно сокращается, но в то же время наблюдается значительное относительное увеличение провоспалительной субпопуляции лимфоцитов — Th17 [4]. Данные факты явились основанием для использования в терапии ингибиторов JAK2 — руксолитиниба и барицитиниба с целью ограничения избыточной провоспалительной функции клеток Th17. Недавно проведенный метаанализ продемонстрировал, что эти препараты уменьшали использование инвазивной механической вентиляции легких и выраженность острого респираторного дистресс-синдрома. Снижался также и риск смерти пациентов [5]. Вместе с тем, учитывая риски неблагоприятного влияния избыточного снижения активности JAK, ведущего к диссеминации и усугублению инфекционного процесса, решение о назначении ингибиторов JAK должно приниматься только при наличии соответствующих критериев по шкале воспаления COVID-19 [6—9].

Исходя из представления о соответствии количества экспрессируемых в клетках молекул протеина JAK2 и уровня экспрессии мРНК гена JAK2, ранее было предложено использовать в качестве маркера, связанного с активностью этого фермента, уровень мРНК JAK2 в циркулирующих клетках крови [10]. Вместе с тем до сих пор не известны данные об уровне мРНК JAK2 в крови пациентов с COVID-19. Кроме того, недавно сообщалось, что клональные аберрации в кроветворных клетках (наиболее часто с мутацией V617F JAK2) ассоциированы с воспалением в сердечно-сосудистой системе и сердечно-сосудистыми заболеваниями [11]. Исходя из этого, можно было бы предположить связь более частых клональных аберраций у пожилых пациентов с известным возрастным усилением воспалительной реакции, вызванной SARS-CoV-2. Распространенность клонального гемопоэза неопределенного потенциала с мутацией V617F JAK2 среди пациентов с COVID-19 также ранее не изучалась.

Цель исследования — определение мутации V617F и оценка уровня экспрессии мРНК гена JAK2 в венозной крови у пациентов с инфекцией COVID-19.

Материал и методы

В исследование включены анонимные пробы крови 61 пациента (медиана возраста 56 лет, 29 мужчин и 39 женщин) с подтвержденной инфекцией COVID-19, госпитализированного в ковидный госпиталь КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница скорой медицинской помощи им. Н.С. Карповича». Определение степени тяжести заболевания и используемые терапевтические подходы выполняли в соответствии с актуальными версиями временных методических рекомендаций Минздрава России «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)».

Пробы венозной крови забирали в первые 10 дней со дня госпитализации (до 14—20-го дня после появления клинических симптомов) и сразу помещали в вакутейнеры с РНК/ДНК стабилизатором (ООО «Формула гена», Россия). Группой контроля служили пробы венозной крови 39 здоровых добровольцев с нормальными значениями гемограммы (медиана возраста 43 года, 28 женщин и 11 мужчин). Выделение РНК осуществляли с использованием набора реагентов Рибо-золь-D (ФБУН «ЦНИИЭ», Россия), обратную транскрипцию — с использованием набора реагентов Реверта-L (ФБУН «ЦНИИЭ», Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Определение мутации V617F JAK2 и уровня экспрессии мРНК JAK2 осуществляли с использованием амплификатора CFX96 («Bio-Rad», США) и реагентов (ООО «Формула гена», Россия) для ПЦР-РВ. Расчет относительной экспрессии мРНК гена JAK2 проводили по методу ∆Ct. В качестве гена «домашнего хозяйства» использовали ABL1. Пороговые циклы ПЦР-РВ ABL1 не отличались между группами пациентов и доноров (Me C₂₅—C₇₅): пациенты 23,9 (22,9—25,0); контроль 23,3 (22,9—23,8)).

Статистическую оценку полученных результатов проводили с использованием пакета R и непараметрического критерия Манна—Уитни.

Результаты

Общая характеристика включенных в исследование пациентов представлена в таблице. Летальный исход наблюдался у 5 пациентов с тяжелым течением заболевания. Данные гематологического анализа, выполненного в день взятия пробы для генетического тестирования, полностью соответствуют степени тяжести заболевания.

Характеристика пациентов, включенных в исследование, медиана (C₂₅—C₇₅)

В нашей выборке пациентов ни в одном случае не было обнаружено мутации V617F в гене JAK2.

На рисунке представлен уровень экспрессии мРНК JAK2 в пробах венозной крови пациентов с разными вариантами тяжести течения инфекции. В целом значения экспрессии мРНК JAK2 у пациентов с COVID-19 характеризуются значительно более широким диапазоном вариации (мин=0,01; макс=3,8; C_v=129%) по сравнению со значениями в контрольной группе (мин=0,18; макс=6,1; C_v=72%). У пациентов с диагнозом COVID-19 наблюдалось значимое снижение уровня мРНК JAK2, более выраженное при средних и тяжелых вариантах течения заболевания. Уровень мРНК JAK2 у пациентов с последующим летальным исходом на момент выполнения исследования не отличался от значений показателя в группе пациентов с тяжелым течением инфекции.

Уровень экспрессии мРНК JAK2 у пациентов с COVID-19 разной степени тяжести и у здоровых добровольцев.

Обсуждение

Инфекция COVID-19 имеет различные патогенетические аспекты, объединяющие ее с миелопролиферативными новообразованиями, острой реакцией трансплантат против хозяина и гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом. Как и в перечисленных случаях, вызванное вирусом SARS-CoV-2 повреждение тканей приводит к увеличению высвобождения провоспалительных цитокинов, что в свою очередь ведет к увеличению количества активных Th17 лимфоцитов, макрофагов, миграции иммунных клеток в поврежденные ткани с последующим развитием фиброза. Передача сигналов с рецепторов цитокинов через JAK представляет собой молекулярный узел, связывающий все эти события, что делает ингибиторы JAK подходящими для ограничения вредных эффектов воспалительного ответа [12].

Исторически одним из первых показаний для назначения ингибитора JAK руксолитиниба явилось наиболее злокачественное проявление Ph-негативных миелопролиферативных новообразований — первичный миелофиброз, который наиболее часто ассоциирован с соматической мутацией V617F в гене JAK2. В связи с этим представляло интерес оценить роль данной мутации при COVID-19, учитывая ее участие в возраст-ассоциированном развитии синдрома клонального гемопоэза неопределенного потенциала. Ранее мы показали, что распространенность этого синдрома среди пациентов негематологического профиля данной возрастной группы составляет около 2%. В нашей выборке пациентов с COVID-19 мы не выявили ни одного пациента с данной мутацией, что свидетельствует об отсутствии явной ассоциации мутации V617F JAK2 с фактом госпитализации при COVID-19. Вместе с тем вопрос особенностей протекания данной инфекции у пациентов с синдромом клонального гемопоэза неопределенного потенциала остается открытым, поскольку для получения ответа необходима оценка клинических проявлений инфекции в выборке носителей незлокачественного клонального гемопоэза.

Принимая во внимание, что только у 14% пациентов с COVID-19 развиваются симптомы, требующие госпитализации и кислородной поддержки, и что около 5% нуждаются в госпитализации в отделение интенсивной терапии, следует использовать строгие критерии отбора для выявления пациентов с гипервоспалением, которым может помочь ингибитор JAK2. Эти маркеры должны включать пожилой возраст, высокий показатель по шкале полиорганной недостаточности SOFA, значения D-димера >1 мкг/л, а также повышение значений ферритина и IL-6 [12]. При этом отсутствие критерия прямой оценки активности фермента-мишени не позволяет однозначно связывать динамику указанных выше лабораторных показателей с достижением оптимального уровня ингибирования янус-киназ и проведением оперативного мониторинга эффективности препаратов-ингибиторов.

Учитывая возможность использования тестов количественного определения мРНК JAK2 в циркулирующих клетках крови как маркера количества фермента и его относительной активности [10], в настоящей работе мы предприняли попытку оценить уровень экспрессии мРНК JAK2 при различных по тяжести вариантах протекания инфекции COVID-19. Более высокая степень вариации полученных значений у пациентов с COVID-19, очевидно, отражает разную выраженность индивидуального характера протекания воспалительных реакций и ответа на используемую терапию, а также зависимость от разных этапов развития инфекционного процесса. Вместе с тем, оценивая значения полученных результатов, можно заключить о наличии в целом статистически значимого снижения экспрессии мРНК JAK2 у пациентов в сравнении с группой контроля. Следует согласиться, что снижение уровня синтеза JAK2 при COVID-19 может способствовать менее выраженному «цитокиновому шторму», а его чрезмерное ингибирование, наоборот, приводит к генерализации инфекционного процесса, присоединению бактериальной и грибковой флоры. Недавнее исследование с использованием микрочипов и биоинформационного анализа [13] также подтверждает вовлечение мРНК JAK2 в числе десяти ключевых генов в патогенез COVID-19.

В целом полученные результаты позволяют предположить возможность использования оценки уровня мРНК JAK2 в качестве маркера для назначения ингибиторов JAK и мониторинга их эффективности. Ограничения данного вывода связаны с отсутствием оценки динамики показателя при использовании ингибиторов JAK в выбранной группе пациентов в связи с их отсутствием в перечне допущенных для применения при COVID-19 препаратов на момент проведения данного исследования. Включение теста на мРНК JAK2 в протокол клинического исследования ингибиторов янус-киназ при COVID-19 позволит в дальнейшем получить необходимые доказательства полезности нашего предложения.

Заключение

Среди госпитализированных пациентов с COVID-19 не было выявлено лиц с соматической мутацией V617F JAK2. Высокая вариация и сниженные медианные значения уровня экспрессии мРНК гена JAK2 при инфекции COVID-19 свидетельствуют об участии JAK2-сигнального пути в патогенезе и могут служить предметом дальнейших исследований, в том числе для оценки значимости теста в качестве показания для назначения и оценки эффективности ингибиторов янус-киназ.

Авторы подтверждают, что статья или ее части ранее не были опубликованы.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.